Badanie basenów pęcherzyków synaptycznych za pomocą fotokonwersji barwników styrylowych

Podsumowanie

Barwniki FM były nieocenioną pomocą w zrozumieniu dynamiki synaptycznej. FM są zwykle obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym podczas różnych warunków stymulacji. Jednak fotokonwersja barwników FM w połączeniu z mikroskopią elektronową pozwala na wizualizację odrębnych pul pęcherzyków synaptycznych, wśród innych składników ultrastrukturalnych, w bontonach synaptycznych.

Streszczenie

Fuzja pęcherzyków synaptycznych z błoną plazmatyczną (egzocytoza) jest niezbędnym krokiem w uwalnianiu neuroprzekaźników i komunikacji neuronalnej. Pęcherzyki są następnie pobierane z błony plazmatycznej (endocytoza) i grupowane razem z ogólną pulą pęcherzyków w zakończeniu nerwowym, aż przejdą nowy cykl egzo- i endocytozy (recykling pęcherzyków). Procesy te badano przy użyciu różnych technik, takich jak mikroskopia elektronowa, zapisy elektrofizjologiczne, amperometria i pomiary pojemności. Co ważne, w ciągu ostatnich dwóch dekad pojawiło się wiele markerów znakowanych fluorescencyjnie, co pozwoliło technikom optycznym śledzić dynamikę recyklingu pęcherzyków. Jednym z najczęściej stosowanych markerów jest styryl lub barwnik FM ¹; strukturalnie wszystkie barwniki FM zawierają hydrofilową głowę i lipofilowy ogon połączone pierścieniem aromatycznym i jednym lub więcej podwójnych wiązań (ryc. 1B). Klasyczny eksperyment z barwnikiem FM w celu oznaczenia puli pęcherzyków polega na kąpieli preparatu (ryc. 1Ai) z barwnikiem podczas stymulacji nerwu (elektrycznie lub z wysokim K⁺). Indukuje to recykling pęcherzyków, a następnie ładowanie barwnika do niedawno endocytozowanych pęcherzyków (ryc. 1A_i-iii). Po załadowaniu pęcherzyków barwnikiem, druga runda stymulacji w kąpieli bez barwnika wywołałaby uwalnianie FM poprzez egzocytozę (ryc. 1A_iv-v), proces, który można śledzić, monitorując spadek intensywności fluorescencji (odbarwienie).

Chociaż barwniki FM znacznie przyczyniły się do recyklingu pęcherzyków, nie jest możliwe określenie dokładnej lokalizacji lub morfologii poszczególnych pęcherzyków za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Z tego powodu wyjaśniamy tutaj, w jaki sposób barwniki FM mogą być również wykorzystywane jako markery endocytarne za pomocą mikroskopii elektronowej, poprzez fotokonwersję. Technika fotokonwersji wykorzystuje właściwości barwników fluorescencyjnych do generowania reaktywnych form tlenu w intensywnym oświetleniu. Preparaty znakowane fluorescencyjnie zanurza się w roztworze zawierającym diaminobenzydynę (DAB) i oświetla. Formy reaktywne wytwarzane przez cząsteczki barwnika utleniają DAB, który tworzy stabilny, nierozpuszczalny osad, który ma ciemny wygląd i można go łatwo odróżnić w mikroskopii elektronowej ^2,3. Ponieważ DAB jest utleniany tylko w bezpośrednim sąsiedztwie cząsteczek fluorescencyjnych (ponieważ reaktywne formy tlenu są krótkotrwałe), technika ta zapewnia, że tylko fluorescencyjnie znakowane struktury będą zawierały osad o dużej gęstości elektronów. Technika ta pozwala zatem na zbadanie dokładnej lokalizacji i morfologii organelli aktywnie poddanych recyklingowi.

