Nauka trasy przy niskim poziomie stresu z wykorzystaniem labiryntu Lashley III u myszy

Podsumowanie

Labirynt Lashley III to zadanie polegające na nauce trasy, które nie opiera się na bodźcach awersyjnych ani wskazówkach wizualnych. Stanowi on zatem bardzo atrakcyjną opcję do oceny uczenia się i pamięci, zwłaszcza u starszych myszy lub w sytuacjach, w których istotnym czynnikiem jest stres.

Streszczenie

Wiele testów behawioralnych zaprojektowanych w celu oceny uczenia się i pamięci u gryzoni, w szczególności u myszy, opiera się na wskazówkach wizualnych, deprywacji pokarmowej i/lub wodnej lub innych bodźcach awersyjnych, aby zmotywować zwierzęta do opanowania zadania. Wraz z wiekiem zwierząt ich modalności sensoryczne ulegają pogorszeniu. Na przykład wiele szczepów myszy wykazuje deficyty słuchu lub zaćmę. Zmiany w systemach sensorycznych niezbędnych do prowadzenia myszy podczas nauki zadania stanowią potencjalne czynniki zakłócające interpretację zmian w procesach uczenia się u starzejących się zwierząt. Co więcej, stosowanie bodźców awersyjnych w celu zmotywowania zwierząt do nauki zadań może wprowadzać błędy przy porównywaniu myszy o różnej wrażliwości na stres. Aby zminimalizować tego typu efekty zakłócające, wdrożyliśmy zmodyfikowaną wersję labiryntu Lashley III. Labirynt ten opiera się na uczeniu się trasy, w którym myszy uczą się nawigować w labiryncie poprzez wielokrotną ekspozycję w warunkach niskiego stresu, np. w fazie ciemnej, bez deprywacji pokarmowej/wodnej, aż do momentu pokonania ścieżki z punktu startowego do pseudo-klatki domowej z 0 lub 1 błędem w dwóch kolejnych próbach. Klasyfikujemy to jako test behawioralny o niskim poziomie stresu, ponieważ nie opiera się on na bodźcach awersyjnych w celu zachęcenia do eksploracji labiryntu i nauki zadania. Aparatura składa się z modułowej skrzynki startowej, korpusu labiryntu z 4 ramionami oraz skrzynki z celem. Na końcu skrzynki z celem znajduje się pseudo-klatka domowa, która zawiera ściółkę podobną do tej znajdującej się w klatce domowej zwierzęcia i jest przypisana do każdego zwierzęcia na czas testów w labiryncie. Wykazano wcześniej, że ta pseudo-klatka domowa zapewnia wystarczającą nagrodę, aby zmotywować myszy do nauki nawigacji w labiryncie.¹W niniejszym materiale przedstawiamy wizualizację procedury labiryntu Lashleya III w kontekście oceny różnic związanych z wiekiem w uczeniu się i pamięci u myszy, wraz z porównaniem zachowań uczenia się u dwóch różnych szczepów tła genetycznego myszy. Mamy nadzieję, że inni badacze zainteresowani oceną efektów starzenia się lub podatności na stres u myszy uznają ten labirynt za atrakcyjną alternatywę dla testów behawioralnych obejmujących bardziej stresujące zadania uczenia się i/lub wskazówki wizualne.

