Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część II: Węglowodany

Podsumowanie

Biomasa roślinna jest głównym neutralnym pod względem emisji dwutlenku węgla zasobem odnawialnym, który może być wykorzystany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, strukturalnie złożonego materiału kompozytowego określanego mianem lignoceluloz. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu węglowodanów pochodzących ze ścian.

Streszczenie

Zapotrzebowanie na odnawialne, neutralne pod względem emisji dwutlenku węgla i zrównoważone surowce dla przemysłu i społeczeństwa stało się jednym z najbardziej palących problemów XXI wieku. Spowodowało to ponowne zainteresowanie wykorzystaniem produktów roślinnych jako surowców przemysłowych do produkcji paliw płynnych w transporcie² oraz innych produktów, takich jak materiały biokompozytowe⁶ . Biomasa roślinna pozostaje jednym z największych niewykorzystanych rezerw na planecie⁴. Składa się głównie ze ścian komórkowych, które składają się z bogatych w energię polimerów, w tym celulozy, różnych hemiceluloz i polifenolu^{ligniny 5}, dlatego czasami nazywanych lignocelulozami. Jednak ściany komórkowe roślin ewoluowały, aby być oporne na degradację, ponieważ ściany w znacznym stopniu przyczyniają się do wytrzymałości i integralności strukturalnej całej rośliny. Pomimo swojej niezbędnej sztywności, ściana komórkowa jest bardzo dynamiczną jednostką, która jest metabolicznie aktywna i odgrywa kluczową rolę w wielu czynnościach komórkowych, takich jak wzrost i różnicowanie roślin⁵. Ze względu na różne funkcje ścian, w obrębie ścian występuje ogromna różnorodność strukturalna różnych gatunków roślin i typów komórek w obrębie jednej rośliny⁴. W związku z tym, w zależności od tego, jaki gatunek rośliny, odmianę roślin uprawnych lub tkankę roślinną jest używany w biorafinerii, etapy przetwarzania depolimeryzacji w procesach chemicznych/enzymatycznych, a następnie fermentacji różnych cukrów do płynnych biopaliw muszą być dostosowane i zoptymalizowane. Fakt ten uzasadnia potrzebę dokładnej charakterystyki surowców do produkcji biomasy roślinnej. W niniejszym artykule opisano kompleksową metodologię analityczną, która umożliwia określenie składu lignocelulozowych i jest podatna na analizę średnio- i wysokoprzepustową (ryc. 1). Metoda rozpoczyna się od przygotowania wykrochmalonego materiału ściany komórkowej. Otrzymane lignocelulozy są następnie dzielone w celu określenia składu monosacharydowego hemiceluloz i innych polisacharydów matrycy1 oraz zawartości celulozy krystalicznej⁷. Protokół analizy składników ligniny w biomasie lignocelulozowej omówiono w części^{I 3}.

Protokół

1. Izolacja ściany komórkowej

1. zmielić około 60-70 mg powietrznego lub liofilizowanego materiału roślinnego za pomocą kulek ze stali nierdzewnej o średnicy 5,5 mm w probówce z nakrętką Sarstedt o pojemności 2 ml za pomocą młyna retschmill (1 min, 25 Hz). Alternatywa, zastosowanie wysokowydajnego robota mieląco-dozującego o nazwie iWall, opisano w części I³.
2. Usuń stalowe kulki przed kontynuowaniem procedury izolacji ściany komórkowej
   Szczegółowy protokół przygotowania materiału ściany komórkowej przedstawiono w części I³. Dla kompletności poniżej pisemne kroki protokołu.
3. Dodać 1,5 ml 70% wodnego roztworu etanolu i dokładnie wymieszać
4. Wirować z prędkością 10 000 obr./min przez 10 minut w celu osadzenia pozostałości nierozpuszczalnej w alkoholu
5. Odsysać lub dekantować supernatant
6. Dodać 1,5 ml roztworu chloroformu/metanolu (1:1 V/V) do pozostałości i dokładnie wstrząsnąć probówką w celu ponownego zawieszenia osadu
7. Wirować z prędkością 10 000 obr./min przez 10 minut i zasysać lub dekantować supernatant
8. Zawiesić osad w 500 ul acetonu
9. odparować rozpuszczalnik strumieniem powietrza o temperaturze 35°C aż do wyschnięcia
   W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania.
10. Aby rozpocząć usuwanie skrobi z próbki, należy ponownie zawiesić osad w 1,5 ml 0,1 M buforu octanu sodu o pH 5,0.
11. Zakryj rurki Sarstedta i podgrzewaj przez 20 minut w temperaturze 80°C w bloku grzewczym.
12. schłodzić zawiesinę na lodzie
13. Do osadu dodać następujące środki: 35 μl 0,01% sodiumazydu (NaN₃), 35 μl amylazy (50 μg/1 ml_H2O; z gatunku Bacillus, SIGMA); 17 μl pullulanazy (18,7 jednostki z Bacillus acidopullulyticus; SIGMA). Zakręć rurkę i dokładnie wymieszaj.
14. Zawiesinę inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C w shakerze. Orientacja probówek w poziomie pomaga w lepszym mieszaniu.
15. Podgrzewać zawiesinę w temperaturze 100°C przez 10 minut w bloku grzewczym, aby zakończyć trawienie.
16. Odwirować (10 000 obr./min, 10 min) i odrzucić supernatant zawierający rozpuszczoną skrobię
17. Pozostałe granulki umyć trzykrotnie, dodając 1,5 ml wody, wirując, odwirowując i dekantując wodę do mycia.
18. Zawiesić osad w 500 ul acetonu
19. odparować rozpuszczalnik strumieniem powietrza o temperaturze 35°C aż do wyschnięcia. Może być również konieczne rozdrobnienie materiału w tubie szpatułką w celu lepszego wyschnięcia.
    Wysuszony materiał przedstawia izolowaną ścianę komórkową (lignocelulozy). W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania.

