Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasy lignocelulozowej) Część II: Węglowodany

Podsumowanie

Biomasa roślinna jest głównym, neutralnym pod względem emisji dwutlenku węgla odnawialnym zasobem, który może być wykorzystywany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu węglowodanów pochodzących ze ścian komórkowych.

Streszczenie

Potrzeba odnawialnych, neutralnych pod względem emisji dwutlenku węgla i zrównoważonych surowców dla przemysłu i społeczeństwa stała się jedną z najpilniejszych kwestii XXI wieku. Przyczyniło się to do odnowienia zainteresowania wykorzystaniem produktów roślinnych jako surowców przemysłowych do produkcji paliw płynnych do transportu²i inne produkty, takie jak materiały biokompozytowe⁶Biomasa roślinna pozostaje jednym z największych niewykorzystanych zasobów na planecie⁴Składa się ona głównie ze ścian komórkowych zbudowanych z bogatych w energię polimerów, w tym celulozy, różnych hemiceluloz oraz polifenolowej ligniny⁵i stąd bywają one nazywane materiałami lignocelulozowymi. Jednakże ściany komórkowe roślin ewoluowały tak, aby były oporne na degradację, ponieważ w znacznym stopniu przyczyniają się do wytrzymałości i integralności strukturalnej całej rośliny. Pomimo niezbędnej sztywności, ściana komórkowa jest wysoce dynamiczną jednostką, która jest metabolicznie aktywna i odgrywa kluczową rolę w licznych procesach komórkowych, takich jak wzrost i różnicowanie roślin⁵Ze względu na różnorodne funkcje ścian komórkowych, w ścianach różnych gatunków roślin oraz w różnych typach komórek w obrębie jednej rośliny występuje ogromna różnorodność strukturalna.⁴Zatem w zależności od tego, jaki gatunek uprawy, odmiana lub tkanka roślinna jest wykorzystywana w biorafinerii, etapy przetwarzania w celu depolimeryzacji za pomocą procesów chemicznych/enzymatycznych oraz następująca po nich fermentacja różnych cukrów do płynnych biopaliw muszą zostać dostosowane i zoptymalizowane. Fakt ten uzasadnia potrzebę dokładnej charakterystyki surowców z biomasy roślinnej. Przedstawiamy tutaj kompleksową metodologię analityczną, która umożliwia określenie składu materiałów lignocelulozowych i nadaje się do analiz o średniej i wysokiej przepustowości (Rycina 1). Metoda rozpoczyna się od przygotowania materiału ścian komórkowych pozbawionego skrobi. Otrzymane materiały lignocelulozowe są następnie dzielone w celu określenia składu monosacharydowego hemiceluloz i innych polisacharydów macierzy1 oraz zawartości celulozy krystalicznej⁷Protokół analizy składników ligniny w biomasie lignocelulozowej został omówiony w Części I³(Empty source HTML provided)

