Tomato Analyzer: Przydatna aplikacja programistyczna do gromadzenia dokładnych i szczegółowych danych morfologicznych oraz kolorymetrycznych z obiektów dwuwymiarowych

Podsumowanie

Analizator Pomidorów (Tomato Analyzer, TA) w sposób powtarzalny i dokładny określa cechy dwuwymiarowych kształtów oraz koloru. Opisano procedurę krok po kroku w celu uzyskania wysokiej jakości zdigitalizowanych obrazów owoców pomidora, analizy morfologiczne i kolorystyczne tych obrazów oraz kilka zastosowań z wykorzystaniem danych generowanych przez to oprogramowanie.

Streszczenie

Obiektywny i powtarzalny pomiar morfologii oraz cech barwnych owoców upraw warzywnych i owocowych jest istotny dla szczegółowych analiz fenotypowych tych cech. Tomato Analyzer (TA) to program komputerowy, który w sposób półautomatyczny i powtarzalny mierzy 37 atrybutów związanych z kształtem dwuwymiarowym^1,2. Wiele z tych atrybutów, takich jak kąty na końcach dystalnych i proksymalnych owocu oraz powierzchnie wcięć, jest trudnych do ilościowego określenia metodą manualną. Atrybuty są zorganizowane w oprogramowaniu w dziesięciu kategoriach: Basic Measurement, Fruit Shape Index, Blockiness, Homogeneity, Proximal Fruit End Shape, Distal Fruit End Shape, Asymmetry, Internal Eccentricity, Latitudinal Section oraz Morphometrics. Ostatnia kategoria nie wymaga wcześniejszej wiedzy ani z góry określonych pojęć dotyczących atrybutów kształtu, zatem analiza morfometryczna stanowi obiektywną opcję, która może być lepiej dostosowana do analiz wysokoprzepustowych niż analiza atrybutów. TA oferuje również aplikację Color Test, która została zaprojektowana do gromadzenia pomiarów koloru z zeskanowanych obrazów oraz umożliwia kalibrację urządzeń skanujących przy użyciu wzorców kolorystycznych³.

TA oferuje kilka opcji eksportu i analizy danych dotyczących cech kształtu, morfometrii oraz koloru. Dane mogą być eksportowane do pliku Excel w trybie wsadowym (ponad 100 obrazów jednocześnie) lub eksportowane jako poszczególne obrazy. Użytkownik może wybrać wyjście wyświetlające średnią dla każdego atrybutu obiektów na każdym obrazie (wraz z odchyleniem standardowym) lub wyjście wyświetlające wartości atrybutów dla każdego obiektu na obrazie. TA okazało się wartościowym i skutecznym narzędziem do identyfikacji i potwierdzania loci cech ilościowych (QTL) kształtu owoców pomidora, a także do przeprowadzania szczegółowych analiz wpływu kluczowych genów kształtu owoców na morfologię rośliny. Ponadto TA może być wykorzystywane do obiektywnej klasyfikacji owoców do różnych kategorii kształtu. Wreszcie, za pomocą TA można oceniać cechy kształtu i koloru owoców u innych gatunków roślin, a także innych organów roślinnych, takich jak liście i nasiona.

Protokół

Oprogramowanie Tomato Analyzer (TA) zostało zaprojektowane do rozpoznawania obiektów o określonym rozmiarze i rozdzielczości obrazu, mierzonej w kropkach (pikselach) na cal (dpi). Oprogramowanie automatycznie wyznacza granice owoców na zeskanowanym obrazie. Granica obiektu jest określana poprzez śledzenie konturów, co skutkuje powstaniem listy sąsiadujących punktów opisujących obrys obiektu na obrazie. Wszystkie pomiary kształtu owoców są obliczane na podstawie tych granic. Moduł testu koloru „Tomato Analyzer Color Test” służy do ilościowej oceny parametrów barwy wewnątrz granic rozpoznanych przez oprogramowanie. Pomiary koloru opierają się na przestrzeni barw RGB: R (czerwony), G (zielony) i B (niebieski). Moduł testu koloru pobiera średnie wartości RGB dla każdego piksela, a następnie przekształca je do przestrzeni barw CIELAB, która wykorzystuje parametry L*, a*, b* do opisu koloru w sposób zbliżony do ludzkiej percepcji wzrokowej. Moduł testu koloru oblicza deskryptory barwy Hue (odcień) i Chroma (nasycenie) na podstawie wartości a* i b*.

Opisano szczegółowy protokół digitalizacji owoców pomidora oraz następującej po niej półautomatycznej analizy morfologii i cech koloru przy użyciu pakietu oprogramowania TA. Protokół podzielono na osiem etapów: 1) Wybór i przygotowanie materiału roślinnego, 2) Gromadzenie obrazów, 3) Instalacja oprogramowania, 4) Analiza obrazu i kalibracja dla testu TA Color Test, 5) Ręczna korekta cech, 6) Ustawienia definiowane przez użytkownika, 7) Zapisywanie i eksportowanie danych oraz 8) Przykłady analizy danych.

1. Wybór i przygotowanie materiału roślinnego

1. Owoce muszą być czyste i suche.
2. Owoce mięsiste nie powinny być przejrzałe, ponieważ ich mięknięcie może spowodować deformację kształtu podczas krojenia.
3. Owoce należy przekroić ostrym nożem z ząbkowanym ostrzem lub nową żyletką. W zależności od rodzaju analizy i ocenianych cech, owoce należy kroić wzdłużnie lub w poprzek przez środek. Analizę barwy można przeprowadzać na owocach przekrojonych wzdłużnie lub w poprzek, a także na innych przekrojach zaprojektowanych w celu uwydatnienia konkretnych cech.
4. Jeśli owoce są bardzo soczyste, należy osuszyć ich wnętrze, przykładając chusteczki higieniczne lub ręczniki papierowe.

