Rejestracja elektroolfaktogramu (EOG) jest informacyjną, łatwą do przeprowadzenia i niezawodną metodą oceny funkcji węchowych na poziomie nabłonka węchowego. Niniejszy protokół opisuje konfigurację układu rejestracyjnego, przygotowanie tkanek mysich, gromadzenie danych oraz podstawową analizę danych.
Artykuł metodologiczny
Analiza odpowiedzi neuronów sensorycznych węchu myszy z wykorzystaniem zapisu elektroolfaktogramu w fazie gazowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwierzęta polegają na węchu w wielu krytycznych zachowaniach, takich jak poszukiwanie źródeł pożywienia, unikanie drapieżników oraz identyfikacja osobników tego samego gatunku w celu kopulacji i innych interakcji społecznych. Rejestracja elektroolfaktogramu (EOG) jest informacyjną, łatwą do przeprowadzenia i wiarygodną metodą oceny funkcji węchowych na poziomie nabłonka węchowego. Od opisu EOG u żab przez Ottosona w 1956 roku1, rejestracja EOG była stosowana u wielu kręgowców, w tym u salamander, królików, szczurów, myszy i ludzi (przegląd Scott i Scott-Johnson, 2002, ref. 2). Ostatnie postępy w modyfikacjach genetycznych myszy odnowiły zainteresowanie rejestracją EOG w celu fizjologicznej charakterystyki funkcji węchowych u myszy z knock-outem i knock-inem. Rejestracje EOG z powodzeniem zastosowano do wykazania centralnej roli komponentów transdukcji sygnałów węchowych3-8, a w ostatnim czasie do charakterystyki wkładu określonych mechanizmów regulacyjnych w odpowiedziy OSN9-12.
Detekcja substancji zapachowych zachodzi na powierzchni nabłonka węchowego, na rzęskach neuronów receptorowych węchu (OSN), gdzie kaskada transdukcji sygnału prowadzi do otwarcia kanałów jonowych, generując prąd płynący do rzęsek i depolaryzujący błonę13. EOG to ujemny potencjał rejestrowany zewnątrzkomórkowo na powierzchni nabłonka węchowego po stymulacji substancją zapachową, będący wynikiem sumowania się zmian potencjału wywołanych przez poszczególne reagujące OSN w polu pomiarowym2. Porównanie amplitudy i kinetyki EOG dostarcza zatem cennych informacji o tym, jak modyfikacje genetyczne i inne manipulacje eksperymentalne wpływają na molekularne przesyłanie sygnałów leżące u podstaw odpowiedzi OSN na zapach.
W niniejszej pracy opisujemy rejestrację EOG w fazie gazowej na preparacie turbinatek węchowych myszy. W skrócie, po uśmierceniu myszy, turbinatek węchowe zostają odsłonięte poprzez przecięcie głowy wzdłuż linii środkowej i usunięcie przegrody nosowej. Następnie preparat turbinatek umieszcza się w układzie rejestrującym, a elektrodę rejestrującą przykłada się do powierzchni nabłonka węchowego jednej z turbinatek przyśrodkowych. Elektroda referencyjna zostaje połączona elektrycznie z tkanką za pomocą roztworu buforowego. Nad powierzchnią nabłonka przedmuchiwany jest ciągły strumień nawilżonego powietrza, aby utrzymać jego wilgotność. Opary roztworów substancji zapachowych są wdmuchiwane do strumienia nawilżonego powietrza w celu stymulacji nabłonka. Odpowiedzi są rejestrowane i digitalizowane do dalszej analizy.
Protokół
Część 1. Układ do rejestracji EOG
Aparat pomiarowy składa się z elektrody rejestrującej, elektrody odniesienia, rurki do doprowadzania powietrza, stolika do preparatów oraz mikroskopu stereoskopowego, a wszystko to jest zamocowane na stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya. Do pozycjonowania elektrod i rurki do doprowadzania powietrza wykorzystuje się mikromanipulatory. Ciągły strumień powietrza jest przepuszczany przez wodę destylowaną w celu nawilżenia, przed przejściem przez rurkę doprowadzającą i nad preparatem. Jako powierzchnia montażowa preparatu służy naczynie hodowlane o średnicy 60 mm, wypełnione Sylgardem do głębokości 6-8 mm. W Sylgardzie w naczyniu montażowym wykonano otwór i kanał, aby umożliwić elektryczne połączenie elektrody odniesienia z preparatem za pomocą zmodyfikowanego roztworu Ringera.