Protokół

1. Izolacja ściany komórkowej

1. rozmieć około 60-70mg materiału roślinnego suszonego powietrzem lub liofilizowanego za pomocą kulek ze stali nierdzewnej o średnicy 5.5 mm w probówce Sarstedt z nakrętką o pojemności 2ml, używając młyna Retsch (1 min, 25 Hz). Alternatywnie, zastosowanie wysokoprzepustowego robota do rozdrabniania i dozowania o nazwie iWall opisano w Części I³.
2. usuń stalowe kulki przed kontynuowaniem procedury izolacji ścian komórkowych
   Szczegółowy protokół przygotowania materiału ścian komórkowych przedstawiono w Części I³. Dla pełności obrazu poniżej zamieszczono opisane kroki protokołu.
3. dodaj 1.5 ml 70% wodnego etanolu i dokładnie wymieszaj w wortexie
4. wiruj przy 10,000 rpm przez 10 min, aby wytrącić osad pozostałości nierozpuszczalnych w alkoholu
5. odessij lub odlej nadsącz
6. dodaj do osadu 1.5 ml roztworu chloroformu/metanolu (1:1 v/v) i dokładnie potrząśnij probówką, aby resuspendować osad
7. wiruj przy 10,000 rpm przez 10 min, a następnie odessij lub odlej nadsącz
8. resuspenduj osad w 500 ul acetonu
9. odparuj rozpuszczalnik strumieniem powietrza w temperaturze 35°C aż do całkowitego wysuszenia
   W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania.
10. Aby rozpocząć usuwanie skrobi z próbki, resuspenduj osad w 1.5 ml 0.1 M buforu octanu sodu o pH 5.0.
11. zamknij probówki Sarstedt i podgrzewaj przez 20 min w temperaturze 80°C w bloku grzewczym.
12. schłodź zawiesinę na lodzie
13. dodaj do osadu następujące odczynniki: 35 μl 0.01% azydku sodu (NaN₃), 35 μl amylazy (50 μg/1mL H₂O; z gatunków Bacillus, SIGMA); 17 μl pullulanazy (18.7 jednostek z Bacillus acidopullulyticus; SIGMA). Zamknij probówkę i dokładnie wymieszaj w wortexie.
14. Zawiesinę inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C w wytrząsarce. Położenie probówek poziomo ułatwia lepsze mieszanie.
15. podgrzej zawiesinę w temperaturze 100°C przez 10 min w bloku grzewczym, aby zakończyć trawienie.
16. wiruj (10,000 rpm, 10 min) i odrzuć nadsącz zawierający rozpuszczoną skrobię
17. przemyj pozostały osad trzykrotnie, dodając 1.5 ml wody, mieszając w wortexie, wirując i odlewając wodę płuczącą.
18. resuspenduj osad w 500 ul acetonu
19. odparuj rozpuszczalnik strumieniem powietrza w temperaturze 35°C aż do całkowitego wysuszenia. Może być konieczne rozbicie materiału w probówce za pomocą szpatułki w celu lepszego wysuszenia.
    Wysuszony materiał stanowi izolowane ściany komórkowe (lignocelulozę). W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania.

2. Skład polisacharydowy macierzy

Metoda ta stanowi w istocie modyfikację metody opublikowanej przez Albersheima 1.

