Artykuł metodologiczny

Analiza reakcji węchowych neuronów czuciowych myszy za pomocą zapisu elektroolfaktogramu w fazie powietrznej

DOI:

10.3791/1850

⸱

2 marca 2010

 ,  , 
1Biology, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapis elektroolfaktogramu (EOG) jest pouczającym, łatwym do przeprowadzenia i wiarygodnym sposobem oceny funkcji węchu na poziomie nabłonka węchowego. Protokół ten opisuje konfigurację zapisu, przygotowanie tkanek myszy, zbieranie danych i podstawową analizę danych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęta polegają na węchu w wielu kluczowych zachowaniach, takich jak znajdowanie źródeł pożywienia, unikanie drapieżników i identyfikowanie przedstawicieli tego samego gatunku do krycia i innych interakcji społecznych. Zapis elektroolfaktogramu (EOG) jest pouczającą, łatwą do przeprowadzenia i wiarygodną metodą oznaczania funkcji węchowej na poziomie nabłonka węchowego. Od czasu opisu EOG w 1956 roku przez Ottosona u żab1, zapis EOG został zastosowany u wielu kręgowców, w tym salamander, królików, szczurów, myszy i ludzi (przejrzane przez Scotta i Scotta-Johnsona, 2002, ref. 2). Ostatnie postępy w modyfikacji genetycznej u myszy ponownie rozbudziły zainteresowanie rejestracją EOG w celu fizjologicznej charakterystyki funkcji węchowych u myszy z nokautem i nokautem. Zapisy EOG zostały z powodzeniem zastosowane do wykazania centralnej roli komponentów transdukcji sygnału węchowego3-8, a ostatnio do scharakteryzowania udziału niektórych mechanizmów regulacyjnych w odpowiedziach OSN9-12.

Wykrywanie odorantu następuje na powierzchni nabłonka węchowego na rzęskach OSN, gdzie kaskada transdukcji sygnału prowadzi do otwarcia kanałów jonowych, generując prąd, który przepływa do rzęsek i depolaryzuje błonę13. EOG to ujemny potencjał zarejestrowany zewnątrzkomórkowo na powierzchni nabłonka węchowego po stymulacji odorantem, wynikający z sumy potencjalnych zmian spowodowanych przez poszczególne reagujące OSN w polu zapisu2. Porównanie amplitudy i kinetyki EOG dostarcza zatem cennych informacji na temat tego, jak modyfikacja genetyczna i inne manipulacje eksperymentalne wpływają na sygnalizację molekularną leżącą u podstaw odpowiedzi OSN na zapach.

Tutaj opisujemy zapis EOG w fazie powietrznej na preparacie małżowiny węchowej myszy. Krótko, po poświęceniu myszy, małżowiny węchowe są odsłaniane poprzez przecięcie głowy wzdłuż linii środkowej i usunięcie przegrody. Preparat małżowiny nosowej umieszcza się następnie w zestawie do nagrywania, a elektrodę rejestrującą umieszcza się na powierzchni nabłonka węchowego na jednej z małżowiny przyśrodkowej. Elektroda referencyjna jest elektrycznie połączona z tkanką za pomocą roztworu buforowego. Ciągły strumień nawilżonego powietrza jest wdmuchiwany po powierzchni nabłonka, aby utrzymać go wilgotnym. Opary roztworów nazapachowych są wdmuchiwane do strumienia nawilżonego powietrza w celu stymulacji nabłonka. Odpowiedzi są rejestrowane i digitalizowane w celu dalszej analizy.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Część 1. Konfiguracja nagrywania EOG

Aparatura rejestrująca składa się z elektrody rejestrującej, elektrody referencyjnej, rurki doprowadzającej powietrze, stolika na próbki i mikroskopu preparacyjnego, wszystkie zakotwiczone na stole powietrznym w klatce Faradaya. Mikromanipulatory służą do umieszczania elektrod i rurki doprowadzającej powietrze. Ciągły strumień powietrza jest przepuszczany przez wodę destylowaną w celu dodania wilgoci przed przejściem przez rurkę doprowadzającą powietrze i nad próbką. Jako powierzchnię montażową dla próbki stosuje się naczynie hodowlane o średnicy 60 mm wypełnione preparatem Sylgard na głębokość 6-8 mm. Studzienka i kanał są wydrążone w Sylgardzie w naczyniu montażowym, aby zapewnić środki do elektrycznego połączenia elektrody referencyjnej z próbką za pomocą zmodyfikowanego roztworu Ringera.