Elektroda rejestrująca oraz elektroda odniesienia są podłączone do wzmacniacza. Sygnały z wzmacniacza są przesyłane do digitalizatora, a następnie do komputera. Do sterowania protokołem stymulacji, rejestrowania sygnału oraz późniejszej analizy odpowiedzi można wykorzystać oprogramowanie takie jak Axograph lub pClamp. Podłączony za wzmacniacz oscyloskop może być przydatny do monitorowania potencjału elektrycznego w czasie rzeczywistym podczas umieszczania elektrody rejestrującej oraz w trakcie pomiarów EOG.
Podawanie bodźców zapachowych jest kontrolowane przez urządzenie Picospritzer, które jest podłączone do tego samego komputera, który służy do akwizycji sygnałów. Ciśnienie powietrza w urządzeniu Picospritzer zostało ustawione na 10 psi. Do zasilania powietrzem zarówno stołu pneumatycznego, jak i urządzenia Picospritzer można użyć jednej butli z powietrzem i jednego regulatora. Druga butla z powietrzem i regulator służą do dostarczania powietrza do nawilżonego strumienia powietrza, ponieważ wymaga on niższego ciśnienia i dużego przepływu powietrza. Bezpośrednio przed podaniem bodźca zapachowego wyjście urządzenia Picospritzer zostaje podłączone do butelki z substancją zapachową. Butelka z substancją zapachową jest następnie podłączona do rurki doprowadzającej powietrze.
Część 2: Przygotowanie elektrod
Elektrodą rejestrującą jest srebrowa elektroda chlorkowa w wyciągniętej kapilarze szklanej wypełnionej zmodyfikowanym roztworem Ringera (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1.5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4, sterylizowana przez filtr). Elektrodą odniesienia jest srebrowa elektroda chlorkowa.
- Zainstaluj srebrny drut w uchwycie elektrody. W przypadku elektrody rejestrującej z końca uchwytu powinno wystawać od jednego do dwóch centymetrów drutu. Dla elektrody odniesienia można pozostawić dłuższy odcinek drutu.
- Aby nanieść powłokę AgCl na srebrny drut, umieść drut w 0,1 M NaCl i podłącz uchwyt elektrody do bieguna dodatniego źródła prądu stałego o napięciu 1,5-9 V. Biegun ujemny źródła zasilania powinien być połączony elektrycznie z roztworem 0,1 M NaCl. Pozostaw reakcję chlorowania na 10 minut. Aby wyrównać ładunek statyczny między elektrodą rejestrującą a elektrodą odniesienia, krótko zetknij elektrody ze sobą przed zamontowaniem ich w aparaturze rejestrującej.
- Wytnij kapilarę szklaną za pomocą wyciągacza do mikropipet. Otwór na końcówce kapilary powinien mieć średnicę około 5-10 mikronów.
- Użyj rysika diamentowego, aby naciąć i odłamać tępy koniec kapilary tak, aby była ona o ok. 2 cm dłuższa od srebrnego drutu. Wygładź koniec cięcia za pomocą palnika butanowego.
- Rozpuść 0,5% agarozy w zmodyfikowanym roztworze Ringera. Za pomocą pipety transferowej zaciągnij niewielką ilość roztopionego roztworu agarozy do końcówki elektrody.
- Wypełnij wyciągniętą kapilarę w połowie zmodyfikowanym roztworem Ringera (do tego celu przydatna jest strzykawka, która została podgrzana i wyciągnięta tak, aby miała długi, cienki koniec). Delikatnie potrząśnij kapilarą, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Przechowuj wypełnione elektrody w słoiku z niewielką ilością zmodyfikowanego roztworu Ringera na dnie do momentu ich użycia. Gdy próbka tkanki zostanie przygotowana i będzie gotowa do rejestracji, zamontuj wypełnioną kapilarę na drucie elektrody rejestrującej.
Część 3: Przygotowanie roztworów substancji zapachowych
Substancje zapachowe, takie jak octan amylu i heptanal, wywołują silne odpowiedzi, dlatego stanowią odpowiedni wybór jako stymulanty w badaniach EOG.
