Pozyskiwanie nasienia i sztuczne zapłodnienie myszy

Podsumowanie

Niniejszy protokół przedstawia metody ekstrakcji plemników z jąder samców oraz następującą po niej inseminację samic myszy. Procedura ta jest przydatna w badaniach rozwojowych wymagających precyzyjnego określenia czasu, a także w pracach nad organizmami transgenicznymi.

Streszczenie

Gryzonie z rodzaju Peromyscus (myszy jeleniowate) są najliczniejszymi rodzimymi ssakami Ameryki Północnej. Gatunki Peromyscus są wykorzystywane w szerokim zakresie badań, w tym w toksykologii, epidemiologii, ekologii oraz w badaniach behawioralnych i genetycznych. W niniejszym materiale stanowią one przydatny model do demonstracji zapłodnienia sztucznego.

Metody podobne do prezentowanych tutaj były wcześniej stosowane w kilku badaniach nad myszą jelenią, jednak nie opublikowano dotąd szczegółowego protokołu. W niniejszym materiale demonstrujemy podstawową metodę zapłodnienia sztucznego. Metoda ta polega na wyjęciu jąder z organizmu gryzonia, a następnie wyizolowaniu plemników z najądrza i przewodu nasiennego. Dojrzałe plemniki, zawieszone w mieszaninie mleka, są wprowadzane do dróg rodnych samicy w czasie owulacji. Dzień zapłodnienia przyjmuje się za dzień 0 w określaniu czasu rozwoju embrionów. Następnie embriony można pobrać w wybranym punkcie czasowym i poddać manipulacjom.

Sztuczne zapłodnienie może być stosowane u wielu gatunków gryzoni, u których precyzyjne określenie czasu rozwoju zarodka jest kluczowe lub trudne do uzyskania. Technika ta jest niezbędna w przypadku gatunków lub szczepów (w tym większości przedstawicieli rodzaju Peromyscus), które mogą nie kopulować natychmiast i/lub u których trudno jest ocenić fakt zajścia kopulacji. Dodatkowo sztuczne zapłodnienie zapewnia dokładne określenie czasu rozwoju zarodka, co jest istotne zarówno przy mapowaniu postępów rozwojowych, jak i w pracach nad transgeniką. Można ograniczyć liczbę wykorzystywanych zwierząt, ponieważ zapłodnienie jest gwarantowane. Metoda ta odegrała kluczową rolę w rozwoju badań nad systemem Peromyscus i z nadzieją przyniesie korzyści również w innych badaniach.

Protokół

Sztuczne zapłodnienie

Sztuczne zapłodnienie stosuje się zamiast naturalnych kopulacji, aby zwiększyć szanse na zajście w ciążę u wszystkich samic. Na każdą jedną superowulowaną samicę lub samicę w znanej rui przypadało dwóch samców. Ogony najądrzy dojrzałych samców myszy umieszczono w 9% zawiesinie mleka i rozcięto za pomocą igieł o rozmiarze 18 G. Pozwolono plemnikom na swobodne pływanie przez kilka minut, a następnie wyjęto najądrza z mieszaniny. Zawiesinę oceniono pod mikroskopem pod kątem gęstości oraz ruchliwości plemników. Do podania nasienia użyto tępej igły o rozmiarze 22 G i długości 1½ cala. Zagięcie pod kątem 120° wykonano w odległości około 3/4^{W tej sekcji omówiono przygotowanie i charakterystykę warstw cienkich tlenku indu i cyny (ITO) osadzonych metodą rozpylania magnetronowego. Przedstawiono optymalizację parametrów procesu, takich jak ciśnienie gazu roboczego, moc przyłożona oraz temperatura podłoża, w celu uzyskania wysokiej przewodności elektrycznej i przejrzystości optycznej. Analiza morfologii powierzchni za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) oraz pomiary rezystancji powierzchniowej pozwoliły na ocenę jakości otrzymanych powłok. Wyniki wskazują, że precyzyjna kontrola warunków osadzania jest kluczowa dla uzyskania jednorodnych warstw o właściwościach odpowiednich dla zastosowań w optoelektronice i ogniwach fotowoltaicznych.} wzdłuż igły. Igłę wprowadzano do pochwy aż do miejsca zgięcia, a następnie wstrzykiwano 0,025–0,05 ml. W przypadku wykorzystania asystenta do utrzymania samicy w odpowiedniej pozycji, stosowanie środków znieczulających nie jest konieczne.

Przygotowanie

1. Użyć 4 samców na 6 samic
2. Poddać samce eutanazji w iwarium
3. Przygotować około 5 ml 9% mleka z mleka w proszku
4. Wlać 1,5 ml do małej szalki Petriego
5. Wyciąć najdziewek i przewody nasienne
6. Umieścić je w 1,5 ml 9% mleka
7. Używając dwóch igieł o rozmiarze 18 G i wykonując długie ruchy tnące igłami, rozciąć najdziewek i przewody nasienne, aby uwolnić plemniki
8. Usunąć pozostałości tkanki i sprawdzić obecność plemników pod mikroskopem

Iniekcja

1. Użyć tępej igły pod kątem 120°
2. Trzymać mysz w dłoni i wstrzyknąć mieszaninę. Jeśli jedna osoba nie jest w stanie jednocześnie trzymać zwierzęcia i wykonywać iniekcji, można zaangażować dwie osoby. Nie należy stosować znieczulenia, ponieważ wpływ tego środka na procedurę nie jest znany.
3. Użyć 0,05ml mieszaniny plemników i mleka na jedną samicę

Samice biorczynie

1. Wykonać wymaz z pochwy u samic biorców (do tego czasu samice biorców powinny znajdować się w fazie proestrusu/estrusu)
2. Samice, które do 5. dnia nie weszły w fazę estrusu,  prawdopodobnie nie powinny być wykorzystane

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkło Petriego	Narzędzie	Fisher Scientific	08-772-30
Igła 18 G	Narzędzie	BD Biosciences	305195
Mleko w proszku	Odczynnik	Dowolny dostawca
Strzykawka 1 mL	Narzędzie	National Scientific Company	S7510-1
Pęseta	Narzędzie	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Nożyczki	Narzędzie	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5882
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	14200-075
Tępa igła 22 G	Narzędzie	Give to me