Protokół

1. Przygotowanie:

1. Labirynt Lashley III jest wykonany z pleksiglasu i przedstawiony jest na Rysunku 1. Pole startowe, ramiona labiryntu oraz pole celu są modułowe, co umożliwia czyszczenie i modyfikację labiryntu. Ściany pola startowego, ramion labiryntu i pola celu wykonane są z czarnego pleksiglasu, aby wyeliminować wskazówki wizualne z zewnątrz i z wnętrza labiryntu. Ramiona labiryntu mają 45 cm długości, 7 cm wysokości i 5 cm szerokości. Drzwiczki prowadzące do kolejnych ramion labiryntu mają wymiary 4 cm x 4 cm i znajdują się 11 cm od zewnętrznych ścian labiryntu. Pole celu ma wymiary 19,5 cm długości x 7 cm wysokości x 5 cm szerokości. Pole startowe ma wymiary 8 cm x 9,5 cm x 7 cm. Na górze pola startowego, labiryntu i pola celu umieszczone są oddzielne przezroczyste elementy z pleksiglasu, aby umożliwić obserwację każdej myszy podczas przechodzenia przez labirynt, jednocześnie zapobiegając ich ucieczce. Labirynt spoczywa na podstawie wykonanej z czerwonego pleksiglasu, która jest wystarczająco duża, aby pomieścić trzy części labiryntu oraz pseudo-klatkę domową o rozmiarze identycznym jak standardowa klatka domowa zwierzęcia.
2. Aby przygotować pseudo-klatki domowe przed pierwszą próbą w labiryncie, do oddzielnych podstaw klatek, w których bokach wycięto otwory wejściowe (2 cm x 2 cm), dodaje się świeży materiał ściółkowy tego samego rodzaju, który jest stosowany w klatkach domowych zwierząt. Na podstawach klatek należy umieścić druciane góry i ponumerować je indywidualnie, po jednej dla każdego zwierzęcia w kohorcie testowej. Klatki te będą służyć jako indywidualne pseudo-klatki domowe dla każdego zwierzęcia przez cały czas trwania testów. Ponieważ badamy rolę stresu i/lub zachowań związanych z lękiem w uczeniu się i pamięci, stosujemy pseudo-klatki domowe, aby uniknąć indywidualnego trzymania myszy w ich klatkach domowych. Jeśli jednak czynniki te nie są kwestią nadrzędną, zwierzęta można trzymać pojedynczo w klatkach domowych zmodyfikowanych o otwory wejściowe, a klatki te mogą służyć jako klatki domowe w przypadku pomyślnej nawigacji w labiryncie.

2. Testowanie:

1. Każdego dnia zwierzęta są przenoszone do pomieszczenia do testów behawioralnych co najmniej na godzinę przed rozpoczęciem testów, aby mogły zaaklimatyzować się do środowiska badawczego.
2. Na 30 min przed rozpoczęciem testów z wszystkich klatek domowych usuwa się pokarm i wodę. Pokarm i wodę należy pozostawić w pomieszczeniu do testów behawioralnych, ale poza zasięgiem myszy. Pokarm i wodę zazwyczaj usuwa się 30 min po przejściu z fazy jasnej do fazy ciemnej, po wystąpieniu szczytu żerowania. Zapewnia to, że zwierzęta są w większości syte i nawodnione przed testem; jednak testowanie w tym okresie zapewnia niewielką dodatkową siłę motywacyjną do pokonywania labiryntu, mimo braku bezpośredniej nagrody w postaci pokarmu lub wody po wykonaniu zadania.
3. Po upływie 30-minutowego okresu przedtestowego należy oczyścić labirynt 70% etanolem. Drzwi prowadzące z boksu startowego do ramion labiryntu należy pozostawić zamknięte. Drzwi na obu końcach boksu docelowego pozostawia się otwarte.
4. Umieść pseudo-klatkę domową przypisaną do pierwszego zwierzęcia na końcu boksu docelowego.
5. Przenieś pierwszą mysz do labiryntu, trzymając ją w zagłębieniu dłoni. Umieść mysz w boksie startowym i zamknij pokrywę.
6. Znajdując się w pozycji umożliwiającej niezakłóconą obserwację labiryntu, otwórz drzwi boksu startowego i natychmiast uruchom trzy stopery.
7. Gdy wszystkie cztery łapy myszy opuszczą boks startowy, zamknij drzwi boksu startowego i zatrzymaj pierwszy stoper.
8. Ręcznie zapisuj ścieżkę, którą porusza się mysz podczas nawigowania po labiryncie. Mysz wchodzi do nowej strefy lub ramienia labiryntu, gdy wszystkie cztery łapy przekroczą granicę tego obszaru (patrz Rys. 1).
9. Gdy wszystkie cztery łapy wejdą do boksu docelowego, zamknij drzwi prowadzące między labiryntem a boksem docelowym i zatrzymaj drugi stoper.
10. Gdy mysz całkowicie wejdzie do pseudo-klatki domowej, zamknij drzwi między boksem docelowym a klatką. Zatrzymaj trzeci stoper.
11. Zapisz czasy z trzech stoperów. Policz liczbę błędów popełnionych przez mysz. Błąd definiuje się jako wejście do strefy ślepego zaułka (np. przejście z ramienia L do strefy K; Rys. 1) lub powrót przez już pokonane ramię labiryntu (np. przejście z ramienia F do ramienia C; Rys. 1). Choć oceniając wyniki myszy w czasie rzeczywistym, możliwe jest nagrywanie prób w labiryncie, co pozwala na późniejszą ocenę wizualną lub za pomocą oprogramowania automatycznego. Wybór odpowiedniej metody pozostaje do uznania eksperymentatora.
12. Pozostaw zwierzę w pseudo-klatce domowej na 1 min przed powrotem do jego właściwej klatki domowej.
13. Powtórz kroki od 2.3 do 2.12 dla wszystkich myszy w kohorcie testowej.
14. Gdy ostatnia mysz z kohorty zostanie zwrócona do swojej klatki domowej, uruchom 30-minutowy timer. Po upływie tych 30 min przywróć pokarm i wodę wszystkim myszom w kohorcie, a następnie przenieś zwierzęta z powrotem do pomieszczenia hodowlanego.
15. Powtarzaj tę procedurę przez kolejne noce, wykonując jedną próbę na zwierzę w dniu testu, aż wszystkie myszy w kohorcie osiągną zdefiniowane kryterium uczenia się lub do momentu wykonania określonej liczby prób testowych. Mysz uznaje się za nauczoną labiryntu, gdy jest w stanie wykonać zadanie z 0 lub 1 błędem w dwóch kolejnych próbach. Myszy są testowane w tej samej kolejności w kolejnych próbach.