Protokół

1) Przygotowanie neuronalnego połączenia mięśniowego Drosophila melanogaster (NMJ)

1. Przygotuj standardowy sól fizjologiczną Drosophila (130 mM NaCl, 36 mM sacharozy, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 5 mM Hepes, pH 7,3 ⁴.
2. Rozdzielić preparat w roztworze soli fizjologicznej (1.1). Larwy Drosophila są przypięte grzbietową stroną do góry w naczyniu Sylgarda; Strona grzbietowa jest przecięta podłużnie, a narządy wewnętrzne są usuwane. Preparat jest następnie rozciągany i napinany. Można wtedy użyć kilku mięśni brzusznych.

2) Stymulacja i barwienie FM

1. Zaleca się wykonanie wszystkich poniższych czynności w warunkach słabego oświetlenia, aby chronić barwniki FM przed bieleniem.
2. Do chemicznej stymulacji nerwów stosuje się bufor o wysokiej zawartości potasu. Przygotować sól fizjologiczną Drosophila (patrz 1.1) zawierającą 90 mM KCl i 10 μM barwnika FM1-43. Roztwór należy chronić przed światłem.
3. Kąpać preparat z wcześniej przygotowanym buforem przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
4. Przemyć standardową solą fizjologiczną Drosophila (1.1) w celu usunięcia zewnątrzkomórkowego barwnika FM1-43. Przejdź szybko do utrwalenia.

3) Naprawianie

1. Kąpać preparat z 2,5% aldehydem glutarowym w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Aby dobrze zachować cechy morfologiczne, aldehyd glutarowy jest preferowany zamiast paraformaldehydu.
2. Przemyć raz PBS, a następnie pozostawić preparat zanurzony na 15 minut w 100 mM NH₄Cl. Ten krok jest wykonywany w celu wygaszenia wolnych grup aldehydowych pozostałego utrwalacza aldehydu glutarowego.
3. Wypłukać roztwór NH₄Cl zwykłym PBS.

4) Fotokonwersja

1. Inkubować preparat NMJ przez 30 minut w temperaturze 4°C w PBS zawierającym 1,5 mg ml-1 diaminobenzydyny (DAB).
2. Umieścić próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Znajdź i ustaw ostrość sygnału fluorescencyjnego za pomocą obiektywu zanurzeniowego w wodzie o stosunkowo małym powiększeniu (20x 0,5 NA).
3. Oświetlać próbkę z maksymalną intensywnością lampy, aż barwnik FM zostanie całkowicie wybielony (rysunek 1C). Aby sprawdzić, czy nastąpiła fotokonwersja, zaleca się sprawdzenie próbki w świetle transmisyjnym przed i po etapie wybielania barwnikiem FM. Jeśli zachodzi fotokonwersja, spodziewany jest ciemnobrązowy osad (ryc. 1C). Czas świecenia jest zmienny, w zależności od siły oświetlenia, a także od penetracji DAB w preparacie. W przypadku większości preparatów stwierdziliśmy, że czas oświetlenia wynoszący ~30-45 minut jest optymalny przy użyciu obiektywu 20x. W przypadku obiektywów o większym powiększeniu stosuje się krótsze okresy świecenia (60x).
4. Do oświetlenia wolimy używać lampy rtęciowej, z obudową lampy zawierającą tylne lustro, które zbiera rozproszone wstecznie wiązki światła, a tym samym zwiększa całkowite natężenie.

