Implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumoksydami w ubytkach chrząstki

Podsumowanie

Celem prezentacji jest zademonstrowanie wysoce powtarzalnej metody generowania implantów komórek macierzystych związanych z macierzą w ubytkach chrząstki, które można wizualizować za pomocą obrazowania MR. Komórki macierzyste są znakowane zatwierdzonymi przez FDA ferumoksydami, mieszane z agarozą, implantowane w ubytkach chrząstki i obrazowane za pomocą skanera MR 7T.

Streszczenie

Dziedzina inżynierii tkankowej integruje zasady inżynierii, biologii komórki i medycyny w celu regeneracji konkretnych komórek i funkcjonalnych tkanek. Implanty macierzystych komórek związanych z macierzą (MASI) mają na celu regenerację ubytków chrząstki wynikających z artretycznych lub urazowych uszkodzeń stawów. Dorosłe mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) posiadają zdolność do różnicowania się w komórki linii chondrogennej i wykazują obiecujące wyniki w technologiach naprawy chrząstki stawowej opartych na komórkach. Autologiczne MSC mogą być izolowane z różnych tkanek, mogą być namnażane w kulturach komórkowych bez utraty potencjału różnicowania oraz wykazały różnicowanie chondrogenne in vitro i in vivo^{1, 2}.

Aby zapewnić lokalną retencję i żywotność przeszczepionych MSC w ubytkach chrząstki, niezbędne jest zastosowanie rusztowania, które dodatkowo wspiera późniejszą dyferencjację i proliferację. Architektura rusztowania kieruje formowaniem tkanki i umożliwia ekspansję macierzy pozakomórkowej produkowanej przez komórki macierzyste. Wcześniejsze badania wykazały, że rusztowanie z 2% agarozy może wspierać rozwój stabilnej chrząstki szklistej i nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej³.

Długotrwałe utrzymanie przeszczepionych komórek macierzystych w MASI jest kluczowe dla regeneracji chrząstki. Znakowanie MSC nanocząsteczkami tlenku żelaza umożliwia długoterminowe śledzenie in vivo przy użyciu nieinwazyjnych technik obrazowania MR⁴.

W niniejszej prezentacji zaprezentowano techniki znakowania MSC nanocząsteczkami tlenku żelaza, tworzenie konstruktów z komórek i agarozy oraz implantację tych konstruktów w ubytek chrząstki. Znakowane konstrukty mogą być śledzone nieinwazyjnie za pomocą obrazowania MR.

Protokół

1. Znakowanie hMSC za pomocą Endoremu

1. Komórki hoduje się do osiągnięcia 80% konfluencji na co najmniej 18 godzin przed znakowaniem.
2. W tym czasie przygotowuje się pożywkę do znakowania, dodając Endorem do próbki w dawce 100 ug Fe/ml pożywki bezsurowiczej.
3. Po osiągnięciu przez komórki odpowiedniej konfluencji odsysa się pożywkę hodowlaną, a następnie komórki płucze się 1x przy użyciu PBS lub pożywki bezsurowiczej.
4. Następnie odsysa się roztwór płuczący i dodaje wcześniej przygotowaną pożywkę do znakowania. Komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂ przez 4 godziny.
5. Po 4-godzinnej inkubacji odsysa się pożywkę do znakowania, a komórki płucze się PBS i trypsynizuje w sposób rutynowy.
6. Po trypsynizacji komórki płucze się 3x przy użyciu PBS i wiruje przy 400rcf przez 5 minut.
7. Po tym etapie płukania komórki resuspenduje się, zlicza, ocenia ich żywotność i wykorzystuje zgodnie z potrzebami do dalszych doświadczeń.

2. Przygotowanie agarozy

1. Po oznakowaniu komórek należy przygotować roztwór agarozy.
2. Na precyzyjnej wadze odważa się 80mg proszku agarozy i dodaje do 2ml PBS.
3. Roztwór ten należy delikatnie wymieszać, a następnie poddać autoklawowaniu.
4. Po około 40 min płynny roztwór agarozy można wyjąć z autoklawu. Należy zmierzyć jego objętość i odpowiednio dostosować ją, dodając podgrzany wcześniej PBS.
5. Następnie roztwór schładza się do 42°C

3. Tworzenie MASI

1. Po osiągnięciu przez roztwór agarozy pożądanej temperatury należy policzyć komórki i odwirować je po raz ostatni w probówce Eppendorf o pojemności 1,5 ml.
2. Po wirowaniu nad precipitates jest odrzucany, a komórki miesza się z DMEM, aby uzyskać stężenie 30 x 10⁶ komórek/ml.
3. Teraz komórki miesza się z 42°C podgrzana agaroza.
4. Zimna końcówka pipety może spowodować zestalenie się agarozy wewnątrz końcówki, dlatego zaleca się jej uprzednie podgrzanie poprzez kilkukrotne pobieranie i wydawanie gorącego, sterylnego buforu PBS.
5. Następnie pobiera się taką samą objętość agarozy, co pożywki, i miesza ją dokładnie z zawiesiną komórek w pożywce, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
6. Podczas mieszania należy trzymać probówkę Eppendorf w podgrzanej uprzednio kąpieli wodnej, aby agaroza nie schłodziła się do temperatury umożliwiającej jej zestalenie.
7. Po uzyskaniu jednorodnej zawiesiny komórki wszczepia się w miejsce ubytku.

Rycina 1. Koronalne obrazy SE ważone w T2 (TR 4000 ms/ TE 18.27 ms) preparatu rzepki z implantowanymi hMSC w ubytkach chrząstki.

Dyskusja

Opisany protokół zapewnia powtarzalny sposób znakowania MSC nanocząsteczkami tlenku żelaza oraz implantacji tych znakowanych MSC w defekty chrząstki. Technika ta umożliwia nieinwazyjne obrazowanie przeszczepów komórek macierzystych w defektach chrząstki za pomocą obrazowania MR, co pozwala na wczesne wykrycie niepowodzenia MASI. Przesunięcie lub odpływ znakowanych komórek można zdiagnozować na podstawie zaniku znacznika w miejscu transplantacji na obrazach MR. Wczesna diagnoza tych zdarzeń jest pożądana i uchroniłaby pac...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
D-MEM High Glucose	Odczynnik	Sigma-Aldrich	D5648
PBS (bez Ca++, Mg++)		GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsyna-EDTA 0.05%		Invitrogen	25399-120
FBS		Hyclone	SH30071.03
Penicylina/Streptomycyna		GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Tlenki żelaza (Endorem)		Guerbet
Agaroza Typ VII		Sigma-Aldrich	A9045	Rozcieńczyć agarozę w PBS do stężenia końcowego 4%