2. Skład polisacharydowy matrycy

Ta metoda jest zasadniczo modyfikacją metody opublikowanej przez Albersheim 1.

1. Aby określić skład monosacharydowy materiału ścianki, należy odważyć 2 mg materiału ściany komórkowej w probówkach Starstett o pojemności 2 ml ręcznie lub w sposób wysokoprzepustowy za pomocą iWall, zrobotyzowanego robota do mielenia i ważenia.
2. Dodać 20 μl roztworu inozytolu (5 mg/ml) jako wzorzec wewnętrzny. W przypadku próbki ściany komórkowej 2 mg zalecamy dodanie 100 ug.
3. Przepłukać ścianki rurki 250 ul acetonu, aby zebrać materiał ściany komórkowej na dnie probówki i bardzo delikatnie odparować aceton pod przepływem powietrza.
4. W przypadku hydrolizy słabego kwasu dodać 250 ul 2M kwasu trifluorooctowego (TFA) do każdej próbki. Ostrożnie dodaj TFA, aby upewnić się, że żaden materiał nie rozpryskuje się na ściankach rury.
5. Szczelnie zakryć i inkubować przez 90 minut w temperaturze 121°C w bloku grzewczym.
6. Schłodzić bloki grzewcze i próbki na lodzie.
7. Odwirować probówki z prędkością 10 000 obr./min przez 10 minut.
8. Przenieść 100 ul kwaśnego supernatantu zawierającego monosacharyd pochodzący z polisacharydu matrycy do szklanych fiolek z zakrętką, uważając, aby nie naruszyć materiału osadu. Osad może być użyty do poniższego testu z celulozy krystalicznej (patrz 3.)
9. odparować TFA w szklanej rurce pod delikatnym strumieniem powietrza w urządzeniu do odparowywania.
10. dodać 300 μl 2-Propanolu, odwirować i odparować w temperaturze 25°C (powtórzyć w sumie trzy razy)
11. Pierwszym etapem procedury derywatyzacji octanu aldytolu jest przeprowadzenie redukcji cukrów prostych do odpowiadających im alditoli. W tym celu do każdej wysuszonej próbki dodać 200 μl roztworu borowodorku sodu. Przygotuj świeży roztwór za każdym razem, używając 10 mg borowodorku sodu na 1 ml 1M wodorotlenku amonu.
12. Pozostaw szklaną fiolkę w temperaturze pokojowej na 1,5 godziny
13. Zneutralizować roztwór, dodając 150 ul lodowatego kwasu octowego
14. wirować i odparowywać w temperaturze 25°C.
15. dodać 250 μl kwasu octowego/metanolu (1:9, v/v), odwirować i odparować w temperaturze 25°C
16. dodać 250 μl metanolu i odparować pod strumieniem powietrza (powtórzyć w sumie trzy razy)
17. W celu acetylacji alditoli dodać 50 μl bezwodnika octowego i 50 μl pirydyny, odwirować i inkubować przez 20 minut w temperaturze 121°C w bloku grzewczym.
18. Schłodzić próbki w bloku lodem, czekając, aż temperatura spadnie do około temperatury pokojowej.
19. Odparować odczynniki pod delikatnym strumieniem powietrza o temperaturze pokojowej. Bądź ostrożny: octany aldytolu są bardzo lotne.
20. dodać 200 μl toluenu i odparować pod powietrzem (x3)
21. W końcowych etapach ekstrahuje się octany aldytolu. Najpierw dodaj 500 ul octanu etylu i lekko zamieszaj.
22. Dodać 2 ml wody, nakrętki i wirować.
23. probówki wirówkowe o prędkości 2 000 obr./min przez 5 minut w celu uzyskania przezroczystych, oddzielnych warstw (octan etylu na górze, woda na dole)
24. Odpipetować 50 ul warstwy octanu etylu do fiolek GC/MS z wkładkami.
25. rozcieńczyć, dodając 100 l acetonu do fiolki GC i nakrętki. Objętość próbki i objętość rozcieńczenia można regulować, aby uniknąć przeciążenia GC/MS, jeśli stężenie próbki jest zbyt wysokie.
    Fiolka GC może być przechowywana w temperaturze 4°C, jeśli analiza GC/MS nie zostanie natychmiast przeprowadzona
26. Próbki są wstrzykiwane do GC, który jest wyposażony w kwadrupolowy MS, ale odpowiedni jest również detektor płomieniowo-jonizacyjny. Kolumna Supelco SP-2380 (grubość folii 30 mm x 0,25 mm x 0,25 μm) jest używana z 4-minutowym opóźnieniem rozpuszczalnika i natężeniem przepływu 1,5 ml / min. Wstrzykiwane próbki poddawane są następującemu programowi temperaturowemu: Początkowe utrzymywanie w temperaturze 160°C przez 2 minuty; rampę z 20°C/min do 200°C i przytrzymaj przez 5 minut; rampa z 20°C/min do 245°C i utrzymanie 12 minut; skok do 270°C i przytrzymać przez 5 minut przed schłodzeniem do temperatury początkowej 160°C 2,26.) Szczyty są identyfikowane za pomocą profili masy i/lub czasów retencji wzorców. Monosacharydy są oznaczane ilościowo na podstawie krzywych standardowych.