- W probówkach do mikrowirówki przygotować szereg rozcieńczeń substancji zapachowej w dimetylosulfotlenku (DMSO). Jako punkt wyjścia dla krzywej dawka-odpowiedź przygotować rozcieńczenia dziesięciokrotne w zakresie od 5 M do 5 x 10-6 M. Każdego dnia należy przygotowywać świeże rozcieńczenia.
- Kolejno rozcieńczyć substancje zapachowe 50-krotnie w wodzie, mieszając 10 μL rozcieńczonego roztwoku zapasowego w DMSO z 4,9 mL wody w butelkach o pojemności 2 uncji z silikonowymi korkami. Pozostawić roztwory w butelkach na co najmniej 30 minut w celu osiągnięcia równowagi. Należy pamiętać, że stężenie par substancji zapachowych w każdej butelce jest nieznane, ale będzie zmieniać się w zależności od stężenia substancji zapachowych w fazie ciekłej.
- Przez silikonowy korek wprowadzić dwie igły o rozmiarze 18 G, aby stworzyć otwory wlotowy i wylotowy. Otwory powinny być zamknięte, gdy butelka nie jest używana.
Część 4: Rejestracja EOG i analiza danych
- Uśmierć mysz poprzez eutanazję CO2 lub przedawkowanie środka anestetycznego, a następnie przeprowadź dekapitację. Usuń skórę pokrywającą czaszkę i przedziel głowę strzałkowo wzdłuż linii środkowej.
- Umieść jedną połowę głowy stroną przyśrodkową do góry na tacy montażowej. Ostrożnie usuń przegrodę, aby odsłonić małżowiny nosowe.
- Umieść tacę z zamontowaną tkanką na stole rejestracyjnym. Ustaw stół tak, aby miejsce rejestracji na małżowinach znajdowało się w centrum pola widzenia mikroskopu.
- Otwórz zawór butli z powietrzem, aby dostarczyć nawilżone powietrze na powierzchnię małżowiny. Ustaw rurkę doprowadzającą powietrze w odległości około 10 mm od miejsca rejestracji. Przepływ wynosi ~60 mL/min.
- Ustaw wzmacniacz w trybie DC (wzmocnienie AC wywoła artefakty w sygnale EOG), z filtrem dolnoprzepustowym ustawionym na 1 kHz i wzmocnieniem 10X.
- Zamocuj elektrody rejestrujące i referencyjne w mikromanipulatorach.
- Opuść elektrodę referencyjną do otworu w tacy montażowej i zalej zmodyfikowanym roztworem Ringera tak, aby była ona połączona elektrycznie z tkanką.
- Ostrożnie opuść elektrodę rejestrującą na powierzchnię małżowiny IIb lub III. Elektroda powinna ledwo dotykać powierzchni nabłonka węchowego! W momencie zetknięcia elektrody z nabłonkiem (tzn. zamknięcia obwodu elektrycznego) na oscyloskopie pojawi się prosta linia bazowa.
- Podłącz butelkę z substancją zapachową do bocznego portu rurki doprowadzającej powietrze.
- W programie komputerowym uruchom protokół stymulacji. Częstotliwość próbkowania podczas akwizycji danych powinna wynosić 2 kHz lub więcej. Oprogramowanie wygeneruje impuls zapachowy i rozpocznie rejestrację.
- Typowy protokół stymulacji może obejmować pojedynczy impuls o czasie trwania 10 ms, pary impulsów 10 ms oddzielone 1-sekundowym odstępem lub impuls ciągły trwający 10 s.
- Zachowaj odpowiedni odstęp czasu między protokołami, aby tkanka była w minimalnym stopniu zaadaptowana. Jedna minuta jest wystarczająca dla stężeń ciekłych octanu amylu i heptaldehydu do 10-3 M; przy wyższych stężeniach odczekaj 5 minut. Po podaniu wysokich stężeń zapachowych (np. na końcu krzywej dawka-odpowiedź) w rurce może pozostać resztkowy zapach. Przemyj rurkę doprowadzającą powietrze 95% etanolem i osusz przed przystąpieniem do pracy z kolejnymi próbkami tkanek.
