Barwniki FM okazały się nieocenioną pomocą w zrozumieniu dynamiki synaptycznej. Barwniki FM są zazwyczaj śledzone pod mikroskopem fluorescencyjnym w różnych warunkach stymulacji. Jednakże fotokonwersja barwników FM w połączeniu z mikroskopią elektronową umożliwia wizualizację odrębnych pul pęcherzyków synaptycznych, a także innych komponentów ultrastruktury, w pączkach synaptycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie pul pul pęcherzyków synaptycznych z wykorzystaniem fotokonwersji barwników styrylowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fuzja pęcherzyków synaptycznych z błoną plazmatyczną (egzocytoza) jest niezbędnym etapem uwalniania neurotransmiterów i komunikacji neuronalnej. Pęcherzyki są następnie odzyskiwane z błony plazmatycznej (endocytoza) i dołączane do ogólnej puli pęcherzyków w obrębie zakończenia nerwowego, aż do momentu przejścia przez nowy cykl egzocytozy i endocytozy (recykling pęcherzyków). Procesy te badano przy użyciu różnych technik, takich jak mikroskopia elektronowa, rejestracje elektrofizjologiczne, amperometria oraz pomiary pojemności. Co istotne, w ciągu ostatnich dwóch dekad pojawiło się szereg markerów znakowanych fluorescencyjnie, co pozwoliło na zastosowanie technik optycznych do śledzenia dynamiki recyklingu pęcherzyków. Jednym z najczęściej stosowanych markerów są barwniki styrylowe lub FM 1; strukturalnie wszystkie barwniki FM zawierają hydrofilową głowę i lipofilowy ogon połączone pierścieniem aromatycznym oraz jedną lub więcej wiązaniami podwójnymi (Ryc. 1B). Klasyczny eksperyment z użyciem barwnika FM w celu oznakowania puli pęcherzyków polega na kąpieli preparatu (Ryc. 1Ai) w barwniku podczas stymulacji nerwu (elektrycznie lub wysokim stężeniem K+). Indukuje to recykling pęcherzyków i następcze ładowanie barwnika do niedawno endocytowanych pęcherzyków (Ryc. 1Ai-iii). Po załadowaniu pęcherzyków barwnikiem, druga runda stymulacji w kąpieli bez barwnika wywoła uwalnianie FM poprzez egzocytozę (Ryc. 1Aiv-v), proces, który można monitorować poprzez obserwację spadku intensywności fluorescencji (odbarwianie).
Chociaż barwniki FM wniosły ogromny wkład w badania nad recyklingiem pęcherzyków, konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna nie pozwala na określenie dokładnej lokalizacji ani morfologii poszczególnych pęcherzyków. Z tego powodu wyjaśniamy w niniejszym opracowaniu, w jaki sposób barwniki FM mogą być wykorzystane jako markery endocytyczne w mikroskopii elektronowej poprzez fotokonwersję. Technika fotokonwersji wykorzystuje właściwość barwników fluorescencyjnych do generowania reaktywnych form tlenu pod wpływem intensywnego oświetlenia. Preparaty znakowane fluorescencyjnie zanurza się w roztworze zawierającym diaminobenzydynę (DAB), a następnie naświetla. Gatunki reaktywne generowane przez cząsteczki barwnika utleniają DAB, co prowadzi do powstania stabilnego, nierozpuszczalnego osadu o ciemnym wyglądzie, który można łatwo rozpoznać w mikroskopii elektronowej 2,3. Ponieważ DAB ulega utlenieniu wyłącznie w bezpośrednim sąsiedztwie cząsteczek fluorescencyjnych (ze względu na krótki czas życia reaktywnych form tlenu), technika ta gwarantuje, że jedynie struktury znakowane fluorescencyjnie będą zawierać elektronowo gęsty osad. Metoda ta pozwala zatem na badanie dokładnego położenia i morfologii organelli uczestniczących w aktywnym recyklingu.
