Oczyszczanie białka MamAΔ41 związanego z magnetosomami szczepu AMB-1 M. magneticum

Podsumowanie

MamA jest unikalnym białkiem powiązanym z magnetosomami, o którym wykazano, że bierze udział w ich aktywacji. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół oczyszczania mutanta z delecją MamA (MamAΔ41) z M. magneticum AMB-1.

Streszczenie

Bakterie magnetotaktyczne stanowią zróżnicowaną grupę mikroorganizmów wodnych, które potrafią orientować się wzdłuż pól geomagnetycznych. Uważa się, że zachowanie to ułatwia im poszukiwanie odpowiednich środowisk.(1)Zdolność ta jest zapewniana przez magnetosom, organellum subkomórkowe składające się z liniowego łańcucha pęcherzyków lipidowych, z których każdy jest w stanie biomineralizować i zamykać wewnątrz kryształ magnetytu lub greigitu o rozmiarze ~50-nm. Głównym składnikiem magnetosomu, którego wykazano, że jest niezbędny do tworzenia funkcjonalnych pęcherzyków, jest MamA. MamA to białko stowarzyszone z magnetosomem występujące w dużych ilościach, będące jednym z najlepiej scharakteryzowanych białek związanych z tym organellum.in vivo (2-6)Niniejszy artykuł koncentruje się na oczyszczaniu białka MamA, które pomimo bycia badanymin vivo, nie zidentyfikowano dla niego żadnych jasnych szczegółów funkcjonalnych ani strukturalnych. Analiza bioinformatyczna zasugerowała, że MamA jest białkiem zawierającym powtórzenia tetra-tripeptydowe (TPR). TPR to motyw strukturalny występujący samodzielnie lub jako część większej fałdy w szerokim zakresie białek; służy on jako matryca dla oddziaływań białko-białko i pośredniczy w tworzeniu wielobiałkowych kompleksów(7)Białka TPR biorą udział w wielu kluczowych zadaniach związanych z procesami w organellach komórek eukariotycznych oraz w wielu szlakach bakteryjnych(8-14).Aby zrozumieć białko MamA, unikalne białko zawierające powtórzenia TPR, w pierwszym kroku wymagane jest otrzymanie wysoko oczyszczonego białka. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół oczyszczania stabilnego mutanta z delecją MamA (MamAΔ41) zM. magneticum AMB-1.

Protokół

1. Klonowanie i ekspresja genu mamA w E. coli

Zmutowany gen mamAΔ41 został namnożony metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z DNA genomowego Magnetospirillum magneticum AMB-1, z wykorzystaniem starterów: 5'-GCATTACGCATGGACGACATCCGCCAGGTG-3' oraz 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'. W amplifikowanych fragmentach DNA wprowadzono miejsce rozpoznawane przez enzym NcoI w kodonie startowym ATG, a kodon stop zastąpiono miejscem rozpoznawanym przez enzym SacI. Fragmenty poddano trawieniu enzymami NcoI i SacI, a następnie sklonowano w odpowiednie miejsca wektora pET52b(+), otrzymując pET52bMamAΔ41-AMB1. W tej konstrukcji mamAΔ41 gen został połączony w ramce odczytu z etykietą 10-His na końcu C. Plazmid wprowadzono do szczepu E. coli BL21 za pomocą elektroporacji. Szczep E. coli BL21 zawierający pET52bMamAΔ41 hodowano w warunkach autoindukcji (15) podłoże zawierające ampicylinę (50 mg/ml) 310°K przez 3 godziny. Następnie zmieniono temperaturę hodowli z 310° Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do przetłumaczenia. 300°K i utrzymywano przez dodatkowe 48 h w 300°KKomórki zebrano poprzez wirowanie przy 5465g przez 10 min w temperaturze 277°K8 litrów hodowli pozwoliło uzyskać 60 gramów mokrego osadu komórkowego.