Elektroda nagrywająca i elektroda odniesienia są podłączone do wzmacniacza. Sygnały ze wzmacniacza przesyłane są do digitizera, a następnie do komputera. Oprogramowanie takie jak Axograph lub pClamp może być używane do kontrolowania protokołu stymulacji, rejestrowania sygnału i późniejszej analizy odpowiedzi. Oscyloskop podłączony za wzmacniaczem może być wygodny do monitorowania potencjału elektrycznego w czasie rzeczywistym podczas umieszczania elektrody rejestrującej oraz podczas nagrań EOG.

Dostarczanie bodźców zapachowych jest kontrolowane przez Picospritzer, który jest podłączony do tego samego komputera, który służy do akwizycji sygnału. Ciśnienie powietrza w Picospritzerze jest ustawione na 10 psi. Pojedynczy zbiornik powietrza i regulator mogą być używane do dostarczania powietrza zarówno do stołu powietrznego, jak i Picospritzera. Drugi zbiornik powietrza i regulator służą do dostarczania powietrza do nawilżonego strumienia powietrza, ponieważ wymaga to niższego ciśnienia i dużego przepływu powietrza. Tuż przed dostarczeniem bodźca zapachowego, wyjście Picospritzera jest podłączone do butelki z nawaniaczem. Butelka z nawaniaczem jest następnie podłączana do rurki doprowadzającej powietrze.

Część 2: Przygotowanie elektrod

Elektroda rejestrująca to chlorkowany srebrny drut w ciągniętej szklanej kapilarze wypełnionej zmodyfikowanym roztworem Ringera (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,4, filtr sterylizowany). Elektroda referencyjna to drut ze srebra chlorkowanego.

  1. Zamontuj srebrny drut w uchwycie elektrody. W przypadku elektrody rejestrującej z końca uchwytu elektrody powinien wystawać od jednego do dwóch centymetrów drutu. Na elektrodę odniesienia można pozostawić więcej drutu.
  2. Aby dodać powłokę AgCl do srebrnego drutu, umieść drut w 0.1 M NaCl i podłącz uchwyt elektrody do dodatniego zacisku źródła zasilania 1.5-9 V DC. Ujemny zacisk źródła zasilania powinien być elektrycznie podłączony do roztworu 0,1 M NaCl. Pozwól reakcji chlorowania postępować przez 10 minut. Aby wyrównać wszelkie ładunki elektrostatyczne między elektrodą rejestrującą a elektrodą odniesienia, należy na krótko zetknąć elektrody ze sobą przed zainstalowaniem ich na urządzeniu rejestrującym.
  3. Pociągnij szklaną kapilę za pomocą ściągacza do mikropipet. Otwór na końcu kapilary powinien mieć średnicę około 5-10 mikronów.
  4. Użyj diamentowego ołówka, aby naciąć i odłamać koniec kapilary, tak aby był o ~ 2 cm dłuższy niż srebrny drut. Wypoleruj odcięty koniec palnikiem butanowym.
  5. Rozpuść 0,5% agarozy w zmodyfikowanym roztworze Ringera. Wciągnąć niewielką ilość stopionego roztworu agarozy do końcówki elektrody za pomocą pipety transferowej.
  6. Napełnij naciągniętą kapilę w około 1/2 wysokości zmodyfikowanym roztworem Ringera (do tego celu przydatna jest strzykawka, która została podgrzana i wyciągnięta, aby mieć długi, cienki koniec). Delikatnie przesuń kapilarę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Przechowuj napełnioną elektrodę w słoiku do przechowywania z niewielką ilością zmodyfikowanego roztworu Ringera na dnie, aż będą gotowe do użycia. Gdy próbka tkanki jest przygotowana i gotowa do zapisu, zainstaluj wypełnioną kapilarnę na drucie elektrody rejestrującej.