Protokół
1) Przygotowanie złącza nerwowo-mięśniowego (NMJ) Drosophila melanogaster
- Przygotuj standardowy roztwór soli dla Drosophila (130 mM NaCl, 36 mM sucrose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4).
- Wykonaj preparację w roztworze soli (1.1). Larwę Drosophila przytwierdza się szpilkami do płytki Sylgard stroną grzbietową do góry; stronę grzbietową przecina się wzdłużnie, a następnie usuwa organy wewnętrzne. Preparat zostaje następnie rozciągnięty i unieruchomiony szpilkami. Można teraz wykorzystać kilka mięśni brzusznych.
2) Stymulacja i barwienie FM
- Zaleca się wykonywanie wszystkich poniższych kroków w warunkach słabego oświetlenia, aby chronić barwniki FM przed blaknięciem.
- Do chemicznej stymulacji nerwów stosuje się bufor z wysoką zawartością potasu. Przygotować sól fizjologiczną dla Drosophila (patrz 1.1) zawierającą 90 mM KCl oraz 10 μM barwnika FM1-43. Roztwór należy przechowywać w ciemności.
- Kąpiel preparatu w wcześniej przygotowanym buforze przeprowadzić przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
- Przepłukać standardową solą fizjologiczną dla Drosophila (1.1), aby usunąć pozakomórkowy barwnik FM1-43. Następnie bezzwłocznie przejść do utrwalania.
3) Fixacja
- Kąpiel preparatu w 2,5% glutaraldehydzie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 45 minut w temperaturze pokojowej. W celu lepszego zachowania cech morfologicznych glutaraldehyd jest preferowany nad paraformaldehydem.
- Jednokrotne przemycie PBS, a następnie pozostawienie preparatu zanurzonego na 15 minut w 10 mM NH4Cl. Ten krok jest wykonywany w celu zneutralizowania wolnych grup aldehydowych pozostałego fiksatywu z glutaraldehydu.
- Wypłukanie roztworu NH4Cl zwykłym PBS.
4) Fotokonwersja
- Inkubować preparat NMJ przez 30 minut w temperaturze 4°C w PBS zawierającym 1,5 mg ml-1 diaminobenzydyny (DAB).
- Umieścić próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zlokalizować i ustawić ostrość sygnału fluorescencyjnego, używając obiektywu imersyjnego z wodą o stosunkowo niskim powiększeniu (20x 0,5 NA).
- Naświetlać próbkę z maksymalną intensywnością lampy, aż barwnik FM zostanie całkowicie wybielony (Ryc. 1C). Aby sprawdzić, czy nastąpiła fotokonwersja, zaleca się obejrzeć próbkę w świetle przechodzącym przed i po etapie wybielania barwnika FM. W przypadku zajścia fotokonwersji spodziewany jest ciemnobrązowy osad (Ryc. 1C). Czas naświetlania jest zmienny i zależy od mocy oświetlenia oraz stopnia penetracji DAB w preparacie. Dla większości preparatów przy użyciu obiektywu 20x stwierdzono, że optymalny czas naświetlania wynosi ~30-45 minut. W przypadku obiektywów o większym powiększeniu (60x) stosuje się krótsze okresy naświetlania.
- Do naświetlania zaleca się stosowanie lampy rtęciowej z obudową wyposażoną w lustro tylne, które zbiera wstecznie rozproszone wiązki światła, zwiększając tym samym całkowitą intensywność.
5) Przygotowanie próbki do EM
- Osmowanie
- Przygotować roztwór zawierający jedną objętość czwartotlenku osmu w trzech objętościach wody (ok. 30 μl na próbkę). Prace z czwartotlenkiem osmu należy prowadzić pod wyciągiem, stosując rękawice i środki ochrony oczu.
- Inkubować preparat w roztworze czwartotlenku osmu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (pod wyciągiem).