2. Obliczenia bioinformatyczne

Obliczenia masy cząsteczkowej (MW), zgodnie z sekwencją aminokwasów oraz przewidywaną absorbancją 1mg/1ml białka przy 280nm, wykonano przy użyciu serwera ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Dla 10His-Tag-MamAΔ41 MW wynosi 2529 Da (240 aminokwasów), a dla MamAΔ41 (z pozostałymi 9 aminokwasami po usunięciu His-tagu przez trombinę) MW wynosi 20596.5Da (187 aminokwasów). Przewidywana absorbancja 1mg/1ml białka przy 280nm dla 10His-Tag-MamAΔ41 wynosi 0,595, a dla MamAΔ41 0,579. Dodatkowo sekwencja aminokwasowa nie zawiera żadnych reszt cysteiny. W związku z tym podczas procesu oczyszczania nie są wymagane środki redukujące.

3. Oczyszczanie MamAΔ41

1. W celu przygotowania roztworów stokowych odważić i przygotować (po 20 ml każdego z nich) w następujących stężeniach: roztwór imidazolu (MW 228,2 g/mol) 4M, roztwór NaCl (Mw 58,4 g/mol) 5M, roztwór Tris-HCl (Mw 121,3 g/mol) 1M, dostosowując pH=8. Dodać wodę dwukrotnie destylowaną (DDW) i mieszać za pomocą vortexa do momentu, aż roztwór stanie się klarowny. Przefiltrować roztwory przez filtr 0,2μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować i przefiltrować 6 świeżych buforów z roztworów stokowych (Tabela 1).
3. Rozcieńczyć i zawiesić komórki w buforze A w stosunku 1:2 (gramy komórek do objętości buforu w ml).
4. Dodać DNazę I (1 mg/ml) w ilości 10μl na każde 10g bakterii, aby rozbić fragmenty DNA w próbce. Dodać koktajl inhibitorów proteaz bez EDTA w ilości 1ml na każde 20g bakterii. Inkubować przez 20 min na lodzie.
5. Zdestabilizować komórki poprzez dwa cykle w prasie francuskiej (French press) przy 25 0 psi. W przeciwieństwie do sonikacji, prasa francuska służy do ekstruzji dużych objętości komórek (>10ml) poprzez wymuszanie ich przejścia pod wysokim ciśnieniem przez wąski otwór. Tłok należy chłodzić na lodzie przez dziesięć minut przed użyciem i montażem ze względu na wzrost temperatury.
6. Przenieść lizowane komórki do probótek do ultracentryfugi o pojemności 25ml i precyzyjnie zrównoważyć je (50mg) buforem A, aż próbka osiągnie linię szyjki probówki.
7. Oddzielić szczątki komórkowe poprzez ultracentryfugację przy 270 0g przez 1 godzinę w temperaturze 27°K.
8. Przygotować kolumnę Ni NTA do chromatografii grawitacyjnej (średnica 2,5cm), dodając do kolumny 4 ml żywicy Ni NTA, przechowywanej w 20% etanolu. Poczekać, aż ciecz całkowicie spłynie, a następnie przemyć 40 ml DDW i ponownie poczekać na całkowite spłynięcie cieczy. Przeekwilibrować żywicę w kolumnie 40 ml buforu A.
9. Nałożyć frakcję rozpuszczalną z probótek po ultracentryfugacji na kolumnę Ni NTA. Poczekać, aż ciecz spłynie, zebrać przepłuczynę (białka niezwiązane) i przechowywać w temperaturze 27K.
10. Zebrać próbkę osadu z probótek po ultracentryfugacji, zeskrobując osad za pomocą małego końcówki. Wymieszać końcówkę w 50μl 5% β-merkaptoetanolu w buforze do próbek 2X SDS-PAGE.
11. Przemyć kolumnę 100 ml buforu B. Poczekać, aż ciecz spłynie, zebrać przepłuczynę i przechowywać w temperaturze 27K.