2. Gromadzenie obrazów

1. Przekrój owoce i umieść je na skanerze stroną cięcia do dołu. Nad owocami umieść linijkę, a pod nimi etykietę. Linijka służy do weryfikacji, czy wybrano odpowiednią rozdzielczość skanowania i jest istotna dla dokładnego pomiaru cech owoców. W celu przeprowadzenia analizy danych wysokoprzepustowych niezbędne jest skanowanie owoców pochodzących tylko z jednej rośliny (lub genotypu) w jednym czasie oraz skanowanie owoców przekrojonych albo wzdłużnie, albo poprzecznie, bez mieszania obu tych typów na jednym skanie. Umieść owoce blisko siebie, unikając jednak ich stykania się. Należy również unikać pozostawiania dużych pustych przestrzeni między owocami na skanerze. Jeśli obiekty znajdują się zbyt daleko od siebie, obraz musi zostać poddany obróbce w oprogramowaniu do edycji obrazów, takim jak Adobe Photoshop lub GIMP, przed analizą w programie TA.
2. Ponieważ oprogramowanie TA wykorzystuje rozdzielczość obrazu do dokładnego pomiaru rozmiaru, właściwy wybór rozdzielczości skanowania jest istotny dla późniejszej analizy.
   1. Zasadniczo, jeśli obiekty mają rozmiar od 1 do 8 cm, należy skanować w rozdzielczości 200 lub 300 dpi (pixels/inch). Jeśli obiekty są > 8 cm, należy skanować w rozdzielczości 100 dpi. Dla bardzo małych obiektów (< 1 cm), takich jak nasiona, należy skanować w rozdzielczości 750 dpi lub wyższej. W przypadku planowania analizy seryjnej (patrz poniżej), gdy rozmiar owoców nie wykazuje dużej zmienności między różnymi roślinami, wygodnie jest wybrać jedno ustawienie rozdzielczości skanera dla wszystkich obrazów gromadzonych w ramach tego samego eksperymentu.
   2. W przypadku testu koloru (Color test), ustaw rozdzielczość skanera na 200 dpi, jeśli owoce mają rozmiar < 8 cm. Jeśli owoce są > 8 cm, skanuj w rozdzielczości 100 dpi. Ponadto ustaw rozmiar wyjściowy obrazu na najwyższą dostępną w skanerze liczbę kolorów.
3. Obiekty powinny być skanowane na czarnym lub bardzo ciemnym tle, aby zapobiec powstawaniu cieni, które zakłócałyby analizę. Ciemne tło można uzyskać, nakrywając skaner pudełkiem tekturowym w taki sposób, aby ograniczyć dostęp światła do ekranu. Jeśli zostanie użyte białe tło, program TA nie będzie działał, ponieważ aplikacja jest zoptymalizowana pod kątem ciemnego tła.
4. Obraz powinien zostać przycięty po wstępnym skanowaniu (przed zapisaniem pliku), aby uniknąć dużych pustych przestrzeni. Jeśli obraz nie zostanie przycięty na tym etapie, należy to zrobić za pomocą oprogramowania do edycji obrazów, takiego jak Adobe Photoshop lub GIMP, przed analizą w programie TA.
5. W przypadku analiz koloru (Color analyses) skaner będzie wymagał kalibracji, jeżeli użytkownik zamierza przekształcić wartości RGB na uniwersalną skalę L*, a* i b*. Skanowanie wzornika kolorów (Rycina 1) powinno odbyć się przed lub w trakcie skanowania owoców. Zeskanowany wzornik kolorów należy zapisać w tym samym folderze co obrazy owoców. Kalibracja skanera jest konieczna, ponieważ skanery różnią się sposobem przechwytywania danych o kolorach, a źródło światła może zmieniać się w czasie przy wielokrotnym użytkowaniu.
   1. Pozyskiwanie wzorców kolorów i skanowanie. Wzorce kolorów należy dobrać na podstawie szerokiego zakresu barw obserwowanych w badanej uprawie. W tym przykładzie wybraliśmy standardową tablicę odwzorowania 24 kolorów (ColorChecker, X-Rite, Grand Rapids, MI, Rycina 1). Zeskanuj wzornik kolorów w taki sam sposób, w jaki skanujesz owoce. Kalibracja skanera jest wyjaśniona w sekcji 4.7.
6. Zapisz zeskanowany obraz jako plik JPEG.
   Uwaga: Zachowaj ostrożność i precyzję podczas rozmieszczania obiektów na skanerze na etapie gromadzenia obrazów. Im lepiej obiekty będą wyrównane, tym mniej ręcznych korekt będzie wymaganych podczas analizy owoców w programie TA. Przykłady obrazów o niskiej i wysokiej jakości przedstawiono na Rycini 2.

3. Instalacja oprogramowania

1. Program Tomato Analyzer (TA) w wersji 2.2.0.0 można pobrać ze strony http://www.oardc.osu.edu/vanderknaap/tomato_analyzer.htm. Na tej stronie dostępne są również podręcznik użytkownika Tomato Analyzer oraz podręcznik testów kolorystycznych Tomato Analyzer.
2. TA wymaga systemu operacyjnego Windows (wersja 2000 lub nowsza).