3. Zawartość celulozy krystalicznej

Ta metoda jest zasadniczo opisana przez Updegraf⁸. Istnieje kilka materiałów wyjściowych do tej procedury: izolowany materiał ściany komórkowej (patrz 1) lub materiał ścianki, który został już poddany działaniu 2M TFA (patrz 2.8), albo pozostały osad bezpośrednio po poddaniu działaniu kwasu (patrz 2.8), albo granulat TFA, który został przemyty 2-propanolem i wysuszony.

1. Dodać do granulatu TFA w szklanej probówce z nakrętką 1 ml odczynnika Updegraff (kwas octowy: kwas azotowy: woda, 8:1:2 v/v).
2. Szczelnie zamknij rurkę, odwiruj i podgrzewaj w bloku grzewczym w temperaturze 100°C przez 30 minut. W wyniku tej obróbki tylko krystaliczna celuloza pozostaje nierozpuszczalna w granulce.
3. Schłodzić próbki w bloku na lodzie do temperatury pokojowej lub chłodniejszej
4. Odwirowywać próbki z prędkością 10 000 obr./min przez 15 min
5. Odrzucić supernatant, upewniając się, że osad nie jest naruszony i nie usuwa się z niego żadnego materiału. W tym celu pozostawić w probówce ok. 150 ul supernatantu.
6. Dodać 1,5 ml wody, wstrząsnąć, odwirować i odlać supernatant, jak to zrobiono powyżej
7. Powtórz procedurę prania jeszcze 3 razy, używając 1,5 ml acetonu
8. Suszyć pelety na powietrzu bardzo delikatnie z powietrzem lub pozostawić do wyschnięcia na ławce na noc
9. Osad (celuloza krystaliczna) jest teraz całkowicie hydrolizowany do glukozy w wyniku tak zwanej hydrolizy Saemana. W tym celu dodać 175 μl 72% kwasu siarkowego do probówki Sarstedta
10. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, wirować i inkubować przez kolejne 15 minut
11. Dodaj 825 μl wody i wiruj
12. Odwirować próbki z prędkością 10 000 obr./min przez 5 min. W probówce może pozostać jakiś brązowy nierozpuszczalny materiał, lignina.
13. Zawartość glukozy w supernatancie oznacza się za pomocą kolorymetrycznego testu antronowego. Test ten przeprowadza się w 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania polistyrenu.
14. Do krzywej wzorcowej należy użyć zapasu glukozy o stężeniu 1 mg/ml (przechowywanego w temperaturze 0°C) i utworzyć zduplikowane wzorce 0, 2, 4, 6, 8 i 10 μg, pipetując 0, 2, 4, 6, 8 i 10 μl do oddzielnego odpowiedniego dołka. Napełnij każdą studzienkę do 100 ul wodą.
15. Dodać 10 μl supernatantu każdej próbki i 90 ml wody do oddzielnych komórek, ale na tej samej płytce do mikromiareczkowania, co wzorzec.
16. dodać 200 μl świeżo przygotowanego odczynnika Anthrone (Antron rozpuszczony w stężonym kwasie siarkowym, 2 mg Antronu/ ml kwasu siarkowego)
17. płyta grzewcza przez 30 min w temperaturze 80°C w piekarniku (aluminiowy rozpraszacz ciepła). Próbki zawierające glukozę zmieniają kolor z żółtego na niebiesko-zielony.
18. Pozwól talerzowi ostygnąć do temperatury pokojowej i dokładnie wstrząśnij.
19. Odczytać absorpcję płytki przy 625 mm za pomocą czytnika płytek do mikromiareczkowania.
20. Glukozę (a tym samym zawartość celulozy krystalicznej) oblicza się na podstawie absorbancji w porównaniu z krzywą wzorcową ustaloną na tej samej płytce.