5) Przetwarzanie próbki dla EM

1. Osmikacja
   1. Przygotować roztwór z jedną objętością tetratlenku osmu w objętości wody drzewa (ok. 300 μl na próbkę). Prace z użyciem tetratlenku osmu należy wykonywać pod maską, przy użyciu rękawic i sprzętu ochronnego.
   2. Preparat inkubować w roztworze tetratlenku osmu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (pod maską).
   3. Dokładnie przemyć PBS (4-5 razy 5 minut) i przenieść każdą próbkę do czystej szklanej kolby.
2. odwodnienie
   1. Przygotować oddzielne roztwory zawierające 30, 50, 70, 90, 95 i 100% etanolu.
   2. Dodawać 1 ml 30% etanolu do każdej próbki przez 5 minut.
   3. Dodawać 1 ml 50% etanolu do każdej próbki przez 5 minut.
   4. Dodawać 1 ml 70% etanolu do każdej próbki przez 5 minut.
   5. Dodawać 1 ml 90% etanolu do każdej próbki przez 5 minut.
   6. Dodawać 1 ml 95% etanolu do każdej próbki przez 5 minut (powtórzyć 3 razy).
   7. Dodawać 1 ml 100% etanolu do każdej próbki przez 5 minut (powtórzyć 3 razy).
3. Osadzanie i dalsza obróbka
   1. Wymieszaj 1 objętość żywicy Epon z jedną objętością etanolu. Dodaj go do preparatu w ciągłej rotacji (2-4 godziny).
   2. Umieść preparat w 100% Epon w otwartych kolbach, pozostaw pozostały etanol do odparowania (4-6 godzin).
   3. Preparat umieścić w foremkach nagrzanych do 60°C na 36 godzin.
   4. Przetwarzanie mikroskopii elektronowej. Preparat należy przetwarzać w cienkich odcinkach o długości fali 50-80 nm, stosując standardowe procedury ultramikrotomii.
4. Obrazowanie za pomocą mikroskopii elektronowej
   1. Preparat jest obrazowany przy użyciu konwencjonalnych procedur EM.

6) Reprezentatywne wyniki

Oczekiwane wyniki są przedstawione na rysunkach 1C i 2. Procedura oświetlenia prowadzi do powstania brązowego osadu DAB, który będzie widoczny zarówno w obrazowaniu fluorescencyjnym, jak i transmisyjnym. Pierwszym zjawiskiem występującym podczas oświetlenia jest zanik fluorescencji związanej z barwieniem barwnikiem FM. Natomiast fluorescencja tła indukowana przez utrwalacz aldehydu będzie widoczna przez cały czas trwania eksperymentu. Bielenie odbywa się zwykle w ciągu ~10-20 minut po rozpoczęciu oświetlenia. Zazwyczaj w tym momencie nie można zaobserwować żadnego produktu fotokonwersji.

Oświetlenie powinno być kontynuowane, a po ~10 minutach przygotowania zmienią kolor na brązowy z powodu akumulacji DAB (Rys. 1C_iv) Nie jest jasne, dlaczego wytrącanie DAB i wybielanie barwnikiem FM nie odbywają się równocześnie; możliwe jest, że stosunkowo duża ilość utlenionego DAB musi się zgromadzić przed agregacją i wytrąceniem, i że dlatego reakcja ta jest wolniejsza niż proces bielenia. Na tym etapie preparat nie jest jednak gotowy do przetwarzania za pomocą mikroskopii elektronowej, ponieważ wytrącanie DAB jest prawdopodobnie niekompletne. Wolimy poczekać 5-10 minut dłużej, podczas których preparat (presynaptyczne zakończenie nerwowe) przybiera ciemnobrązowy (lub) kolor, wskazujący na całkowitą konwersję. Na tym etapie można zaobserwować nieznaczną przemianę ogólnej powierzchni preparatu (na przykład włókien mięśniowych w połączeniu nerwowo-mięśniowym). Jest to najprawdopodobniej związane z konwersją DAB indukowaną przez autofluorescencję (i/lub fluorescencję utrwalającą) i nie jest szkodliwe dla zabiegu.

Preparat jest następnie przetwarzany do mikroskopii elektronowej i powinien być sprawdzony pod kątem obecności ciemnych (oznakowanych) pęcherzyków. Jak wykazaliśmy wcześniej ^5,6, pęcherzyki te są znacznie gęstsze niż nieznakowane, a zatem można je łatwo odróżnić (ryc. 2B). Aby zwiększyć szansę na dobre rozróżnienie różnych typów pęcherzyków, nie należy wykonywać barwienia skrawków wzmacniającego kontrast (bez barwienia octanem uranylu lub cytrynianem ołowiu); barwienie osmem jest wystarczające do obserwacji większości elementów komórkowych i nie jest tak ciemne jak osad DAB.