12. Przygotować 15 oznakowanych probótek eppendorfowskich (1,5ml).
13. Elucja – zamknąć zawór kolumny, a następnie nałożyć na kolumnę 1ml buforu C; inkubować przez 3 min, po czym otworzyć zawór i zebrać przepłuczynę. Powtórzyć ten krok trzykrotnie.
14. Eluować resztę zawiesiny w przyrostach 1 ml buforu C i zamknąć zawór.
15. Zmierzyć OD przy 280nm dla frakcji i ocenić położenie piku białkowego; jeśli OD nadal wynosi >0,3, konieczne jest pobranie dodatkowych próbek.
16. Analiza SDS-PAGE zebranych frakcji. Taką analizę należy przeprowadzić również dla następujących próbek: przepłuczyn z białkami niezwiązanymi, przepłuczyn z przemywania oraz próbki osadu po ultracentryfugacji. Wymieszać 10μl każdej próbki z 10μl 5% β-merkaptoetanolu w buforze do próbek 2X SDS-PAGE. Nałożyć próbki na żel 15% SDS-PAGE i prowadzić elektroforezę przez 45 min przy 180 V.
17. Barwić żel w 15 ml roztworu InstantBlue, wstrząsając przez 1 godzinę. Upewnić się, że plastikowe pudełko jest przykryte i chronione przed światłem.
18. Ocenić żel; jeśli ekspresja białka jest wysoka i specyficzna zgodnie ze wskaźnikowymi prążkami, połączyć wybrane frakcje elucyjne.
19. W celu usunięcia 10-His-tag dodać do połączonej próbki trombinę bydlęcą (10 jednostek/μl), w proporcji 10μl trombiny na 1 mg białka, zgodnie z zaleceniami producenta.
20. Dializę stosuje się do usunięcia nadmiaru imidazolu i obniżenia stężeń NaCl do poziomów wymaganych podczas wiązania w wymianie jonowej. Do dializy odciąć pożądany odcinek tubingu dializacyjnego o progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 7 kD. Przemyć DDW i zawiązać węzeł na jednym końcu (lub zabezpieczyć klipsami). Przenieść połączony roztwór białka do worka, pozostawiając nieco miejsca na górze i zacisnąć.
21. Zanurzyć tubing dializacyjny w 4 litrach schłodzonego buforu do dializy (Bufor D). Mieszać roztwór powoli przez noc w temperaturze 27°K.
22. Wyjąć tubing dializacyjny z zlewki, wykonać małe nacięcie i przenieść białko do probówki 50ml.
23. Chromatografia wymiany jonowej: zamontować przygotowaną kolumnę MonoQ 4.6/10 PE w systemie szybkiej chromatografii cieczowej (FPLC). Przemyć kolumnę 5 objętościami kolumny (CV) filtrowanej wody DDW. Przeekwilibrować kolumnę 5 CV buforu D.
24. Przemyć pętlę wtryskową DDW (dwukrotna objętość pętli), a następnie powtórzyć czynność z buforem D. Nałożyć białko do pętli wtryskowej.
25. Wtrysnąć próbkę białka (przepływ 1 ml/min) i rozpocząć zbieranie frakcji do detekcji białek niezwiązanych metodą SDS-PAGE.
26. Jeśli początkowa objętość białka (krok 3.23) jest większa niż objętość pętli wtryskowej, powtarzać kroki 3.25-3.26, bez przemywania pętli, aż cała próbka zostanie nałożona na kolumnę.
27. Przemyć kolumnę 3 CV buforu C w celu usunięcia białek niezwiązanych.
28. Eluować białko za pomocą 60-minutowego gradientu liniowego od 40 do 200mM NaCl pomiędzy buforem D a E (gdzie 10% buforu E stanowi koniec gradientu), przy przepływie 1 ml/min (można zastosować wyższe przepływy kosztem większych objętości, ale mniej skoncentrowanych pików białkowych). Zbierać piki białkowe w momencie ich pojawienia się na chromatogramie przy 280nm.