4. Analiza obrazu i kalibracja dla testu kolorystycznego TA

1. Folder z obrazami musi znajdować się na dysku twardym, a nie w folderze „Moje dokumenty” ani na zdalnym serwerze. W przeciwnym razie program TA nie zapisze skorygowanych obrazów w tym samym folderze co obrazy oryginalne. Upewnij się, że skorygowane obrazy z rozszerzeniem .tmt znajdują się w tym samym folderze co oryginalne obrazy .jpg (patrz krok 6.1.1).
2. Uruchom program TA w taki sam sposób jak każdą inną aplikację programową, dwukrotnie klikając ikonę.
3. Użytkownik musi ustawić rozdzielczość dpi i jednostki pomiarowe na odpowiednie wartości, wybierając opcję „Scanner DPI” z menu „Settings”. Ustawienie dpi musi być zgodne z plikiem obrazu, aby pomiary rozmiarów (wysokość, szerokość, obwód, powierzchnia) były dokładne. Opcja „Units used” w oknie dialogowym określa jednostki (cm, mm, in lub piksele) dla wyjściowych danych. W tym samym oknie dialogowym może zajść potrzeba dostosowania jasności, gdy obiekty są stosunkowo ciemne.
   Uwaga: Rozdzielczość DPI i jednostki można dostosować również po wykonaniu korekt manualnych lub po analizie obrazu.
4. Użytkownik może wybrać atrybuty do zmierzenia, wybierając opcję „Measurement Saved” z menu „Setting”. Można to zrobić w dowolnym momencie w trakcie lub po analizie. Atrybuty są zgrupowane w dziesięciu kategoriach (tj. Basic Measurement, Fruit Shape Index, Blockiness, Homogenity, Proximal Fruit End Shape, Distal Fruit End Shape, Asymmetry, Internal Eccentricity, Latitudinal Section oraz Morphometrics). Pojedyncze atrybuty lub całe grupy pomiarowe można zaznaczyć lub odznaczyć, klikając w grupę lub atrybut. Wszystkie atrybuty danej grupy pomiarowej można wyświetlić, klikając znak „+”. Wybrane atrybuty są wyświetlane według kategorii w oknie w prawym dolnym rogu ekranu, jak pokazano na Rysunku 3.
5. Aby rozpocząć, kliknij przycisk „Open image” i wybierz plik obrazu z wyskakującego okna dialogowego. Wybrany obraz zostanie wyświetlony w lewym oknie.
6. Aby przeanalizować otwarty obraz, kliknij przycisk „Analyze”. Po zakończeniu obwód każdego owocu zostanie zaznaczony żółtą linią, a dane zostaną wyświetlone w prawym dolnym oknie danych. Oprogramowanie automatycznie odznaczy bardzo duże lub małe obiekty, takie jak linijka lub etykieta. Odznaczone obiekty zostaną zaznaczone niebieską linią. Dodatkowe owoce można odznaczyć, klikając prawym przyciskiem myszy na ich obraz. W oknie danych zostaną wyświetlone i wyeksportowane tylko elementy obrysowane na żółto (Rysunek 3). Elementy obrysowane na niebiesko nie zostaną uwzględnione w analizach. Pojedyncze obiekty są wyświetlane w prawym górnym oknie po kliknięciu ich lewym przyciskiem myszy.
   Uwaga: Dane z modułu testu koloru nie są wyświetlane w prawym dolnym oknie danych.
7. Przeanalizuj wzornik kolorów dla analizy koloru.
   1. Wzornik kolorów i zbieranie wartości L*, a*, b*. Otwórz zeskanowany obraz wzornika kolorów i przeprowadź analizę tak jak w przypadku owoców. Upewnij się, że program TA rozpoznaje każde pole jako obiekt do analizy (żółta granica). W przypadku korzystania ze standardowego wzornika kolorów oprogramowanie może nie rozpoznać ciemniejszych pasów. Kolory te nie zostaną uwzględnione w kalibracji. W menu Settings wybierz „Color Test”. Pojawi się okno dialogowe. Upewnij się, że wartości korekcyjne są ustawione na 1 dla nachylenia (lewe pola) i 0 dla punktu przecięcia z osią y (prawe pola). Minimalna wartość niebieskiego powinna zostać ustawiona na 0, a parametrami 1 i 2 można zignorować. Kliknij przycisk Analyze w oknie dialogowym testu koloru. Pojawi się nowe okno umożliwiające zapisanie wyników jako dokument „CSV”, który można otworzyć w programie EXCEL. Określ nazwę i katalog dla pliku danych. Wyjściowy plik danych będzie zawierał wartości RGB, wartości L*, a*, b* oraz obliczenia dla odcienia i chromatyczności dla każdego pola kolorystycznego.
   2. Wyznaczanie wartości korekcyjnych dla kalibracji. Nanieś wartości L*, a*, b* dla każdego pola kolorystycznego względem wartości kolorymetru dla L*, a* i b*, które są dostępne u producenta wzornika kolorów lub w Tabeli 1. Wyznacz równanie regresji i zapisz nachylenie oraz punkt przecięcia z osią y dla każdego parametru. W oknie dialogowym wprowadź odwrotność nachylenia i odwrotny znak wartości punktu przecięcia z osią y dla L*, a* i b*. Wartości te są używane jako wartości korekcyjne w ustawieniach „Color Test”.
8. Test koloru pozwala użytkownikowi zdefiniować dwa parametry raportujące proporcję (%) pikseli, które mieszczą się w wybranych zakresach wartości odcienia. Na przykład w przypadku analizy pomidorów wartości dolna i górna dla parametru 1 wynoszą odpowiednio 70 i 100, co odpowiada niepożądanemu żółtemu i zielono-żółtemu kolorowi miąższu. Wartości dolna i górna dla parametru 2 wynoszą 0 i 50 i odpowiadają pożądanemu kolorowi czerwonemu. Zapisz ustawienia dla tych wartości. Wartości te będą stosowane do wszystkich analizowanych obrazów aż do zamknięcia programu. W przypadku obrazów skanowanych wybierz opcję „Illuminant C 2°”. Opcja „Illuminant D65 10°” jest stosowana wyłącznie do obrazów pozyskanych w świetle naturalnym.
9. Wizualizacja wyników (patrz Rysunek 3): Każdy wiersz danych w prawym dolnym oknie danych odpowiada konkretnemu obiektowi na obrazie. Dane są wyświetlane w tej samej kolejności co obiekty na obrazie. Pierwszy wiersz wyświetla wartości dla obiektu w lewym górnym rogu, a ostatni wiersz danych wyświetla wartości dla obiektu w prawym dolnym rogu obrazu. Kliknij wiersz, aby wyświetlić odpowiadający mu owoc w górnym prawym oknie. Alternatywnie, kliknięcie w owoc spowoduje podświetlenie odpowiadającego mu wiersza danych. Klikając kartę atrybutu w prawym dolnym oknie, można sprawdzić, w jaki sposób dany atrybut jest mierzony dla każdego konkretnego owocu. Na przykład kliknięcie kąta końca dystalnego spowoduje wyświetlenie kąta zmierzonego przez oprogramowanie dla owocu w lewym oknie. Funkcja ta jest bardzo przydatna przy identyfikacji obiektów wymagających ręcznej korekty w celu uzyskania dokładniejszego pomiaru.
   Rysunek 4 przedstawia obraz do analizy za pomocą modułu Color test. Jednak wyniki nie są widoczne w oknie danych. Dostęp do danych jest możliwy jedynie w pliku Excel po zapisaniu analizy.