Rysunek 1: FM barwniki i jego użycie do fotokonwersji. (A) Przedstaw etapy klasycznego eksperymentu polegającego na ładowaniu i zatrzymywaniu pęcherzyków za pomocą barwnika FM pod wpływem stymulacji. (i) Inkubować próbkę w buforze zawierającym barwnik FM. (ii) Stymulować (elektrycznie lub chemicznie) do indukowania fuzji pęcherzyków w obecności barwnika FM. (iii) Podsekwencja endocytozy po stymulacji obciąży niektóre pęcherzyki barwnikiem FM nadal obecnym w buforze zewnątrzkomórkowym. (iv) Zastąp zewnątrzkomórkowy barwnik FM przez przemycie buforem. (v) Nowa stymulacja spowoduje, że naładowane pęcherzyki uwolnią barwnik FM po egzocytozie. (B) Schemat przedstawiający głowę, grzbiet i ogon barwnika FM1-43. (C) Przykład eksperymentu fotokonwersji u Drosophila NMJ. (i) Po załadowaniu NMJ FM1-43, umyciu zewnętrznych cząsteczek barwnika i utrwaleniu, fluorescencję zakończenia nerwowego można zaobserwować za pomocą konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego (63x). (ii)–iii) Pod ciągłym oświetleniem barwnik jest całkowicie wybielony. (iv) Gdy oświetlenie jest kontynuowane, pojawia się kolor z powodu wytrącania się diaminobenzydyny. Podziałka liniowa odpowiada 10 μm.

Rysunek 2: Przykłady EM próbek fotokonwertowanych. (A) Obraz przedstawia zakończenie nerwowe zawierające pęcherzyki synaptyczne, ale nie wszystkie z nich są fotokonwertowane; Może to być spowodowane niewystarczającym oświetleniem lub słabą penetracją diaminobenzydyny w tkance. (B) Synaptyczny bouton z kilkoma ciemnymi (wypełnionymi) pęcherzykami, które przeszły fotokonwersję FM. (C) Nadmiar oświetlenia powoduje powstanie ogólnie ciemnego końca, w którym nie można odróżnić pęcherzyków ani organelli. Podziałka liniowa reprezentuje 200 nm.

Dyskusja

Należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków:

• Inkubację DAB należy przeprowadzać dopiero po dokładnym umyciu i wygaszeniu preparatów. W przeciwnym razie nieprzereagowany aldehyd glutarowy będzie oddziaływał z DAB i powodował jego wytrącanie (zwykle w postaci płaskich kryształów, które nie mają gęstości elektronów). Preparaty, w których wytrącanie to zachodzi obficie, rzadko nadają się do mikroskopii elektronowej.
• Czasy świecenia powinny być zoptymalizowane, poprzez przetestowanie kilku identyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
FM 1-43	Invitrogen	F10317
Żywica Epon	Plano GmbH	R1030
chlorowodorek di-aminobenzydyny	Sigma-Aldrich	D5905
50% aldehyd glutarowy	AppliChem	A3166	klasa EM
Sylgard	Dow Corning	104186298
Axioskop 2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.
Obiektyw 20x 0,5 NA	Olympus Corporation		Suchy obiektyw
100W Hg Lampa	Carl Zeiss, Inc.
Obudowa lampy z lusterkiem tylnym	Carl Zeiss, Inc.	Aparat 1007-980
MRm	Carl Zeiss, Inc.	0445-554	Akwizycja obrazu
Np. Filtr (HQ 470/40)	AHF	F49-671
Dichroiczny (495 DCLP)	AHF	F33-100
Em. Filtr (HQ 500 LP)	AHF	F42-018
EM	Carl Zeiss, Inc.
Proscan CCD HSS	Proscan System elektroniczny.		Wymiary: 1024 x 1024