29. Oczyścić kolumnę zgodnie z zaleceniami producenta.
30. Analiza SDS-PAGE zebranych frakcji. Analizę tę należy przeprowadzić dla następujących próbek: przepłuczyn z białkami niezwiązanymi oraz przepłuczyn z pikami białkowymi. Przeprowadzić SDS-PAGE i barwienie zgodnie z instrukcjami w krokach 3.17-3.18.
31. Ocenić żel pod kątem obecności prążków białkowych przy przewidywanej masie cząsteczkowej (Mw) zgodnie z markerem białkowym wstępnie barwionym. Połączyć wybrane frakcje elucyjne zawierające odpowiednie białko.
32. Przeprowadzić dializę połączonych próbek w celu obniżenia stężenia NaCl wymaganego do chromatografii wykluczania sterycznego. Dializę przeprowadzić zgodnie z krokami 3.21-3.23 przeciwko buforowi F.
33. Skoncentrować próbkę białka za pomocą Vivaspin-15 10 00 MWCO do stężenia 8 mg/ml w wirówce stołowej, 40 rpm. Zweryfikować pożądane stężenie, mierząc OD przy 280nm w kuwecie kwarcowej. Jeśli białko jest zbyt skoncentrowane, rozcieńczyć je buforem F i zmierzyć ponownie.
34. Zamontować przygotowaną kolumnę do wykluczania sterycznego, HiLoad 26/60 Superdex 20, w systemie FPLC; przemyć kolumnę 3 CV filtrowanej wody DDW. Przeekwilibrować kolumnę 3 CV buforu F.
35. Przemyć pętlę wtryskową 5ml DDW (dwukrotna objętość pętli), a następnie taką samą objętością buforu F. Nałożyć nie więcej niż 4 ml próbki białka do pętli wtryskowej.
36. Wtrysnąć próbkę białka (przepływ 3,5 ml/min) i rozpocząć zbieranie frakcji piku białkowego w momencie ich pojawienia się na chromatogramie przy 280nm. Pozostawić przepływ buforu do momentu osiągnięcia objętości kolumny.
37. Jeśli początkowa objętość białka (krok 3.23) jest większa niż objętość pętli wtryskowej, powtarzać kroki 3.25-3.26, bez przemywania pętli, aż cała próbka zostanie nałożona na kolumnę.
38. Oczyścić kolumnę zgodnie z zaleceniami producenta.
39. Analiza SDS-PAGE zebranych frakcji. Analizę tę należy przeprowadzić dla próbek z pików białkowych. Przeprowadzić SDS-PAGE i barwienie zgodnie z instrukcjami w krokach 3.17-3.18.
40. Ocenić żel: jeśli piki białkowe są specyficzne, mają prawidłową przewidywaną Mw zgodnie z markerem białkowym wstępnie barwionym i widoczny jest tylko jeden prążek, połączyć wybrane frakcje elucyjne odpowiedniego białka.
41. Skoncentrować próbkę białka za pomocą Vivaspin-15 10 0 MWCO do stężenia >20 mg/ml w wirówce stołowej, 40 rpm. Zweryfikować pożądane stężenie, mierząc OD przy 280nm. Oczyszczony MamAΔ41 został następnie skoncentrowany do 26,5 mg/ml w celu krystalizacji.
42. Potwierdzić czystość próbki i tożsamość białka za pomocą desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej macierzą (MALDI-TOF).
43. Jeśli białko zostało oczyszczone zgodnie z wynikami spektrometru mas i SDS-PAGE, podzielić skoncentrowany MamAΔ41 do wcześniej oznakowanych probótek eppendorfowskich; po 25-50μl białka do każdej.
44. Szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze 193°K.