5. Ręczna korekta atrybutów

Czasami granice owocu oraz jego końce proksymalny i dystalny nie są prawidłowo rozpoznawane przez TA. Ponadto, jeśli owoce zostaną umieszczone na skanerze pod kątem, obraz musi zostać skorygowany w celu uzyskania prawidłowych pomiarów. Te oraz inne elementy mogą zostać poprawione poprzez ręczną korektę obrazów po wstępnej analizie. Dostępne opcje korekty znajdują się pod przyciskiem menu „Revise” i obejmują: Obróć (Rotate), Granica (Boundary), Koniec Proksymalny (Proximal End), Koniec Dystalny (Distal End), Auto-obrót (Auto-rotate), Dopasuj Elipsę (Adjust Ellipse), Dopasuj Wypukłość Dystalną (Adjust Distal Protrusion), Dopasuj Granicę Owocni (Adjust Pericarp Boundary), Domyślna Granica Owocni (Default Pericarp Boundary).

Uwaga: Jeśli wymagane są korekty, w pierwszej kolejności należy skorygować granicę, a następnie rotację. Wszystkie pozostałe korekty można wprowadzać w dowolnej kolejności po wykonaniu tych dwóch kroków. Korekta wybrana w menu Revise pozostaje zaznaczona do momentu wybrania innej opcji. Pozwala to użytkownikowi na wykonanie tej samej korekty na serii przekrojów poprzez kliknięcie obrazu przekroju i naciśnięcie przycisku Revise. Poniżej szczegółowo opisano manualne korekty różnych cech owoców.