- Przepłukać dokładnie buforem PBS (4-5 razy po 5 minut) i przenieść każdą próbkę do czystej szklanej kolby.
- Odwadnianie
- Przygotować oddzielne roztwory etanolu o stężeniach 30, 50, 70, 90, 95 i 10%.
- Dodać 1 ml 30% etanolu do każdej próbki na 5 minut.
- Dodać 1 ml 50% etanolu do każdej próbki na 5 minut.
- Dodać 1 ml 70% etanolu do każdej próbki na 5 minut.
- Dodać 1 ml 90% etanolu do każdej próbki na 5 minut.
- Dodać 1 ml 95% etanolu do każdej próbki na 5 minut (powtórzyć 3x).
- Dodać 1 ml 10% etanolu do każdej próbki na 5 minut (powtórzyć 3x).
- Zatopienie i dalsza obróbka
- Zmieszać jedną objętość żywicy Epon z jedną objętością etanolu. Dodać mieszaninę do preparatu przy ciągłym obracaniu (2-4 godziny).
- Umieścić preparat w 10% żywicy Epon w otwartych kolbach i pozwolić na odparowanie pozostałego etanolu (4-6 godzin).
- Umieścić preparat w formach w temperaturze 60°C na 36 godzin.
- Obróbka do mikroskopii elektronowej. Przygotować skrawki o grubości 50-80 nm, stosując standardowe procedury ultramikrotomii.
- Obrazowanie w mikroskopii elektronowej
- Obrazowanie preparatu przeprowadza się zgodnie ze standardowymi procedurami EM.
6) Reprezentatywne wyniki
Oczekiwane wyniki przedstawiono na rysunkach 1C i 2. Procedura naświetlania prowadzi do powstania brązowego osadu DAB, który będzie widoczny zarówno w obrazowaniu fluorescencyjnym, jak i transmisyjnym. Pierwszym zjawiskiem występującym podczas naświetlania jest zanik fluorescencji związany z barwieniem barwnikiem FM. Z kolei fluorescencja tła wywołana utrwalaczem aldehydowym będzie widoczna przez cały czas trwania eksperymentu. Wypalanie następuje zazwyczaj w ciągu ~10-20 minut od rozpoczęcia naświetlania. W tym punkcie czasowym zazwyczaj nie można zaobserwować produktu fotokonwersji.
Należy kontynuować naświetlanie; po około 10 minutach preparaty przyjmą brązowy odcień z powodu akumulacji DAB (Rys. 1Civ). Nie jest jasne, dlaczego precypitacja DAB i blaknięcie barwnika FM nie zachodzą jednocześnie; możliwe, że przed agregacją i precypitacją musi nagromadzić się stosunkowo duża ilość utlenionego DAB, w związku z czym reakcja ta przebiega wolniej niż proces blaknięcia. Na tym etapie preparat nie jest jednak gotowy do obróbki do mikroskopii elektronowej, ponieważ precypitacja DAB jest prawdopodobnie niepełna. Zalecamy odczekanie dodatkowych 5–10 minut, podczas których preparat (presynaptyczne zakończenie nerwowe) przyjmuje ciemnobrązowy (lub czarny) kolor, co świadczy o całkowitej konwersji. Na tym etapie można zaobserwować lekką konwersję ogólnej powierzchni preparatu (na przykład włókien mięśniowych w złączu nerwowo-mięśniowym). Jest ona najprawdopodobniej związana z konwersją DAB indukowaną autofluorescencją (i/lub fluorescencją utrwalacza) i nie wpływa negatywnie na przebieg procedury.