3. Reprezentatywne wyniki:

Liczbę dni potrzebnych na naukę (osiągnięcie kryterium) można analizować i porównywać między różnymi grupami w danej badaniu (Ryc. 2A i 3A). Dodatkowo można ocenić indeks uczenia się (stosunek uczenia się), który charakteryzuje nabywanie umiejętności poruszania się w labiryncie, w ciągu pierwszych czterech dni okresu testowego (Ryc. 2B i 3B). Indeks uczenia się to stosunek liczby prawidłowo przebytych odcinków ścieżki do całkowitej liczby przebytych odcinków ścieżki w każdej próbie. Średni indeks uczenia się powinien wynosić około 0,5 w pierwszej próbie, gdy myszy po raz pierwszy są wystawione na działanie labiryntu i poruszają się w nim przypadkowo. Indeks uczenia się rośnie i zbliża się do 1 między drugą a czwartą próbą, co wskazuje na zachodzenie procesu uczenia się. Na Ryc. 2 młode (2 mies.) i starzejące się (24 mies.) samce myszy C57Bl/6NCr były trenowane w labiryncie Lashleya przez maksymalnie 15 prób. Młode myszy nauczyły się labiryntu w 7,2 (± 1,5) d. W przeciwieństwie do nich, zwierzęta starsze potrzebowały 11,7 (± 2,1) d, aby osiągnąć kryterium. Zaobserwowano silną tendencję do dłuższego czasu nauki labiryntu u starszych myszy C57Bl/6NCr ([t(23)=1,59, P=0,056]; jednostronny test t, hipoteza a priori, że liczba dni nauki jest dłuższa u starszych myszy). Po obliczeniu indeksu uczenia się w obu grupach wiekowych widoczny jest stały wzrost indeksu od drugiej do czwartej próby (istotny główny efekt czasu P<0,001). Jednak nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w indeksie uczenia się między młodymi a starymi myszami C57 (główny efekt wieku P=0,58).

Rysunek 3 jest reprezentatywny dla badań nad wpływem szczepu tła na zachowanie podczas uczenia się. Dane pochodzące od młodych samców C57Bl/6NCr przedstawione na Rys. 2 są teraz porównane z danymi od młodych myszy Crl:CD-1(ICR)BR [CD-1, 4-5 mo]. Myszy CD-1 nauczyły się labiryntu Lashley III w 4,5 (± 1,4) d; nie stwierdzono jednak istotnej różnicy między szczepami w liczbie dni potrzebnych do nauki (Rys. 3A; [t(18)=1,328, P=0,20]; dwustronny test t). Z kolei analiza wskaźnika uczenia się pokazuje, że choć wszystkie zwierzęta w pierwszej próbie nawigowały po labiryncie przypadkowo, myszy CD-1 szybciej opanowały zadanie (główny efekt szczepu P<0,001). Ilustruje to statystycznie istotny wzrost wskaźnika uczenia się w próbach od 2 do 4 u myszy CD-1 w porównaniu z myszami C57Bl/6NCr. Co ciekawe, jeśli myszy CD-1 są nadal trenowane w labiryncie po osiągnięciu kryterium, wykazują zachowanie wskazujące na nadmierne trenowanie (Rys. 4), co zostanie omówione bardziej szczegółowo poniżej.