1. Boundary (Obrys)
   1. Kliknij lewym przyciskiem myszy owoc w lewym oknie. Pojawi się on w prawym górnym oknie.
   2. Kliknij strzałkę obok przycisku „Revise” i wybierz opcję „Boundary” z listy rozwijanej w prawym górnym oknie. Wybierz miejsce obrysu do zmodyfikowania, klikając lewym przyciskiem myszy punkt początkowy i punkt końcowy błędnego obrysu. W rezultacie wyznaczony obrys zostanie usunięty.
   3. Aby dodać nowy obrys, klikaj lewym przyciskiem myszy od punktu początkowego w stronę punktu końcowego. Kontynuuj klikanie, aby podążać za pożądanym konturem. Kliknięcie prawym przyciskiem myszy cofnie poprzednią modyfikację. Wiele modyfikacji można cofnąć za pomocą kolejnych kliknięć prawym przyciskiem myszy.
   4. Aby zatwierdzić nowy obrys, naciśnij klawisz „Enter”. W przeciwnym razie naciśnij klawisz „Esc”, aby anulować tę operację.
   5. Kliknij „Reset Boundary”, aby powrócić do pierwotnych ustawień obrysu.
2. Rotate (Obrót). Tej funkcji używa się, gdy obiekt nie jest całkowicie pionowy.
   1. Kliknij odpowiedni owoc w lewym oknie. Pojawi się on w prawym górnym oknie.
   2. Kliknij strzałkę obok przycisku „Revise” i wybierz opcję „Rotate” z listy rozwijanej.
   3. W prawym górnym oknie zostanie wyświetlona oś. Przeciągnij zielony kwadrat na końcu osi, a owoc obróci się odpowiednio.
   4. Kliknij dwukrotnie wewnątrz okna lub naciśnij klawisz „Enter”, aby zakończyć.
   5. Kliknij „Reset Rotation”, aby powrócić do pierwotnego ustawienia.
3. Adjust proximal end (Korekta końca proksymalnego). Jeśli występuje błąd w pozycji końca proksymalnego, pomiary wynikające z tej funkcji będą nieprawidłowe. Wybierz owoc wymagający korekty, aby pojawił się w oknie po prawej stronie. Następnie wybierz zakładkę „Proximal fruit end shape” oraz opcję „Proximal angle micro or macro” w sekcji wyjściowej danych poniżej wybranego owocu. Kąty proksymalne zostaną teraz wyświetlone dla każdego owocu na obrazie po lewej stronie. W ten sposób można zidentyfikować kąty, które wydają się nietypowe. Aby zmienić pozycję końca proksymalnego, wykonaj następujące kroki:
   1. Kliknij pożądany owoc w lewym oknie. Pojawi się on w prawym górnym oknie.
   2. Kliknij strzałkę obok przycisku „Revise” i wybierz opcję „Proximal End” z listy rozwijanej.
   3. W prawym górnym oknie kliknij i przeciągnij wskaźnik wierzchołka do właściwej pozycji.
   4. Kliknij dwukrotnie lub naciśnij klawisz „Enter”, aby zakończyć.
4. Adjust distal end (Korekta końca dystalnego). Pozycję końca dystalnego obiektu można również zmienić ręcznie. Aby sprawnie znaleźć owoce wymagające korekty końca dystalnego, zastosuj tę samą procedurę co w przypadku końca proksymalnego.
   1. Kliknij pożądany owoc w lewym oknie. Pojawi się on w prawym górnym rogu.
      Kliknij strzałkę obok przycisku „Revise” i wybierz opcję „Distal End” z listy rozwijanej.
   2. W prawym górnym oknie kliknij i przeciągnij wskaźnik wierzchołka do właściwej pozycji.
   3. Kliknij dwukrotnie lub naciśnij klawisz „Enter”, aby zakończyć.
5. Distal end protrusion (Występ końca dystalnego). Funkcja ta pozwala użytkownikowi zdefiniować punkty końcowe na obrysie czubka.
   1. W zakładce „Distal Fruit End Shape” wybierz kolumnę oznaczoną jako „Distal End Protrusion” i wybierz obiekt do korekty.
   2. Kliknij strzałkę obok przycisku „Revise” i wybierz opcję „Adjust Distal Protrusion” z menu rozwijanego.
   3. Przeciągnij pojawiające się punkty do pożądanych pozycji wzdłuż obrysu.
   4. Naciśnij klawisz Enter, aby zakończyć. Pojawi się linia wskazująca odcięcie obszaru czubka, a obszar czubka zostanie przeliczony. Wyniki pojawią się w kolumnie „Distal End Protrusion”. Jeśli obszar czubka nie znajduje się w pożądanej pozycji, wybranie opcji „Reset Distal Protrusion” pod przyciskiem „Revise” zresetuje punkty do ich początkowych pozycji. Jeśli obszar czubka został znaleziony, ale nie powinien istnieć, wybranie opcji „Eliminate Distal Protrusion” z przycisku „Revise” przeniesie punkty na dół owocu, co poskutkuje wartością 0,0 w kolumnie „Distal End Protrusion”.
6. Auto-rotate (Auto-obrót). Funkcja ta została opracowana specjalnie dla nasion pomidora, aby można było je automatycznie wyrównać tak, by ich zaostrzone końce były skierowane w tym samym kierunku. Obecnie funkcja auto-obrotu nie działa dla innych obiektów, takich jak owoce.
7. Adjust ellipse (Korekta elipsy). Funkcja ta pozwala użytkownikowi zmienić rozmiar i/lub przenieść wewnętrzną elipsę w celu zdefiniowania wewnętrznych obszarów owocu. Atrybut ten jest wykorzystywany w funkcji Internal Eccentricity oraz dla atrybutu Fruit Shape Index Internal w programie TA.
   1. Wybierz zakładkę Internal Eccentricity, a następnie wybierz dowolną z kolumn w tej zakładce. Wybierz opcję „Default ellipse size” z menu „Settings”.
   2. Wybierz obiekt i kliknij przycisk „Revise”. Wybierz opcję „Adjust Ellipse” z menu rozwijanego.
   3. Pojawią się dwa punkty reprezentujące górny i lewy punkt elipsy. Przesunięcie obu tych punktów zmienia rozmiar i ponownie centruje elipsę względem dwóch nowych punktów.
   4. Po ustawieniu tych punktów w pożądanych pozycjach naciśnij klawisz Enter. Elipsa zostanie narysowana ponownie. Jeśli pozycja jest akceptowalna, naciśnij Enter ponownie, a wartości w kolumnach zostaną zaktualizowane.
   5. Jeśli wewnętrzna elipsa wymaga przeniesienia bez zmiany jej kształtu, kliknij w centrum obiektów, tam gdzie znajdowały się punkty. Pojawią się dwie linie i trzy zielone punkty. Przemieść punkt znajdujący się mniej więcej w centrum owocu w nowe miejsce, aby przenieść elipsę bez zmiany jej rozmiaru.
   6. Naciśnij Enter, aby zakończyć.
8. Adjust pericarp boundary (Korekta obrysu perykarpu). Funkcja ta pozwala użytkownikowi zdefiniować obszar perykarpu i musi być dostosowana, gdy w zakładce „Latitudinal section” wybrano opcje „Pericarp area” oraz „Pericarp thickness”.
   Uwaga: w przypadku owoców przejrzałych rozróżnienie perykarpu od pozostałej części owocu może być trudne lub niemożliwe.
   1. Wybierz obiekt i kliknij rozwijane menu „Revise”. Wybierz opcję „Default pericarp boundary” i ustaw domyślny obrys, który najlepiej pasuje do perykarpu.
   2. W celu dalszych korekt wybierz opcję „Adjust pericarp boundary” z rozwijanego menu „Revise”.
   3. W prawym górnym oknie wybierz miejsce obrysu perykarpu, które wymaga modyfikacji. Osiąga się to poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy punktu początkowego i punktu końcowego błędnego obrysu. W rezultacie wyznaczony obrys zostanie usunięty. Dla uzyskania najlepszych efektów za każdym razem należy wybierać jak najmniejszy odcinek obrysu.
   4. Aby dodać nowy obrys, klikaj lewym przyciskiem myszy od drugiego punktu z powrotem do pierwszego. Kontynuuj klikanie, aby podążać za pożądanym konturem. Kliknięcie prawym przyciskiem myszy cofnie poprzednią modyfikację. Wiele modyfikacji można cofnąć za pomocą kolejnych kliknięć prawym przyciskiem myszy.
      Uwaga: zbyt wiele modyfikacji obrysu perykarpu może doprowadzić do zawieszenia programu.
   5. Aby zatwierdzić nowy obrys, naciśnij klawisz „Enter”. W przeciwnym razie naciśnij klawisz „Esc”, aby anulować tę operację.
   6. Wybierz „Reset Pericarp Boundary”, aby przywrócić obrys do jego pierwotnej pozycji.
9. W przypadku analizy koloru, gdy obrys miąższu nie znajduje się na krawędzi obrazu owocu (np. przekrój poprzeczny na wysokości ramienia owocu, pokazujący skórkę owocu powyżej przekroju poprzecznego, jak pokazano na Rysunku 4), użytkownik musi otworzyć okno dialogowe „Color Test” w menu „Settings”. W tym oknie dialogowym minimalną wartość niebieskiego (blue value) należy ustawić na 30 i zapisać. Jeśli owoce mają wymiar < 3 cm, ustaw minimalną wartość niebieskiego na 20. Wartość ta może wymagać dalszej korekty, jeśli program TA ma trudności z odnalezieniem prawidłowych obrysów.