4. Reprezentatywne wyniki

Przy prawidłowym przeprowadzeniu tego protokołu powinny zostać otrzymane wysokiej czystości, jednorodne pod względem rozmiaru i skoncentrowane próbki białka. Próbki te są następnie gotowe do prób krystalizacji oraz badań biochemicznych, takich jak kinetyka enzymatyczna, powinowactwo wiązania i inne. Opisano tutaj reprezentatywne wyniki głównych etapów protokołu oczyszczania. Analiza SDS-PAGE profilu elucji z kolumny powinowactwa Ni-NTA powinna wykazać silną nadekspresję białka w frakcji rozpuszczalnej przy odpowiedniej masie cząsteczkowej ok. 22kDa (Rycina 1). Analiza SDS-PAGE powinna również wykazać minimalną ilość białka, lub jego całkowity brak, w części przepływowej białek niewiązanych, w części przepływowej płukania oraz w osadzie po ultrawirowaniu. Jeśli w tych próbkach pojawią się wyraźne prążki odpowiedniego białka, należy rozważyć błędne przygotowanie buforu, problemy z rozbiciem komórek lub problemy z warunkami autoindukcji i wzrostem kultury.

Chromatografię wymiany jonowej przeprowadza się w celu oddzielenia pożądanego białka od pozostałych białek E.coli, które związały się z żywicą niklową (na skutek oddziaływań elektrostatycznych lub obecności pętli białkowych bogatych w histydynę/aminokwasy kwasowe) oraz od nieprzeciętego białka z His-Tagiem. Kolumna ta rozdziela białka w zależności od ich powinowactwa do dodatnio naładowanej żywicy przy rosnącym stężeniu NaCl. Białka o silnym ładunku ujemnym będą eluować przy wyższych stężeniach NaCl w porównaniu do białek o umiarkowanym ładunku ujemnym. Zaletami tej kolumny są wysoka szybkość przepływu oraz pojemność wiązania. Chromatogram wymiany jonowej (Rysunek 2) wykazuje dobrą separację trzech populacji białek przy rosnącym stężeniu NaCl. Niezbędna jest analiza SDS-PAGE w celu określenia masy cząsteczkowej (MW) każdej populacji, wyizolowania tej pożądanej oraz oceny, czy konieczne są dalsze etapy oczyszczania. Pierwsza populacja to MamAΔ41 (~20 kDa), druga to MamAΔ41+His Tag (~2kDa), który nie został przecięty przez trombinę bydlęcą, a trzecia populacja jest niewykrywalna w SDS-PAGE ze względu na niskie stężenie. Jeśli piki białek nie są wyraźnie oddzielone, należy rozważyć błąd w przygotowaniu buforu lub zmianę nachylenia gradientu NaCl.

Chromatografię wykluczania rozmiarów przeprowadza się w celu oddzielenia pożądanego białka od pozostałych białek komórek E.coli, które związały się z żywicą Ni-NTA i nie zostały usunięte podczas chromatografii wymiany jonowej. Kolumna ta rozdziela białka w zależności od ich wielkości. Białka duże będą eluować w mniejszych objętościach elucji w przeciwieństwie do białek małych, które zostaną eluowane w większych objętościach. Chromatogram kolumny (Rysunek 3) wykazuje dobrą separację pożądanego białka jako jednej głównej populacji. Populacja ta wydaje się eluować w odpowiedniej wielkości monomeru o MW ~20 kDa. Obecność prążka ~80 kDa (typowego białka E.coli wiążącego żywicę Ni-NTA) jest wykrywana w SDS-PAGE przed nałożeniem na kolumnę i znika w trakcie tego etapu. Ponieważ stężenie tego białka ~80 kDa jest początkowo niskie, jego populacja nie pojawia się na chromatogramie ze względu na rozcieńczenie, dlatego analiza SDS-PAGE jest niezbędna do określenia wydajności oczyszczania. Zalecamy nałożenie na SDS-PAGE rozcieńczonej i skoncentrowanej próbki głównego piku, aby z pewnością określić obecność czystego białka o odpowiednim MW. Na tym etapie białko jest oczyszczone, a jego homogeniczność należy ocenić za pomocą MALDI-TOF. Analiza ta wykazała białko o MW 20347 Da oraz inne o Mw 10176 Da (Rysunek 4). Białko ~10 kDa jest dwukrotnie naładowaną formą białka ~20 kDa. Przewidywane MW dla MamAΔ41 z pozostałymi 9 aminokwasami po usunięciu His-Tag wynosiło 20596,5 Da. Porównując je z uzyskanym MW z MALDI-TOF, stwierdzono różnicę wynoszącą 248 Da. Ta rozbieżność może wynikać z błędów pomiarowych MALDI-TOF i/lub z powszechnej degradacji pierwszej metioniny i drugiej glicyny. Podsumowując, białko jest wysoko oczyszczone i może być wykorzystane w dalszych eksperymentach.

Tabela 1. Składy buforów.

Rycina 1. Reprezentatywna analiza SDS-PAGE oczyszczania na kolumnie Ni-NTA. Od prawej do lewej; P – osad z ultrawirowania (krok 3.1 protokołu), W – przemycie (krok 3.12 protokołu), U – białka nieprzypisane (krok 3.10 protokołu), E – pięć ścieżek próbek elucji (krok 3.14 protokołu), M – marker białkowy (liczby wskazują MW). Strzałka wskazuje MamAΔ41.

Rysunek 2. Analiza etapu chromatografii wymiany jonowej (a) Chromatogram wymiany jonowej (kolumna MonoQ); kolor niebieski – absorbancja 280 nm, reprezentująca stężenie białka, kolor zielony – stężenie NaCl, kolor czerwony – wskazanie zebranych frakcji. (b) Reprezentacyjna analiza SDS-PAGE etapu oczyszczania metodą wymiany jonowej. Od lewej do prawej: M – marker białkowy (liczby oznaczają masę cząsteczkową Mw), A6 – frakcja pierwszego piku, A8 – frakcja drugiego piku.