1. Aby określić skład monosacharydowy materiału ścian komórkowych, odważyć 2 mg materiału do probówek Starstedt o pojemności 2 ml, ręcznie lub w sposób wysokoprzepustowy przy użyciu iWall, zrobotyzowanego urządzenia do mielenia i ważenia.
2. Dodać 20 uL roztworu inozytolu (5 mg/ml) jako wzorca wewnętrznego. Dla próbki 2 mg ścian komórkowych zaleca się dodanie 100 ug.
3. Przepłukać ścianki probówki 250 ul acetonu, aby zebrać materiał ścian komórkowych na dnie probówki, a następnie bardzo delikatnie odparować aceton w strumieniu powietrza.
4. W celu przeprowadzenia hydrolizy słabym kwasem dodać 250 ul 2M kwasu trifluorooctowego (TFA) do każdej próbki. TFA należy dodawać ostrożnie, aby uniknąć rozpryskania materiału na ścianki probówki.
5. Szczelnie zakapslować i inkubować przez 90 min w temperaturze 121°C w bloku grzejnym.
6. Schłodzić bloki grzejne i próbki na lodzie.
7. Wirować probówki z prędkością 10 000 rpm przez 10 min.
8. Przenieść 100 ul kwaśnego supernatantu zawierającego monosacharydy pochodzące z polisacharydów macierzy do szklanych fiolek z nakrętką, dbając o to, aby nie naruszyć osadu. Osad można wykorzystać do poniższej analizy celulozy krystalicznej (patrz pkt 3.).
9. Odparować TFA w szklanej probówce pod delikatnym strumieniem powietrza w urządzeniu do odparowywania.
10. Dodać 300 μl 2-propanolu, wymieszać w wortexie i odparować w temperaturze 25°C (powtórzyć łącznie trzy razy).
11. Pierwszym etapem procedury derywatyzacji do octanów alditoli jest redukcja monosacharydów do odpowiadających im alditoli. W tym celu do każdej wysuszonej próbki dodać 200 μl roztworu borowodorku sodu. Za każdym razem należy przygotować świeży roztwór, stosując 10 mg borowodorku sodu na 1 ml 1M wodorotlenku amonu.
12. Pozostawić szklane fiolki w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny.
13. Zneutralizować roztwór, dodając 150 ul lodowatego kwasu octowego.
14. Wymieszać w wortexie i odparować w temperaturze 25°C.
15. Dodać 250 μl mieszaniny kwas octowy/metanol (1:9, v/v), wymieszać w wortexie i odparować w temperaturze 25°C.
16. Dodać 250 μl metanolu i odparować w strumieniu powietrza (powtórzyć łącznie trzy razy).
17. W celu acetylacji alditoli dodać 50 μl bezwodnika octowego i 50 μl pirydyny, wymieszać w wortexie i inkubować przez 20 min w temperaturze 121°C w bloku grzejnym.
18. Schłodzić próbki w bloku za pomocą lodu, czekając, aż temperatura spadnie do poziomu zbliżonego do temperatury pokojowej.
19. Odparować odczynniki pod delikatnym strumieniem powietrza w temperaturze pokojowej. Uwaga: octany alditoli są bardzo lotne.
20. Dodać 200 μl toluenu i odparować w strumieniu powietrza (x3).
21. W końcowych etapach przeprowadza się ekstrakcję octanów alditoli. Najpierw dodać 500 ul octanu etylu i delikatnie zamieszać ruchem okrężnym.
22. Dodać 2 ml wody, zakapslować probówki i wymieszać w wortexie.
23. Wirować probówki z prędkością 2 000 RPM przez 5 min, aby uzyskać wyraźnie rozdzielone warstwy (octan etylu na górze, woda na dole).
24. Nabrać pipetą 50 ul warstwy octanu etylu do fiolek GC/MS z wkładkami.
25. Rozcieńczyć, dodając 100 ul acetonu do fiolki GC, i zakapslować. Objętość próbki i objętość rozcieńczenia można dostosować, aby uniknąć przeciążenia GC/MS, jeśli stężenie próbki jest zbyt wysokie.
    Fiolkę GC można przechowywać w temperaturze 4°C, jeśli analiza GC/MS nie zostanie przeprowadzona natychmiast.
26. Próbki wstrzykuje się do chromatografu gazowego (GC) wyposażonego w kwadrupolowy detektor MS, choć odpowiedni jest również detektor izo-jonizacyjny (FID). Stosowana jest kolumna Supelco SP-2380 (30 mm x 0,25 mm x 0,25 μm grubości warstwy) z 4-minutowym opóźnieniem rozpuszczalnika i szybkością przepływu 1,5 ml/min. Wstrzyknięte próbki poddawane są następującemu programowi temperaturowemu: początkowe utrzymanie w 160°C przez 2 min; wzrost temperatury z prędkością 20°C/min do 200°C i utrzymanie przez 5 min; wzrost z prędkością 20°C/min do 245°C i utrzymanie przez 12 min; gwałtowny wzrost do 270°C i utrzymanie przez 5 min przed schłodzeniem do temperatury początkowej 160°C. Piki są identyfikowane na podstawie profili masowych i/lub czasów retencji wzorców. Monosacharydy są ilościowo oznaczane na podstawie krzywych wzorcowych.

3. Zawartość celulozy krystalicznej

Metoda ta została w zasadzie opisana przez Updegrafa⁸. Do tej procedury można wykorzystać kilka rodzajów materiałów wyjściowych: wyizolowany materiał ściany komórkowej (patrz 1) lub materiał ściany poddany już działaniu 2M TFA (patrz 2.8) – albo osad pozostały bezpośrednio po obróbce kwasem (patrz 2.8), albo osad TFA, który został przemyty 2-propanolem i wysuszony.