Rysunek 1: Labirynt Lashley III. Ślepe zaułki labiryntu są na tym schemacie zaznaczone kolorem czerwonym wyłącznie w celach ilustracyjnych. Podstawa i ramiona rzeczywistego labiryntu mają jednolite kolory (wstawka). Labirynt jest narysowany w odpowiedniej skali (wymiary podano w tekście).

Rysunek 2: Wyniki w labiryncie Lashleya III u 2- i 24-miesięcznych samców myszy C57Bl/6NCr.Labirynt Lashleya III został wykorzystany do oceny uczenia się trasy u młodych (2 m-ce) i starzejących się (24 m-ce) samców myszy C57Bl/6NCr. Mierzone parametry to (a) liczba dni do osiągnięcia kryterium, czyli liczba dni wymagana, aby mysz pokonała labirynt przez dwie kolejne noce z 0 lub 1 błędem; oraz (b) indeks uczenia się, czyli liczba prawidłowych wejść czterema łapami do ramion w stosunku do całkowitej liczby wejść do ramion w dniach 1–4 testowania w labiryncie Lashleya III. Liczba zwierząt w grupie wynosiła n=10 dla myszy 2-miesięcznych i n=15 dla myszy 24-miesięcznych.

Rysunek 3: Wyniki w labiryncie Lashley III u młodych samców myszy C57Bl/6NCr i CD-1. Labirynt Lashley III został wykorzystany do oceny uczenia się trasy u 2-miesięcznych myszy C57Bl/6NCr oraz 4-5 miesięcznych myszy CD-1. Mierzone parametry to (a) liczba dni do osiągnięcia kryterium, czyli liczba dni wymaganych, aby mysz pokonała labirynt przez dwie kolejne noce z 0 błędami lub 1 błędem; oraz (b) indeks uczenia się, czyli liczba prawidłowych wejść czterema łapami do ramion w stosunku do całkowitej liczby wejść do ramion w dniach 1-4 testowania w labiryncie Lashley III. Liczba zwierząt w grupie wynosiła n=10 dla myszy C57Bl/6NCr i n=10 dla myszy CD-1. Istotność statystyczna: *P<0.05, **P<0.01 w stosunku do myszy C57Bl/6NCr.

Rysunek 4: Wyniki w labiryncie Lashleya III u 4-5 miesięcznych samców myszy CD-1. Do oceny uczenia się tras u dziesięciu 4–5-miesięcznych samców myszy CD-1 przez 15 kolejnych dni wykorzystano labirynt Lashley III. Mierzone parametry obejmowały (a) liczba błędów popełnianych każdego dnia, gdzie za błąd uznano wejście wszystkimi czterema łapami do ślepego zaułka lub przejście przez ramiono labiryntu, przez które zwierzę już wcześniej przeszło; oraz (b) czas spędzony w labiryncie na dobę. Dzień, w którym osiągnięto kryterium, został zaznaczony czerwoną strzałką.

Dyskusja

Najczęściej stosowanymi testami behawioralnymi u gryzoni do oceny uczenia się i pamięci są wodny labirynt Morrisa oraz warianty warunkowania lękowego². Testy te opierają się na wskazówkach wizualnych lub słuchowych w procesie uczenia się oraz na bodźcach awersyjnych (np. wodzie, wstrząsach stóp), aby zmotywować zwierzęta do wykonania zadań³. U starzejących się gryzoni, podobnie jak u starzejących się ludzi, funkcje sensoryczne ulegają z czasem pogorszeniu. Kilka szczepów myszy traci słuch lub rozwij...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Labirynt Lashleya III	Warsztat Fizyczny PSU	N/A	Labirynt musi zostać zbudowany na zamówienie, nie jest dostępny w sprzedaży