Część 3: Przygotowanie roztworów odorantów

Substancje zapachowe, octan amylu i heptaldehyd, wywołują duże reakcje i dlatego są dobrym wyborem jako stymulanty EOG.

  1. W probówkach do mikrowirówek przygotować serię rozcieńczeń środka zapachowego w dimetylosulfotlenku (DMSO). Jako punkt wyjścia dla krzywej dawka-odpowiedź należy przygotować 10-krotne rozcieńczenia od 5 M do 5 x 10-6 M. Codziennie wykonuj świeże rozcieńczenia.
  2. Następnie rozcieńczyć substancje zapachowe 50-krotnie w wodzie, mieszając 100 μl rozcieńczonego bulionu w DMSO z 4,9 ml wody w butelkach o pojemności 2 uncji z silikonowymi korkami. Pozwól roztworom zrównoważyć się w butelkach przez co najmniej 30 minut. Należy pamiętać, że stężenie substancji zapachowych w parze w każdej butelce jest nieznane, ale będzie się różnić w zależności od stężenia substancji zapachowych w fazie ciekłej.
  3. Włóż dwie igły o rozmiarze 18 przez silikonowy korek, aby zapewnić porty wejściowe i wyjściowe. Porty powinny być zatkane, gdy butelka nie jest używana.

Część 4: Rejestrowanie EOG i analizowanie danych

  1. Złóż w ofierze mysz przez eutanazję CO2 lub przedawkowanie środka znieczulającego, a następnie ścięcie. Usuń skórę leżącą na czaszce i przetnij głowę na pół wzdłuż linii środkowej.
  2. Zamontuj jedną połowę głowicy, przyśrodkową stroną do góry, na czaszy montażowej. Ostrożnie usuń przegrodę, aby odsłonić małżowiny.
  3. Umieść naczynie z zamontowaną chusteczką na stoliku nagrywającym. Ustaw stolik tak, aby miejsce nagrywania na małżowinach było wyśrodkowane pod mikroskopem.
  4. Włącz zbiornik powietrza, aby dostarczyć nawilżone powietrze na powierzchnię małżowiny. Umieść rurkę doprowadzającą powietrze tak, aby znajdowała się w odległości około 10 mm od miejsca nagrywania. Natężenie przepływu wynosi ~600 mL/min.
  5. Ustaw amplifier w tryb DC (wzmocnienie AC wywoła artefakty w sygnale EOG) z filtrem dolnoprzepustowym na 1 kHz i wzmocnieniem na 100X.
  6. Zamontuj elektrody rejestrujące i referencyjne na mikromanipulatorach.
  7. Opuść elektrodę referencyjną do studzienki na czaszy montażowej i przykryj zmodyfikowanym roztworem Ringera tak, aby była elektrycznie połączona z tkanką.
  8. Ostrożnie opuścić elektrodę rejestrującą na powierzchnię małżowiny IIb lub III. Elektroda powinna ledwo dotykać powierzchni nabłonka węchowego! Gdy elektroda zetknie się z nabłonkiem (tj. zamknie obwód elektryczny), w oscyloskopie pojawi się prosta linia podstawowa.
  9. Przymocuj butelkę z nawaniaczem do bocznego portu na rurze doprowadzającej powietrze.
  10. Na komputerze zainicjuj protokół stymulacji. Częstotliwość próbkowania do akwizycji danych powinna wynosić 2 kHz lub więcej. Oprogramowanie uruchomi impuls zapachowy i rozpocznie nagrywanie.
  11. Typowym protokołem stymulacji może być pojedynczy impuls trwający 100 ms, sparowane impulsy 100 ms oddzielone 1-sekundowym interwałem lub 10-sekundowy impuls ciągły.
  12. Odczekaj trochę czasu między protokołami, aby tkanka była minimalnie przystosowana. Jedna minuta wystarcza dla ciekłych stężeń octanu amylu i heptaldehydu do 10-3 M; Przy wyższych stężeniach odczekaj 5 minut. Po dostarczeniu wysokich stężeń zapachu (np. na końcu krzywej dawka-odpowiedź) resztkowy zapach może pozostać w rurce. Umyj rurkę powietrzną 95% etanolem i wysusz przed kontynuowaniem z dodatkowymi próbkami tkanek.
  13. Oprogramowanie Axograph dostarcza narzędzi do pomiaru kluczowych parametrów sygnału EOG. Takie parametry obejmują amplitudę odpowiedzi, opóźnienie, czas do szczytu i stałe czasowe zakończenia. Pożądane może być cyfrowe filtrowanie ścieżek przy 25 Hz przed dalszą analizą.