6. Ustawienia zdefiniowane przez użytkownika

W przypadku niektórych atrybutów użytkownik musi wybrać ustawienia, przy których należy przeprowadzić pomiar. Można to zrobić przed lub po analizie; zależy to od tego, czy eksperyment ma zostać powtórzony przy tych samych ustawieniach, które były stosowane wcześniej, czy też użytkownik chce przeprowadzić analizy wstępne w celu zdefiniowania odpowiedniego ustawienia dla nowej analizy.

1. Ustawianie kanciastości końca dystalnego i proksymalnego. Kanciastość jest obliczana jako stosunek szerokości w wybranej przez użytkownika proporcji wysokości najbliżej końca dystalnego/proksymalnego owocu do szerokości środkowej (Rysunek 5A). Pozwala to użytkownikowi wybrać lub zmienić miejsce na obiekcie, w którym dokonuje się pomiaru. Górną i dolną pozycję kanciastości można zmienić, wprowadzając nową wartość w polu „Blockiness position” pod przyciskiem „Setting”.
2. Ustawianie kątów mikro i makro. Ustawienia te służą do obliczania kątów w różnych pozycjach od końców owocu (Rysunek 5B). Ustawienie makro jest zazwyczaj stosowane dla kątów od 5 do 40% wzdłuż obrysu, a ustawienie mikro dla 2 do 10% wzdłuż obrysu.
3. Liczba punktów morfometrycznych. Funkcja ta znajduje punkty wzdłuż obrysu każdego obiektu na załadowanym obrazie. Końce dystalny i proksymalny służą jako punkty orientacyjne dla każdego obiektu na obrazie. Liczbę punktów mierzonych wzdłuż obrysu można wybrać w opcji „# of morphometric points” w menu „Settings”. Można wybrać od 4 do 30 punktów. Oprogramowanie automatycznie podzieli wybraną liczbę punktów na pół i równomiernie rozmieści je po obu stronach owocu pomiędzy końcami dystalnym a proksymalnym.

7. Zapisywanie i eksportowanie danych

1. Zapisywanie danych
   1. Po ręcznej korekcie obrazu i przeprowadzeniu analizy obrazu za pomocą TA, kliknij przycisk „Save Fruit”. Wszystkie aktualne informacje, w tym wprowadzone ręcznie poprawki oraz odznaczone obiekty, zostaną zapisane w nowym pliku o tej samej nazwie co obraz oryginalny, z rozszerzeniem .tmt. Przy każdym wyborze pliku, zapisany plik .tmt o tej samej nazwie zostanie otwarty automatycznie, ponieważ jest on powiązany z plikiem oryginalnym. Plik .tmt powinien być jednak przechowywany w tym samym folderze co plik obrazu jpg (patrz sekcja 4.1). Jeśli oprogramowanie nie zapisuje plików .tmt i .jpg w tym samym folderze, przenieś folder z obrazami na dysk C.
   2. Aby powrócić do oryginalnego pliku obrazu, bez żadnych wprowadzonych korekt, po prostu usuń powiązany plik .tmt. Alternatywnie można wybrać opcję „Analyze” i ponownie przeanalizować oryginalny obraz. Należy jednak pamiętać, że każdy plik .tmt o tej samej nazwie co obraz nadal będzie powiązany z tym obrazem przy następnym otwarciu pliku, chyba że korekty zostaną zapisane w pliku .tmt.
2. Eksport danych
   1. Użytkownik może wyeksportować dane dla pojedynczego obrazu, wybierając przycisk „Export”. Dane zostaną wyeksportowane do pliku Excel i będą zawierać wartości atrybutów dla każdego owocu, średnią oraz odchylenie standardowe.
   2. Aplikacja TA może również eksportować wartości atrybutów z dwóch lub więcej obrazów (funkcja „Batch Analysis”).
      1. Aby uruchomić analizę seryjną, kliknij przycisk „Open Image”.
      2. Wybierz pliki obrazów do analizy seryjnej. Wiele plików można wybrać, używając klawisza „Shift” lub „Ctrl” podczas zaznaczania kolejnych plików. Po wybraniu plików kliknij klawisz „Open”.
      3. Użytkownik zostanie poproszony o wybranie typu wyników analizy seryjnej: „Average Only”, „Average and Standard Deviation” lub „Individual Measurements per image”. Przykład dwóch trybów eksportu przedstawiono na Rysunku 6.
      4. Wybierz nazwę pliku Excel, który zostanie utworzony, i kliknij klawisz „Save”. Oprogramowanie automatycznie otworzy pliki i rozpocznie analizę seryjną. Jeśli pliki obrazów zostały wcześniej przeanalizowane i zapisane przez TA, do analizy seryjnej zostaną otwarte zapisane pliki .tmt. Jeśli pliki nie były wcześniej analizowane, oprogramowanie przeprowadzi analizę obrazów bez ręcznych korekt i odznaczeń. TA może przeprowadzić analizę seryjną co najmniej 100 obrazów w rozdzielczości 600 dpi.
      5. Analiza seryjna dla analizy koloru. Otwórz opcję „Color Test” w menu ustawień. Zaznacz „Batch Analysis” i kliknij „Analyze”. Pojawi się nowe okno wyboru obrazów do analizy. W następnym oknie określ nazwę i katalog pliku danych. Kliknij „Save”. Plik wynikowy będzie zawierał nazwę każdego obrazu (na podstawie nazwy pliku) oraz średnie wartości kolorów dla każdego owocu na obrazie. Parametry zawarte w wynikach to: parameter 1, parameter 2, wartości R, G i B, luminancja, wartości L*, a* i b* oraz wartości odcienia (hue) i nasycenia (chroma). Moduł testu koloru może przeprowadzić analizę seryjną do 100 obrazów owoców, w zależności od sprzętu komputerowego.

