Pozyskiwanie oocytów mysich

Podsumowanie

Niniejszy protokół przedstawia technikę izolowania oocytów lub embrionów na wczesnym etapie rozwoju z jajowodu myszy. Umiejętność zidentyfikowania lejka jajowodu oraz wprowadzenia do niego igły z tępym końcem jest niezbędna do prawidłowego przeprowadzenia tej procedury.

Streszczenie

Do chwili obecnej jedynie nieliczne badania donosiły o udanych manipulacjach w embriogenezie lub biologii rozrodu rodzaju Peromyscus. Wspólnie z Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu) charakteryzujemy kluczowe różnice niezbędne do opracowania tego systemu. Głównym celem była optymalizacja procesu pozyskiwania oocytów oraz wczesnych embrionów.

Protokół

Pobieranie zarodka/oocytu

1. Przynajmniej na dwie godziny przed odzyskiwaniem embrionów/oocytów, pożywkę KSOM umieszcza się w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37ºC, a pożywkę FHM należy rozmrozić z -20°. Do przechowywania kropli KSOM w inkubatorze wykorzystuje się szklaną płytkę z trzema płytkimi, wklęsłymi wgłębieniami. Aby zapobiec dehydratacji, KSOM oraz płytkę umieszcza się w zamkniętym pojemniku z wodą na dnie. Urządzenie to zapobiega odparowywaniu bez konieczności stosowania oleju mineralnego.
   
   
2. Jajowody pobrane od owulującej samicy umieszcza się w pożywce FHM. Aby zapewnić odpowiednią orientację i nienaruszone lejkowate zakończenie jajowodu (infundibulum), wraz z jajowodem wycina się mały fragment jajnika oraz niewielki odcinek macicy. Do wypychania embrionów/oocytów z jajowodu używa się tępej igły o rozmiarze 30 G, wprowadzając ją do infundibulum. Odzyskiwanie embrionów musi odbywać się przez infundibulum, ponieważ światło jajowodu jest zbyt wąskie, aby przejść przez nie igła. W przypadku uszkodzenia infundibulum, jajowód należy rozciąć lub wycisnąć z niego embriony.
   
   
3. Embriony/oocyty odnajduje się w pożywce FHM, ustawiając ostrość mikroskopu na kropelkach tłuszczu, które opadły na dno szalki Petriego. Izolację embrionów/oocytów można przeprowadzić przy powiększeniu 20x, co zapewnia większe pole widzenia niż wysokie powiększenia. Embriony/oocyty wyglądają jak okrągłe kropelki tłuszczu z wyraźnym pierścieniem wokół nich. Do przenoszenia embrionów/oocytów do pożywki KSOM w celu inkubacji i dalszych manipulacji stosuje się pipetowanie ustne z użyciem wyciągniętej kapilary szklanej.

Procedura pobierania oocytów

Przygotowanie

1. Rozmrozić FHM i przygotować kSOM.
2. Kilka godzin wcześniej przelać kSOM do pojemnika na pobranie komórek jajowych, umieścić go w pudełku na końcówki z wodą na dnie, a następnie włożyć do inkubatora CO₂.
3. Przenieść klatki do laboratorium i uśmiercić samice przeznaczonych do zbioru.
4. Wyciąć jajewódź, uważając, aby wyciąć również fragment jajnika oraz macicy, aby upewnić się, że nie odcięto części jajowodu.
5. Umieścić w pożywce FHM w małej płytce Petriego.
6. Nalać pożywkę FHM do kilku dodatkowych płytek Petriego, które będą służyć do płukania.

 

Przepłukiwanie

1. Użyj igły do płukania (30G tępa) połączonej z igłą 1 ml z spiralnym zakończeniem.
2. Pobierz po jednym jajowodzie na raz i za pomocą igły wprowadź ją do lejka jajowodu znajdującego się w pobliżu pozostawionej części jajnika. Jeśli lejek jest zniszczony i nie można go wykorzystać, użyj dwóch pęset i przytrzymaj jeden koniec jajowodu. Drugą pęsetą delikatnie ściśnij jajowód, podobnie jak tubkę pasty do zębów, aby wypchnąć zarodki.
   
   Uwaga: spowoduje to znaczne zanieczyszczenie szalki Petriego, ponieważ wraz z zarodkami zostanie uwolnione dużo tkanki, dlatego po tej procedurze warto użyć innej szalki Petriego.
   
   
3. Aby dostrzec zarodki, ustaw ostrość mikroskopu na kawałkach tłuszczu i szukaj okrągłego „kawałka tłuszczu” z wyraźnym okręgiem wokół niego.
   
   Uwaga: Zarodki wyglądają tak samo jak tłuszcz, więc ich odnalezienie  może być trudne. Zarodki opadają na dno, więc należy szukać ich w tym miejscu.
   
   
4. Wykonaj rozmazy pochwowe u samic biorców. Na tym etapie powinny one być w stanie pseudociąży.

Dyskusja

W niniejszym artykule przedstawiamy metodę pobierania oocytów od myszy z rodzaju Peromyscus po indukowanej owulacji (superowulacji). Stosowanie superowulacji (w przeciwieństwie do naturalnego cyklu rujowego) jest powszechne ze względu na znacznie większą liczbę uzyskiwanych komórek. Należy jednak zachować ostrożność przy interpretacji wyników z wykorzystaniem takich oocytów/embrionów, ponieważ zarówno hormony stosowane do indukcji owulacji, jak i sam proces hodowli mogą wywierać wpływ na badane obiekty.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igła do płukania	Narzędzie	Zephyrtronics	ZT5-130-L	30 G tępa
Pinceta (2)	Narzędzie	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5060
Peromyscus	Zwierzę	Peromyscus Genetic Stock Center
Nożyczki	Narzędzie	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Pożywka FHM buforowana HEPES	Odczynnik	Specialty Media	MR-025-d
Pożywka do hodowli embrionów KSOM (5x 10 mL)	Odczynnik	Specialty Media	MR-020P-5F
Pipeta ustna	Narzędzie			Wykonana z dociągniętych kapilar szklanych i przymocowana do gumowej rurki
Naczynie do trzymania oocytów	Narzędzie			Szklany pojemnik z wklęsłymi wgłębieniami