Reprezentatywne wyniki

figure-protocol-1
Rysunek 1. Parametry do analizy EOG. Kilka parametrów EOG jest szczególnie przydatnych do porównywania odpowiedzi między myszami, w tym amplituda odpowiedzi, opóźnienie (czas między podaniem bodźca a rozpoczęciem odpowiedzi), czas narastania (czas między początkiem odpowiedzi a szczytem), czas do szczytu (czas od rozpoczęcia stymulacji do szczytu odpowiedzi), i stała czasowa zakończenia (τ, wyznaczona przez dopasowanie fazy rozpadu odpowiedzi do pojedynczego równania wykładniczego). W celu porównania parametrów kinetycznych, takich jak opóźnienie, czas narastania i stała czasowa zakończenia, zaleca się normalizację amplitudy szczytowej odpowiedzi przed analizą.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Reprezentatywne sygnały EOG w różnych protokołach stymulacji. (a) Przykłady EOG od myszy w odpowiedzi na stymulację rosnącym stężeniem octanu amylu. linia w górnej części panelu wskazuje czas i czas trwania stymulacji nawaniacza. Stężenia w legendzie są stężeniami ciekłego roztworu. (b) Zależność dawka-odpowiedź uśredniona od pięciu myszy. Słupki błędów to 95% przedziały ufności. Spadek amplitudy piku jest często obserwowany przy bardzo wysokich stężeniach zapachów. (c) Przykład EOG w odpowiedzi na stymulację parami impulsów. Pojedynczy krótki impuls nawaniacza wywołuje adaptację trwającą kilka sekund. (d) Przykład EOG w odpowiedzi na 10-sekundową ciągłą stymulację odorantem. EOG wykazuje odczulenie podczas ciągłej prezentacji substancji zapachowej.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przy konfiguracji opisanej w tym protokole, bodźce zapachowe na powierzchni nabłonka węchowego będą spójne między preparatami tkankowymi, co pozwoli na porównanie myszy typu dzikiego i zmutowanego, nawet jeśli dokładne stężenie i dynamika zapachu są nieznane. Kilka czynników, w szczególności miejsce nagrywania i natężenie przepływu nawilżonego powietrza, powoduje różnice w EOG. Należy zachować ostrożność, aby nagrywać z podobnych pozycji na tej samej małżowinie, aby zminimalizować różnice. Można to łatwo osiągnąć, konsekwentnie rejestrując z tej samej strony głowicy i utrzymując niezmieniony ślad mikroskopu, rurki doprowadzającej zapachy i mikromanipulatorów na stole powietrznym między próbkami tkanek. Ponadto próbki tkanek należy natychmiast po rozbiorze umieścić w nawilżonym strumieniu powietrza, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu tkanki.