1. Do osadu TFA w szklanej probówce z nakrętką dodać 1 ml odczynnika Updegraffa (kwas octowy: kwas azotowy: woda, 8:1:2 v/v).
2. Szczelnie zakręcić probówkę, wymieszać w wstrząsarku typu vortex i ogrzewać w bloku grzejnym w temperaturze 100°C przez 30 min. W wyniku tej obróbki w osadzie pozostaje nierozpuszczalna jedynie celuloza krystaliczna.
3. Schłodzić próbki w bloku na lodzie do temperatury pokojowej lub niższej.
4. Wirować próbki przy 10 000 rpm przez 15 min.
5. Odlać nadsącz, dbając o to, aby nie naruszyć osadu i nie usunąć żadnego materiału z osadu. W tym celu pozostawić w probówce ok. 150 µl nadsączu.
6. Dodać 1,5 ml wody, wymieszać, wirować i odlać nadsącz w sposób opisany powyżej.
7. Powtórzyć procedurę płukania jeszcze 3 razy, używając 1,5 ml acetonu.
8. Bardzo delikatnie wysuszyć osad strumieniem powietrza lub pozostawić do wyschnięcia na blacie przez noc.
9. Osad (celuloza krystaliczna) jest teraz całkowicie hydrolizowany do glukozy poprzez tzw. hydrolizę Saemana. W tym celu do probówki Sarstedt dodać 175 μl 72% kwasu siarkowego.
10. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min, wymieszać w wstrząsarku typu vortex i inkubować przez kolejne 15 min.
11. Dodać 825 μl wody i wymieszać w wstrząsarku typu vortex.
12. Wirować próbki przy 10 000 rpm przez 5 min. W probówce może pozostać brązowy nierozpuszczalny materiał, czyli lignina.
13. Zawartość glukozy w nadsączu oznaczono za pomocą kolorymetrycznego testu antronowego. Oznaczanie to wykonuje się na polistyrenowej płytce mikrotitracyjnej z 96 dołkami.
14. Do krzywej wzorcowej należy użyć roztworu stokowego glukozy o stężeniu 1 mg/ml (przechowywanego w 0°C) i przygotować dublety standardów 0, 2, 4, 6, 8 i 10 µg poprzez pipetowanie 0, 2, 4, 6, 8 i 10 µl do oddzielnych, odpowiednich dołków. Każdy dołek należy uzupełnić wodą do objętości 100 µl.
15. Do oddzielnych dołków na tej samej płytce mikrotitracyjnej co standardy dodać 10 μl nadsączu z każdej próbki oraz 90 ml wody.
16. Dodać 200 μl świeżo przygotowanego odczynnika antronowego (antron rozpuszczony w stężonym kwasie siarkowym, 2 mg antronu/ml kwasu siarkowego).
17. Ogrzewać płytkę przez 30 min w temperaturze 80°C w piecu (używając aluminiowego rozpraszacza ciepła). Próbki zawierające glukozę zmieniają kolor z żółtego na niebiesko-zielony.
18. Pozostawić płytkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej i dokładnie wstrząsnąć.
19. Odczytać absorbancję płytki przy 625 nm za pomocą czytnika płytek mikrotitracyjnych.
20. Ilość glukozy (a tym samym zawartość celulozy krystalicznej) oblicza się na podstawie absorbancji w odniesieniu do krzywej wzorcowej wyznaczonej na tej samej płytce.