8. Przykłady analizy danych

Wyniki generowane przez TA mogą być wykorzystywane w wielu zastosowaniach. W badaniach genetycznych wyniki te służą do wykrywania QTL (Quantitative Trait Loci) kształtu owoców w kilku populacjach segregujących, pochodzących z krzyżówek między różnymi odmianami uprawnymi pomidora (S. lycopersicum) a dzikim gatunkiem S. pimpinellifolium (akcesja LA1589)^1,4,5. TA może być również wykorzystywany do klasyfikacji owoców w kategoriach kształtu⁶ oraz do analizy odbarwień skórki owoców pomidora spowodowanych zaburzeniem fizjologicznym znanym jako „żółty bark”³. Ponadto oprogramowanie to było stosowane do analizy innych organów roślin, takich jak liście⁷ i nasiona^8,9.

9. Reprezentatywne wyniki

Wyniki TA były wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań. W badaniach QTL kształtu owoców zebrano obrazy owoców (od 8 do 10 owoców z rośliny na jednym obrazie) z łącznie 96 do 130 roślin w każdej populacji. Następnie obrazy te zostały przeanalizowane za pomocą TA^4,5. Aby wykryć powiązania między fenotypami a genotypami, analizy QTL przeprowadzono z wykorzystaniem mapowania przedziałowego złożonego (composite interval mapping)^10,11 oraz wielocechowego mapowania przedziałowego złożonego (multitrait composite interval mapping) dla podzbiorów cech w każdej populacji¹². W rezultacie zidentyfikowano wiele regionów genomu pomidora kontrolujących kształt owoców. Niektóre z tych regionów występowały w kilku populacjach, podczas gdy inne były unikalne dla jednej populacji. Podczas gdy niektóre QTL kształtu owoców (takie jak ovate, sun i fs8.1) były znane z wcześniejszych badań mapowania, odkryto kilka innych nowych loci. Łącznie w trzech populacjach segregujących wykryto od 17 do 36 QTL kontrolujących cechy kształtu owoców^2,4.

Dane wygenerowane przez TA zostały poddane analizie za pomocą analizy głównych składowych (PCA). W jednym z badań piętnaście cech kształtu poddano analizie PCA, a następnie trzy pierwsze składowe główne (PC) zmapowano jako cechy. Dane wykazują, że QTL składowych głównych (PC QTL) pokrywały się z QTL poszczególnych cech, które przyczyniały się do danej składowej⁴. Populacje segregujące zostały również wykorzystane do porównania QTL zidentyfikowanych za pomocą morfometrii z QTL zidentyfikowanymi na podstawie cech kształtu. Ponownie wykazano, że QTL morfometryczne pokrywały się z QTL kontrolującymi cechy kształtu i wielkości owoców w 93% przypadków². Wyniki te jednoznacznie potwierdzają poprawność i powtarzalność danych generowanych przez TA w analizie morfologii owoców.

Kolejnym zastosowaniem TA jest stworzenie systemu klasyfikacji kształtu owoców w celu identyfikacji odmian pomidora na podstawie obiektywnych pomiarów kształtu owocu. Przeanalizowano kolekcję zasobów genowych obejmującą około 350 akcesji pomidora o zróżnicowanym pochodzeniu i morfologii owoców. Około ośmiu owoców z każdej rośliny zostało zdigitalizowanych i przeanalizowanych za pomocą TA. Dwa istniejące systemy klasyfikacji, IPGRI¹³ oraz UPOV¹⁴, zostały ocenione i porównane poprzez wizualne zestawienie z obrazami owoców w naszej kolekcji. Zmodyfikowaliśmy klasyfikację morfologiczną tych dwóch systemów, łącząc kilka kategorii i tworząc dwie nowe⁶. Zaproponowane kategorie to: spłaszczony, okrągły, długi, prostokątny, odwrotnojajowaty, elipsoidalny, sercowaty oraz wołowe serce. Osiem nowych kategorii zaadaptowanych z systemów IPGRI¹³ oraz UPOV¹⁴ jest bardziej rozróżnialnych wizualnie i zostało przetestowanych przy użyciu pomiarów TA. Wyniki TA obejmujące 37 atrybutów dla każdej akcesji poddano analizie PCA oraz liniowej analizie dyskryminacyjnej (LDA), aby zidentyfikować pomiary najlepiej definiujące każdą kategorię kształtu owoców, a także aby ocenić, jak dokładnie atrybuty dyskryminujące wyjaśniają klasyfikację wizualną każdej akcesji. Jednym z możliwych zastosowań tego systemu klasyfikacji kształtu owoców byłoby wykorzystanie wyników TA do grupowania akcesji na podstawie danych fenotypowych oraz identyfikacji powiązań między różnymi kategoriami kształtu owoców.

Moduł Test Koloru w programie TA został porównany z pomiarami koloru wykonanymi kolorymetrem (CR300) w populacji inbred backcross (IBC) pochodzącej z krzyżówek odmian przetwórczych S. lycopersicum³. Wartości L*, a* i b* z kolorymetru były porównywalne z wartościami koloru uzyskanymi za pomocą trzech różnych skanerów z TA. Zaobserwowano jednak różnice między trzema skanerami wynikające z różnic w sprzęcie, oprogramowaniu lub niestandardowych wartościach RGB. W związku z tym w Teście Koloru wprowadzono opcję wprowadzania wartości korekcyjnych w celu kalibracji skanerów. W badaniu genetycznym z wykorzystaniem Testu Koloru z TA wariancja genetyczna dla koloru i jednolitości koloru była znacznie wyższa niż w przypadku uzyskania tych wartości za pomocą kolorymetru. Różnice te wynikają z faktu, że TA mierzy parametry koloru całej powierzchni, podczas gdy kolorymetr analizuje tylko kilka punktów na powierzchni. Na koniec przetestowano TA, który wykazał zdolność do analizy koloru i jednolitości koloru w innych uprawach, takich jak ziemniak, ogórek, melon miodowy i truskawka³.