Rycina 3. Analiza metodą chromatografii wykluczania molekularnego (a) Chromatogram z chromatografii wykluczania cząsteczkowego (kolumna Superdex 20); kolor niebieski – absorbancja przy 280 nm, reprezentująca stężenie białka, kolor czerwony – wskazanie zebranych frakcji. (b) Reprezentatywna analiza SDS-PAGE etapu oczyszczania metodą wykluczania cząsteczkowego. Od lewej do prawej; M – marker białek (liczby wskazują masę cząsteczkową MW), PreI – próbka przed wtryskiem, A4-6 – połączone frakcje zebrane z pierwszego piku, A4-6D – rozcieńczona frakcja zebrana z piku.

Rycina 4. Widmo masowe z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą macierzą (MALDI-TOF) oczyszczonego białka MamAΔ41. Matrycą jest kwas sinapowy (SA). Widoczny jest MamAΔ41 o masie 20347 Da, a także dwukrotnie naładowany gatunek MamAΔ41 o masie 10176 Da.

Dyskusja

Oczyszczanie białek jest kluczowym etapem w każdych badaniach biochemicznych lub strukturalnych białek. Ponieważ każde białko jest unikalne i charakteryzuje się odrębnymi właściwościami, konieczne jest zdefiniowanie jego cech i odpowiednie dostosowanie procesu oczyszczania. W pierwszym kroku prowadzącym do oczyszczania białko docelowe należy przeanalizować za pomocą narzędzi bioinformatycznych. Służą one do obliczenia punktu izoelektrycznego białka docelowego oraz oceny zapotrzebowania na środowisko redukujące/utleniając...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Prasa francuska (French Press)	Sprzęt	Thermo Fisher Scientific, Inc.	FA-078A
Komora ciśnieniowa	Sprzęt	Thermo Fisher Scientific, Inc.	FA-032
Ultrawirówka	Sprzęt	Sorvall, Thermo Scientific	Discovery 90SE
Rotor	Sprzęt	Beckman Coulter Inc.	Ti60
Probówki do ultrawirówki; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml	Sprzęt	Beckman Coulter Inc.	BC-355618
Szklane kolumny chromatograficzne Econo-Column o średnicy 2.5cm	Sprzęt	Bio-Rad	737-2521
Żywica Ni-NTA His Bind	Sprzęt	Novagen, EMD Millipore	M0063428
Spektrofotometr	Sprzęt	Amersham	Ultraspec 2100 pro
Kuweta kwarcowa	Sprzęt	Hellma	104-QS
Szybka chromatografia cieczowa (FPLC) – AKTA purifier 10	Sprzęt	GE Healthcare	28-4062-64
Kolumna wymiany jonowej – MonoQ 4.6/100 PE	Sprzęt	GE Healthcare	10025543
Napełniona kolumna do chromatografii wykluczania molekularnego – HiLoad 26/60 Superdex 200	Sprzęt	GE Healthcare	17-1071-01
Centricon – Vivaspin15 – 10,000 MWCO	Sprzęt	Sartorius AG	VS1501
Wirówka stołowa	Sprzęt	Thermo Fisher Scientific, Inc.	IEC CL30R
MALDI-TOF	Sprzęt	Bruker Corporation	Reflex IV
Tris-HCl (hydroksymetylaminometan)	Odczynnik	BioLab	20092391
Chlorek sodu	Odczynnik	FRUTROM	235553470
Imidazol	Odczynnik	Alfa Aesar	288-32-4
Koktajl inhibitorów proteaz bez EDTA	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P-8849
DNaza I (Deoksiribonukleaza I)	Odczynnik	Sigma-Aldrich	DN-25
Trombina wołowa	Odczynnik	Fisher Scientific	BP25432
Glicyna	Odczynnik	BioLab	07132391
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Odczynnik	BioLab	19822391
Beta-merkapto–etanol	Odczynnik	Sigma-Aldrich	M-3148
InstantBlue	Odczynnik	Expedeon	1SB01L
Marker białkowy PageRuler Prestained Protein Ladder	Odczynnik	Fermentas	SM0671