Implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumoksydami w ubytkach chrząstki

Podsumowanie

Celem prezentacji jest zademonstrowanie wysoce powtarzalnej metody generowania implantów komórek macierzystych związanych z macierzą w ubytkach chrząstki, które można wizualizować za pomocą obrazowania MR. Komórki macierzyste są znakowane zatwierdzonymi przez FDA ferumoksydami, mieszane z agarozą, implantowane w ubytkach chrząstki i obrazowane za pomocą skanera MR 7T.

Streszczenie

Dziedzina inżynierii tkankowej integruje zasady inżynierii, biologii komórki i medycyny w celu regeneracji konkretnych komórek i funkcjonalnych tkanek. Implanty macierzystych komórek związanych z macierzą (MASI) mają na celu regenerację ubytków chrząstki wynikających z artretycznych lub urazowych uszkodzeń stawów. Dorosłe mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) posiadają zdolność do różnicowania się w komórki linii chondrogennej i wykazują obiecujące wyniki w technologiach naprawy chrząstki stawowej opartych na komórkach. Autologiczne MSC mogą być izolowane z różnych tkanek, mogą być namnażane w kulturach komórkowych bez utraty potencjału różnicowania oraz wykazały różnicowanie chondrogenne in vitro i in vivo^{1, 2}.

Aby zapewnić lokalną retencję i żywotność przeszczepionych MSC w ubytkach chrząstki, niezbędne jest zastosowanie rusztowania, które dodatkowo wspiera późniejszą dyferencjację i proliferację. Architektura rusztowania kieruje formowaniem tkanki i umożliwia ekspansję macierzy pozakomórkowej produkowanej przez komórki macierzyste. Wcześniejsze badania wykazały, że rusztowanie z 2% agarozy może wspierać rozwój stabilnej chrząstki szklistej i nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej³.

Długotrwałe utrzymanie przeszczepionych komórek macierzystych w MASI jest kluczowe dla regeneracji chrząstki. Znakowanie MSC nanocząsteczkami tlenku żelaza umożliwia długoterminowe śledzenie in vivo przy użyciu nieinwazyjnych technik obrazowania MR⁴.

W niniejszej prezentacji zaprezentowano techniki znakowania MSC nanocząsteczkami tlenku żelaza, tworzenie konstruktów z komórek i agarozy oraz implantację tych konstruktów w ubytek chrząstki. Znakowane konstrukty mogą być śledzone nieinwazyjnie za pomocą obrazowania MR.

Protokół

1. Znakowanie hMSC za pomocą Endoremu

1. Komórki hoduje się do osiągnięcia 80% konfluencji na co najmniej 18 godzin przed znakowaniem.
2. W tym czasie przygotowuje się pożywkę do znakowania, dodając Endorem do próbki w dawce 100 ug Fe/ml pożywki bezsurowiczej.
3. Po osiągnięciu przez komórki odpowiedniej konfluencji odsysa się pożywkę hodowlaną, a następnie komórki płucze się 1x przy użyciu PBS lub pożywki bezsurowiczej.
4. Następnie odsysa się roztwór płuczący i dodaje wcześniej przygotowaną pożywkę do znakowania. Komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂ przez 4 godziny.
5. Po 4-godzinnej inkubacji odsys....

Dyskusja

Opisany protokół zapewnia powtarzalny sposób znakowania MSC nanocząsteczkami tlenku żelaza oraz implantacji tych znakowanych MSC w defekty chrząstki. Technika ta umożliwia nieinwazyjne obrazowanie przeszczepów komórek macierzystych w defektach chrząstki za pomocą obrazowania MR, co pozwala na wczesne wykrycie niepowodzenia MASI. Przesunięcie lub odpływ znakowanych komórek można zdiagnozować na podstawie zaniku znacznika w miejscu transplantacji na obrazach MR. Wczesna diagnoza tych zdarzeń jest pożądana i uchroniłaby pac.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
D-MEM High Glucose	Odczynnik	Sigma-Aldrich	D5648
PBS (bez Ca++, Mg++)		GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsyna-EDTA 0.05%		Invitrogen	25399-120
FBS		Hyclone	SH30071.03
Penicylina/Streptomycyna		GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Tlenki żelaza (Endorem)		Guerbet
Agaroza Typ VII		Sigma-Aldrich	A9045	Rozcieńczyć agarozę w PBS do stężenia końcowego 4%