- Oprogramowanie Axograph udostępnia narzędzia do pomiaru kluczowych parametrów sygnału EOG. Parametry te obejmują amplitudę odpowiedzi, latencję, czas do osiągnięcia szczytu oraz stałe czasowe wygasania. Przed dalszą analizą zaleca się cyfrowe filtrowanie śladów przy 25 Hz.
Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Parametry analizy EOG. Kilka parametrów EOG jest szczególnie przydatnych do porównywania odpowiedzi między myszami, w tym amplituda odpowiedzi, latencja (czas między podaniem bodźca a początkiem odpowiedzi), czas narastania (czas między początkiem odpowiedzi a jej szczytem), czas do osiągnięcia szczytu (czas od rozpoczęcia stymulacji do szczytu odpowiedzi) oraz stała czasowa wygaszania (τ, wyznaczana poprzez dopasowanie fazy spadku odpowiedzi do pojedynczego równania wykładniczego). W przypadku porównywania parametrów kinetycznych, takich jak latencja, czas narastania i stała czasowa wygaszania, zaleca się normalizację amplitudy szczytowej odpowiedzi przed przystąpieniem do analizy.
Rysunek 2. Reprezentatywne sygnały EOG przy różnych protokołach stymulacji. (a) Przykłady EOG myszy w odpowiedzi na stymulację rosnącymi stężeniami octanu amylu. Czarna linia na górze panelu wskazuje czas i czas trwania stymulacji substancją zapachową. Stężenia w legendzie są stężeniami roztworu ciekłego. (b) Relacja dawka-odpowiedź uśredniona dla pięciu myszy. Słupki błędów przedstawiają 95% przedziały ufności. Spadek amplitudy szczytowej jest często obserwowany przy bardzo wysokich stężeniach substancji zapachowej. (c) Przykład EOG w odpowiedzi na stymulację podwójnym impulsem. Pojedynczy krótki impuls substancji zapachowej wywołuje adaptację trwającą kilka sekund. (d) Przykład EOG w odpowiedzi na 10-sekundową ciągłą stymulację substancją zapachową. EOG wykazuje desensytyzację podczas ciągłego podawania substancji zapachowej.
Dyskusja
Dzięki konfiguracji opisanej w niniejszym protokole, bodźce zapachowe na powierzchni nabłonka węchowego będą spójne pomiędzy preparatami tkanek, co pozwoli na porównanie myszy typu dzikiego i mutantów, mimo że dokładne stężenie i dynamika substancji zapachowych nie są znane. Kilka czynników, w szczególności miejsce rejestracji oraz szybkość przepływu nawilżonego powietrza, powoduje różnice w EOG. Należy zadbać o rejestrację z podobnych pozycji na tym samym prężnie rozwiniętym ornamentcie nosowym (turbinate), aby zminimalizować zmienność. Można to łatwo osiągnąć, rejestrując sygnały konsekwentnie z tej samej strony głowy oraz utrzymując stałe rozmieszczenie mikroskopu, rurki do podawania zapachu i mikromanipulatorów na stole pneumatycznym pomiędzy próbkami tkanek. Ponadto, po sekcji próbki tkanek należy natychmiast umieścić w strumieniu nawilżonego powietrza, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu tkanki.
Rejestrację EOG u myszy można również przeprowadzić przy użyciu aparatu do perfuzji cieczowej na przygotowanych błonach nosowych myszy7, 14, 15 lub pozostawiając głowę nienaruszoną i wprowadzając elektrodę przez mały otwór wywiercony nad błonami nosowymi16, 17. Każda z wariacji rejestracji EOG ma swoje zalety: rejestracje w fazie powietrznej na preparatach tkankowych, opisane w niniejszym protokole, wymagają minimalnych przygotowań i są najłatwiejsze do przeprowadzenia; rejestracje z użyciem aparatu do perfuzji cieczowej ułatwiają stosowanie odczynników farmakologicznych, choć hydrofobowa natura wielu substancji zapachowych utrudnia ich podawanie; wreszcie, rejestracje z nienaruszoną głową mogą być wykorzystywane w eksperymentach typu „sztuczne węszenie”, mimo że umiejscowienie elektrody jest trudniejsze niż w przypadku pełnej ekspozycji błon nosowych.