Następnie preparat poddaje się obróbce do mikroskopii elektronowej i należy sprawdzić, czy obecne są ciemne (znakowane) pęcherzyki. Jak wykazaliśmy wcześniej 5,6, pęcherzyki te są znacznie gęstsze niż pęcherzyki nieznakowane, dzięki czemu można je łatwo odróżnić (Rycina 2B). Aby zwiększyć szansę na wyraźne rozróżnienie różnych typów pęcherzyków, nie należy przeprowadzać potranskrypcyjnego barwienia kontrastującego przekrojów (bez barwienia octanem uranylu lub cytrynianem ołowiu); barwienie osmem jest wystarczające do obserwacji większości elementów komórkowych i nie jest tak ciemne jak osad DAB.
Rycina 1: Barwniki FM i ich zastosowanie w fotokonwersji. (A) Przedstaw etapy klasycznego eksperymentu obciążania i odbarwiania pęcherzyków przy użyciu barwnika FM podczas stymulacji. (i) Inkubować próbkę w buforze zawierającym barwnik FM. (ii) Stymulować (elektrycznie lub chemicznie), aby wywołać fuzję pęcherzyków w obecności barwnika FM. (iiiNastępująca po stymulacji endocytoza spowoduje załadowanie części pęcherzyków barwnikiem FM wciąż obecnym w buforze zewnątrzkomórkowym.dożylnie) Usunąć pozakomórkowy barwnik FM poprzez przemycie buforem. (vNowa stymulacja wywoła u naładowanych pęcherzyków uwalnianie barwnika FM podczas egzocytozy.B) Schemat przedstawiający głowę, mostek i ogon barwnika FM1-43. (C) Przykład eksperymentu z fotokonwersją w Muszka owocowa NMJ. (złącze nerwowo-mięśniowe)iPo załadowaniu złącza neuromięśniowego (NMJ) barwnikiem FM1-43, wypłukaniu cząsteczek barwnika z powierzchni zewnętrznej oraz utrwaleniu, fluorescencję zakończenia nerwowego można obserwować za pomocą konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego (63x).ii-iiiPod wpływem ciągłego naświetlania barwnik ulega całkowitemu wybieleniu.ivPodczas dalszej iluminacji pojawia się kolor czarny w wyniku precypitacji diaminobenzydyny. Pasek skali reprezentuje 10 μm.
Rysunek 2: Przykłady obrazów EM próbek poddanych fotokonwersji. (ANa obrazie widoczne jest zakończenie nerwowe zawierające pęcherzyki synaptyczne, z których żaden nie uległ fotokonwersji; może to być spowodowane niewystarczającym oświetleniem lub słabą penetracją diaminobenzydyny w tkance.B) Bouton synaptyczny z kilkoma ciemnymi (wypełnionymi) pęcherzykami, które przeszły fotokonwersję FM. (CNadmiar oświetlenia prowadzi do całkowitego zaciemnienia obrazu, w którym nie można rozpoznać pęcherzyków ani organelli. Paski skali odpowiadają 20 nm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków:
- Inkubację z DAB należy przeprowadzić dopiero po dokładnym przemyciu i gaszeniu preparatów. W przeciwnym razie niezwiązana glutaraldehyd zareaguje z DAB i spowoduje jego wytrącenie (zazwyczaj w formie płaskich kryształów, które nie są gęste elektronowo). Preparaty, w których dochodzi do intensywnego wytrącania, są rzadko użyteczne w mikroskopii elektronowej.
- Czasy naświetlania należy zoptymalizować, testując kilka identycznych preparatów przy różnych ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Żywica Epon | Plano GmbH | R1030 | |
| chlorowodorek diaminobenzydyny | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% glutaraldehyd | AppliChem | A3166 | klasa EM |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Obiektyw 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Obiektyw suchy | |
| Lampa Hg 100W | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Obudowa lampy z lustrem tylnym | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| Kamera MRm | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Akwizycja obrazu |
| Filtr wzbudzenia (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Lustro dichroiczne (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Filtr emisji (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
Bibliografia
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Science. 303, 2037-2039 (2004).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons. Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).
- Lange, R. P. J. de, de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held. J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).
- Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction. Neuron. 39, 529-541 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