Rysunek 1. Standardowy wzornik kolorów dla modułu testu koloru służący do kalibracji wartości kolorów uzyskanych z różnych skanerów oraz w różnych odstępach czasu.

Rycina 2. Do prawidłowego funkcjonowania TA wymagane są wysokiej jakości zdigitalizowane obrazy. A) Przykład obrazu niskiej jakości. TA będzie próbować zlokalizować obiekty w całym obrazie. W przypadku występowania dużych pustych przestrzeni, takich jak tutaj, TA może nie działać prawidłowo lub ulec awarii. Niektóre owoce nie zostały osuszone, a sok na ekranie skanera uniemożliwi TA rozpoznanie prawidłowej granicy owocu. Ponadto, gdy większość owoców jest błędnie zorientowana w pionie, wiele atrybutów nie zostanie obliczonych poprawnie. Obrazy słabej jakości znacznie spowolnią analizę kształtu owoców ze względu na konieczność wprowadzenia rozległych korekt ręcznych przed rozpoczęciem analizy. B) Przykład obrazu wysokiej jakości. Owoce są prawidłowo zorientowane w pionie, rozmieszczone blisko siebie, ale nie stykają się i zostały osuszone.

Rysunek 3. Zrzut ekranu oprogramowania TA. Górne okno pokazuje przyciski kilku dostępnych narzędzi (np. otwórz obraz, zapisz owoc, eksportuj dane, dopasuj rozmiar, analizuj i popraw). Obiekt w prawym górnym oknie został wybrany do ręcznej korekty, a dane są wyświetlane w prawym dolnym oknie. Wartości dla tego owocu są wyróżnione na szaro w prawym dolnym oknie danych. Obiekty obrysowane na żółto w lewym oknie zostaną uwzględnione w analizach, natomiast obiekty obrysowane na niebiesko nie zostaną w nich uwzględnione.

Rysunek 4. Obraz wykorzystany w aplikacji Tomato Analyzer - Color Test.

Rycina 5. Ustawienia definiowane przez użytkownika. A) Atrybuty kanciastości. Górna pozycja służy do obliczania kanciastości i atrybutów trójkąta w części proksymalnej. Ustawienie dla pozycji górnej (Upper position) określa miejsce pomiaru X (=10% na rysunku). Dolna pozycja służy do obliczania kanciastości i atrybutów trójkąta w części dystalnej. Ustawienie dla pozycji dolnej (Lower position) określa miejsce pomiaru Y (=90% na rysunku). Wartości tych pozycji odpowiadają procentowi wysokości liczony od szczytu owocu. B) Atrybuty kątów makro. Zielone linie reprezentują procent (=20% na rysunku) wzdłuż krawędzi od końca (czarny kwadrat na rysunku), w którym mierzony będzie kąt. Oprogramowanie wyznaczy nachylenie, korzystając z zakresu +/- 5% wybranej wartości. W przypadku kątów mikro oprogramowanie wyznaczy nachylenie, korzystając z zakresu +/- 2% wybranej wartości.

Rysunek 6. Przykład danych wyjściowych uzyskanych za pomocą narzędzia Export z obrazu przedstawionego na Rysunku 3. A) Wyniki przedstawiające wartości cech dla każdego owocu, średnią oraz odchylenie standardowe. B) Wyniki przedstawiające średnie wartości cech i odchylenie standardowe dla 10 odmian pomidora.

	L*	a*	b*
1	37.986	13.555	14.059
2	65.711	18.13	17.81
3	49.927	-4.88	-21.925
4	43.139	-13.095	21.905
5	55.112	8.844	-25.399
6	70.719	-33.397	-0.199
7	62.661	36.067	57.096
8	40.02	10.41	-45.964
9	51.124	48.239	16.248
10	30.325	22.976	-21.587
11	72.532	-23.709	57.255
12	71.941	19.363	67.857
13	28.778	14.179	-50.297
14	55.261	-38.342	31.37
15	42.101	53.378	28.19
16	81.733	4.039	79.819
17	51.935	49.986	-14.574
18	51.038	-28.631	-28.638
19	96.539	-0.425	1.186
20	81.257	-0.638	-0.335
21	66.766	-0.734	-0.504
22	50.867	-0.153	-0.27
23	35.656	-0.421	-1.231
24	20.461	-0.079	-0.973

Tabela 1. Wartości L*, a*, b* dla każdego pola wzornika kolorów (patrz Rysunek 1). Jako źródło oświetlenia zastosowano D50, a kąt obserwacji wynosił 2°.

Dyskusja

Wysokoprzepustowa i dokładna ocena morfologii oraz koloru organów roślin jest trudna ze względu na ilościowy charakter tych cech i często subiektywny sposób ich kwantyfikacji. TA zapewnia obiektywne i dokładne pomiary kilku morfologicznych i kolorymetrycznych cech owoców w sposób wysokoprzepustowy i półautomatyczny. Użyteczność TA została wykazana w badaniach, które doprowadziły do identyfikacji QTL kształtu owoców pomidora^2,4,5. Ponadto, z wykorzystaniem wyników z TA przeprowadzono klasyfikację odmian6 oraz ocenę taksonomii grupy gatunków^15,16. Wysoka ekspresja genu kształtu owoców pomidora SUN prowadzi do powstania wydłużonych owoców¹⁷. Przy użyciu TA określono kształt liści i liści zakotwiczeniowych w liniach wykazujących wysoki poziom ekspresji SUN⁷, co dowiodło, że aplikacja może być skutecznie wykorzystywana również do pomiaru morfologii innych organów roślin. Co więcej, TA odegrała kluczową rolę w identyfikacji podłoża genetycznego wielkości nasion u pomidora i słonecznika^8,9. Na koniec, moduł Color Test zaimplementowany w TA jest bardziej precyzyjny, dokładny i tańszy niż inne metody analizy koloru owoców pomidora. Podsumowując, TA stała się kluczowym narzędziem do obiektywnej i wiarygodnej oceny zmienności morfologicznej i kolorystycznej organów roślin.