Oświadczenia
Myszy były obsługiwane i uśmiercane metodami zatwierdzonymi przez komisje ds. opieki i wykorzystania zwierząt (Animal Care and Use Committees) Uniwersytetu Johns Hopkins.
Podziękowania
Dziękujemy dr. Yijun Songowi oraz członkom zespołu trzech laboratoriów Hattar, Kuruvilla i Zhao w Departamencie Biologii Uniwersytetu Johns Hopkins za rady i pomoc. Wsparcie zapewniły granty NIH DC007395 i DC009946.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Rurka doprowadzająca powietrze | sprzęt | Własna konstrukcja | Jako zamiennik można zastosować korpus strzykawki o pojemności 1 mL z kształtką T | |
| Stół pneumatyczny | sprzęt | Newport Corp. | LW3030B-OPT | |
| Wzmacniacz | sprzęt | Warner Instruments | DP-301 | |
| Komputer i oprogramowanie do akwizycji danych | sprzęt | Axograph 4.9.2 na Apple Macintosh | Zaktualizowane wersje programu Axograph dla Mac OS X i Windows są dostępne pod adresem http://axographx.com/. | |
| Palnik butanowy | sprzęt | Dobrze sprawdza się palnik kuchenny (crème brûlèe) | ||
| Digitalizator | sprzęt | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Mikroskop sekcyjny | sprzęt | Scienscope | SSZ | |
| Uchwyt elektrody | sprzęt | Harvard Apparatus | 64-1021 | |
| Magnetyczne urządzenia mocujące (12 mm) | sprzęt | World Precision Instruments, Inc. | M10 | |
| Mikromanipulatory | sprzęt | World Precision Instruments, Inc. | M3301R M3301L | |
| Wyciągacz mikropipet | sprzęt | Sutter Instrument Co. | P2000 | |
| Oscyloskop | sprzęt | Tektronix, Inc. | 5110 | |
| Picospritzer III | sprzęt | Parker Hannifin Corporation | ||
| Rurki silikonowe | sprzęt | Nalge Nunc international | ||
| Stolik do preparatów | sprzęt | Własna konstrukcja | Do podniesienia naczynia montażowego można użyć dowolnego małego, stałego przedmiotu. Naczynie należy unieruchomić za pomocą plasteliny. | |
| Igły 18G | materiał | BD Biosciences | 305195 | |
| Szklane butelki 2 oz | materiał | VWR international | 16152-201 | |
| Kapilary szklane | materiał | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-6 | |
| Zatworki silikonowe rozmiar 16D | materiał | Chemware | D1069809 | |
| Drut srebrny | materiał | World Precision Instruments, Inc. | AGW1010 | |
| SylGuard 184 | materiał | Dow Corning | SYLG184 | Z World Precision Instruments |
| Agaroza | odczynnik | Invitrogen | 15510-027 | |
| Octan amylu | odczynnik | Aldrich | W504009 | |
| Chlorek wapnia (CaCl2) | odczynnik | Sigma-Aldrich | C-1016 | |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | odczynnik | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| HEPES | odczynnik | Fisher Scientific | BP310 | |
| Heptaldehyd | odczynnik | Aldrich | H2120 | |
| Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2+6H2O) | odczynnik | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Chlorek sodu (NaCl) | odczynnik | JT Baker | 3624-05 | |
| Przepływomierz | sprzęt | Gilmont Instruments | GF-2260 |
Bibliografia
- Ottoson, D. Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium. Acta Physiologica Scandinavica. 35, Suppl 122. 1-83 (1956).
- Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. The electroolfactogram: a review of its history and uses. Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20, 69-81 (1998).
- Zhao, H. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279, 237-242 (1998).
- Wong, S. T. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27, 487-497 (2000).
- Munger, S. D. Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation. Science. 294, 2172-2175 (2001).
- Michalakis, S. Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping. J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).
- Buiakova, O. I. Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).
- Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1. J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).
- Song, Y. Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation. Neuron. 58, 374-386 (2008).
- Cygnar, K. D., Zhao, H. Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons. Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem Senses. 33, 839-859 (2008).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors". J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).
- Pinato, G. Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice. Chem Senses. 33, 397-404 (2008).
- Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. Regional distribution of rat electroolfactogram. J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).
- Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. Effects of air flow on rat electroolfactogram. Chem Senses. 25, 761-768 (2000).
Przedruki i uprawnienia