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład analizy ściany jest przedstawiony na rysunku 2. W tym przypadku pień topoli (drewno) został przeanalizowany za pomocą różnych procedur opisanych w sekcji protokołu. Skład polisacharydowy matrycy jest podkreślony przez przykładowy chromatogram identyfikujący typowy cukier obecny w ścianach komórkowych roślin, fukozę, ramnozę, ksylozę, arabinozę, galaktozę, mannozę i glukozę (oraz wzorzec wewnętrzny inozytolu). Głównym składnikiem hemicelulozowym topoli jest ksylan, o czym świadczy wysoka zawartość ksylozy. Jednak obfitość tych cukrów będzie się różnić w zależności od użytego surowca4. Glukoza w tej analizie pochodzi z hemicelulozy ksylolukanu i celulozy amorficznej. Ze względu na analizę, dane mogą być prezentowane jako mol% lub ug/mg materiału ścianki (lub suchej masy). Zawartość celulozy krystalicznej nie wymaga wyjaśnień, można spodziewać się wartości między 20-50% suchej masy ściany. Na podstawie wyników przedstawionych tutaj i w części I3 skład lignocelulozowy drewna topolowego to 21% ligniny, 30% hemicelulozy i 41% celulozy krystalicznej. Reszta to popiół.

Rysunek 1: Przegląd analizy lignocelulozowej. Ściany komórkowe (lignocelulozy) są izolowane z surowego suszonego materiału roślinnego. Materiał ścianki jest następnie ważony na podwielokrotności i dzielony na różne testy. Skład polisacharydowy matrycy ustala się po potraktowaniu materiału ścianki słabym kwasem (2M TFA), derywatyzacji powstałych rozpuszczonych monosacharydów do ich octanów alditolu i analizie za pomocą GC-MS. Pozostałość po obróbce słabym kwasem przemywa się tak zwanym odczynnikiem Updegraff, pozostawiając tylko nierozpuszczalną celulozę krystaliczną. Celuloza jest rozpuszczana w kwasie siarkowym i oznaczana ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego określającego zawartość glukozy. Równolegle można określić zawartość i skład ligniny zgodnie z opisem w części I³.

Rysunek 2: Kompleksowa analiza lignocelulozowa drewna topolowego. Zrębki drzewne z topoli (Populus tremoloides) poddano opisanemu protokołowi.
U góry po lewej: Kompozycja polisacharydowa matrycy; Fuc fukoza; Rha ramnoza; Ara arabinoza; Ksylksylozy; Mannoza człowieka; Galalaktoza; Glukoza Glc; Wewnętrzny wzorzec inozytolu.

Dyskusja

Opisane metody umożliwiają szybką ilościową ocenę składu biomasy roślin lignocelulozowych. Metoda pozwala na określenie składu takich materiałów, w tym składu cukrowego polisacharydów matrycowych, a mianowicie hemicelulozy, zawartości celulozy krystalicznej. Wydajność różnych metod analitycznych na osobę jest różna. Korzystając z opisanych tutaj protokołów, można przetworzyć 20 próbek na kompozycje polisacharydowe matrycy i 30 na zawartość celulozy krystalicznej. Ze względu na ilościowy charakter danych można ocenić optymalne uprawy furowe lub genotypy pod kątem ich przydatności do produkcji biopaliw.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas trifluorooctowy	Sigma-Aldrich	T6508
mio-inozytol	Sigma-Aldrich	I5125
Bowodorek sodu	Sigma-Aldrich	213462
Pirydyna	JT Baker	3348-01
Bezwodnik octowy	Sigma-Aldrich	320102
Spectromax Plus 384	Urządzenia molekularne	Plus384
GC-MS	Agilent Technologies	7890A GC/5975C MSD
5,5 mm kulki ze stali nierdzewnej	Salem Ball Company	(Nie dotyczy / A)
96-dołkowy płytowy rozsiewacz ciepła	Biocision	Coolsink 96F
Retsch Mill	Qiagen	TissueLyser II
Blok grzewczy	Techne	Dri-block DB-3D
Koncentrator próbek	Techne	FSC400D