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład analizy ścian komórkowych przedstawiono na rysunku 2. W tym przypadku łodyga topoli (drewno) została poddana analizie zgodnie z różnymi procedurami opisanymi w sekcji protokołu. Skład polisacharydowy macierzy został zilustrowany przykładowym chromatogramem identyfikującym typowe cukry obecne w ścianach komórkowych roślin: fukozę, ramnozę, ksylozę, arabinozę, galaktozę, mannozę i glukozę (oraz standard wewnętrzny inozytol). Głównym komponentem hemicelulozowym topoli jest ksylan, co potwierdza wysoka zawartość ksylozy. Należy jednak pamiętać, że zawartość tych cukrów będzie się różnić w zależności od zastosowanego surowca4. Glukoza w tej analizie pochodzi z hemicelulozy ksyloglukanu oraz celulozy amorficznej. Dzięki przeprowadzonej analizie dane mogą być przedstawione jako mol% lub ug/ mg materiału ścian komórkowych (lub masy suchej). Zawartość celulozy krystalicznej jest oczywista; można oczekiwać wartości od 20-50% suchej masy ścian komórkowych. Na podstawie wyników przedstawionych tutaj oraz w części I3, skład lignocelulozowy drewna topoli wynosi 21% ligniny, 30% hemiceluloz i 41% celulozy krystalicznej. Pozostała część to popiół.

Rysunek 1: Przegląd analizy lignocelulozowej. Ściany komórkowe (frakcje lignocelulozowe) są izolowane z surowego, wysuszonego materiału roślinnego. Następnie materiał ścian komórkowych jest ważony w aliquoty i dzielony na części do poszczególnych testów analitycznych. Skład polisacharydów macierzy ustala się po potraktowaniu materiału ścian słabym kwasem (2M TFA), przeprowadzeniu derywatyzacji otrzymanych rozpuszczonych monosacharydów do postaci octanów alditoli oraz analizie metodą GC-MS. Osad po obróbce słabym kwasem jest przemywany tzw. odczynnikiem Updegraffa, w wyniku czego pozostaje jedynie nierozpuszczalna celuloza krystaliczna. Celuloza jest solubilizowana kwasem siarkowym i oznaczana ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego określającego zawartość glukozy. Równolegle można oznaczyć zawartość i skład ligniny zgodnie z opisem w Części I³.

Rysunek 2: Kompleksowa analiza lignocelulozowa drewna topoli. Wióry drewna topoli (Populus tremoloides) poddano opisanemu protokołowi.
Góra po lewej: Skład polisacharydów macierzy; Fuc fukoza; Rha ramnoza; Ara arabinoza; Xyl ksyloza; Man mannoza; Gal galaktoza; Glc glukoza; inositol standard wewnętrzny.

Dyskusja

Opisane metody umożliwiają szybką ilościową ocenę składu lignocelulozowej biomasy roślinnej. Metoda ta pozwala na określenie składu takich materiałów, w tym składu cukrowego polisacharydów macierzy, mianowicie hemiceluloz, oraz zawartości celulozy krystalicznej. Przepustowość poszczególnych metod analitycznych w przeliczeniu na jedną osobę jest zróżnicowana. Zastosowanie opisanych tutaj protokołów pozwala na przetworzenie 20 próbek w celu analizy składu polisacharydów macierzy oraz 30 próbek w celu oznaczenia zawartości celulozy krystalicznej. Dzięki ilościowemu charakterowi danych możliwe jest ocenienie optymalnych roślin surowcowych, odmian lub genotypów pod kątem ich przydatności do produkcji biopaliw.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas trifluorooctowy	Sigma-Aldrich	T6508
myo-Inozytol	Sigma-Aldrich	I5125
Borewodorek sodu	Sigma-Aldrich	213462
Pirydyna	JT Baker	3348-01
Bezwodnik octowy	Sigma-Aldrich	320102
Spectromax Plus 384	Molecular Devices	Plus384
GC-MS	Agilent Technologies	7890A GC/5975C MSD
Stalowe kulki 5.5mm	Salem Ball Company	(N/A)
Radiator do płytek 96-dołkowych	Biocision	Coolsink 96F
Młyn Retsch	Qiagen	TissueLyser II
Blok grzejny	Techne	Dri-block DB-3D
Koncentrator próbek	Techne	FSC400D