Zapisy EOG na myszach można również przeprowadzić za pomocą aparatu do perfuzji cieczy na przygotowanych małżowinach7, 14, 15 myszy lub pozostawiając głowę nienaruszoną i wkładając elektrodę do małego otworu wywierconego nad małżowinami16, 17. Każda odmiana zapisu EOG ma swoje mocne strony: zapisy fazy powietrznej na preparatach tkankowych, jak opisano w tym protokole, wymagają minimalnej ilości ustawień i są najłatwiejsze do przeprowadzenia; nagrania z użyciem aparatu do perfuzji cieczy ułatwiają stosowanie odczynników farmakologicznych, chociaż hydrofobowy charakter wielu substancji zapachowych komplikuje dostarczanie zapachu; Wreszcie, nagrania, w których głowa pozostaje nienaruszona, mogą być wykorzystane w eksperymentach z "sztucznym wąchaniem", chociaż umieszczenie elektrod jest trudniejsze niż wtedy, gdy małżowiny są w pełni odsłonięte.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy były poddawane obróbce i eutanazji metodami zatwierdzonymi przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Yijun Songowi oraz członkom tri-laboratorium Hattar Kuruvilla Zhao z Wydziału Biologii Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa za rady i pomoc. Wspierane przez NIH przyznaje DC007395 i DC009946.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wyposażenierurki doprowadzającej powietrzena zamówienieLufa strzykawki 1 ml ze złączką T może być używana jako substytut
Sprzętdo stołu powietrznegoNewport Corp.LW3030B-OPT
Warner InstrumentsDP-301
Oprogramowanie do akwizycji komputerów i danychAxograph 4.9.2 na Apple MacintoshZaktualizowane wersje Axograph dla systemów Mac OS X i Windows są dostępne od http://axographx.com/.
PalnikbutanowyA crè ja brû lè e latarka działa dobrze
Sprzęt do digitizeraAxon InstrumentsDigidata 1322A
Sprzęt do preparacjiScienscopeSSZ
Sprzęt do mocowania elektrodAparat Harvarda64-1021
Magnetyczne urządzenia trzymające (12 mm)sprzętWorld Precision Instruments, Inc.Wyposażenie mikromanipulatorów M10
World Precision Instruments, Inc.M3301R M3301L
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument Co.P2000
Sprzęt oscyloskopowyTektronix, Inc.5110
Sprzęt Picospritzer IIIParker Hannifin Corporation
Sprzęt do rurek silikonowychNalge Nunc international
Sprzęt do etapu próbekWykonaneDo podniesienia czaszy montażowej można użyć dowolnego małego solidnego przedmiotu. Unieruchom naczynie plasteliną.
18 igieł do pomiaruBiosciences305195
2 uncje szklane butelkimateriałVWR international16152-201
Materiał szklanych kapilarWorld Precision Instruments, Inc.TW150F-6
Korki silikonowe rozmiar 16DmateriałChemwareD1069809
Materiał drutu srebrnegoWorld Precision Instruments, Inc.
Materiał SylGuard 184DowCorning SYLG184od World Precision Instruments
Odczynnik agarozowyInvitrogen15510-027
Odczynnik octanu amyluAldrichW504009
Odczynnik chlorku wapnia (CaCl2)odczynnikSigma-AldrichC-1016
Odczynnikdimetylosulfotlenku (DMSO)Sigma-AldrichD5879
Odczynnik HEPESFisher ScientificBP310
Odczynnik do heptaldehyduAldrichH2120
Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2+6H2O)odczynnikSigma-AldrichM9272
Odczynnik do przepływomierza chlorku sodu (NaCl)JT Baker3624-05
Gilmont InstrumentsGF-2260
Wykonane Sprzęt do wzmacniacza na zamówienie BD AGW1010

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ottoson, D. Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium. Acta Physiologica Scandinavica. 35, Suppl 122. 1-83 (1956).
  2. Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. The electroolfactogram: a review of its history and uses. Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).
  3. Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
  4. Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20, 69-81 (1998).
  5. Zhao, H. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279, 237-242 (1998).
  6. Wong, S. T. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27, 487-497 (2000).
  7. Munger, S. D. Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation. Science. 294, 2172-2175 (2001).
  8. Michalakis, S. Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping. J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).
  9. Buiakova, O. I. Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).
  10. Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1. J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).
  11. Song, Y. Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation. Neuron. 58, 374-386 (2008).
  12. Cygnar, K. D., Zhao, H. Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons. Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).
  13. Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem Senses. 33, 839-859 (2008).
  14. Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors". J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).
  15. Pinato, G. Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice. Chem Senses. 33, 397-404 (2008).
  16. Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. Regional distribution of rat electroolfactogram. J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).
  17. Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. Effects of air flow on rat electroolfactogram. Chem Senses. 25, 761-768 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

nab onek w chowy myszystymulacja w fazie gazowejpodawanie impuls w substancji zapachowychrozmieszczenie elektrody odniesieniarozmieszczenie elektrody rejestruj cejnawil ony przep yw powietrzawzmacnianie sygna uakwizycja danych

Powiązane artykuły