Analizator pomidorów: przydatna aplikacja do zbierania dokładnych i szczegółowych danych morfologicznych i kolorymetrycznych z obiektów dwuwymiarowych

Podsumowanie

Analizator pomidorów (TA) określa ilościowo atrybuty dwuwymiarowych kształtów i koloru w powtarzalny i dokładny sposób. Opisano krok po kroku procedurę uzyskiwania wysokiej jakości cyfrowych obrazów owoców pomidora, analizy morfologiczne i kolorystyczne tych obrazów oraz kilka aplikacji wykorzystujących dane wygenerowane przez to oprogramowanie.

Streszczenie

Pomiar morfologii owoców i cech kolorystycznych warzyw i owoców w obiektywny i powtarzalny sposób jest ważny dla szczegółowych analiz fenotypowych tych cech. Tomato Analyzer (TA) to program, który mierzy 37 atrybutów związanych z dwuwymiarowym kształtem w sposób półautomatyczny i powtarzalny^1,2. Wiele z tych atrybutów, takich jak kąty na dystalnych i proksymalnych końcach owocu oraz obszary wgłębień, są trudne do ręcznego określenia ilościowego. Atrybuty są zorganizowane w dziesięciu kategoriach w oprogramowaniu: Pomiar podstawowy, Indeks kształtu owoców, Blokowość, Jednorodność, Kształt proksymalnego końca owocu, Dystalny kształt końca owocu, Asymetria, Ekscentryczność wewnętrzna, Przekrój równoleżnikowy i Morfometria. Ostatnia kategoria nie wymaga ani wcześniejszej wiedzy, ani z góry ustalonych pojęć na temat atrybutów kształtu, więc analiza morfometryczna oferuje bezstronną opcję, która może być lepiej dostosowana do analiz wysokoprzepustowych niż analiza atrybutów. TA oferuje również aplikację Color Test, która została zaprojektowana do zbierania pomiarów kolorów z zeskanowanych obrazów i umożliwia kalibrację urządzeń skanujących przy użyciu standardów kolorów³.

TA oferuje kilka opcji eksportu i analizy danych atrybutów kształtu, morfometrii i kolorów. Dane mogą być eksportowane do pliku Excel w trybie wsadowym (ponad 100 obrazów jednocześnie) lub eksportowane jako pojedyncze obrazy. Użytkownik może wybrać między wyjściem, które wyświetla średnią dla każdego atrybutu dla obiektów na każdym obrazie (w tym odchylenie standardowe), a wyjściem, które wyświetla wartości atrybutów dla każdego obiektu na obrazie. TA jest cennym i skutecznym narzędziem do identyfikacji i potwierdzania loci cech ilościowych (QTL) kształtu owoców pomidora, a także do przeprowadzania dogłębnych analiz wpływu kluczowych genów kształtu owoców na morfologię roślin. TA może być również używana do obiektywnego klasyfikowania owoców w różnych kategoriach kształtu. Wreszcie, za pomocą TA, można ocenić kształt i kolor owoców u innych gatunków roślin, a także innych organów roślinnych, takich jak liście i nasiona.

Protokół

Oprogramowanie Tomato Analyzer (TA) jest przeznaczone do rozpoznawania obiektów o określonej wielkości i rozdzielczości obrazu, mierzonej w punktach (pikselach) na cal (dpi). Oprogramowanie automatycznie określa granice owoców na zeskanowanym obrazie. Granica obiektu jest określana za pomocą obrysowywania konturów, w wyniku czego powstaje lista sąsiadujących punktów opisujących granicę obiektu na obrazie. Wszystkie wymiary kształtu owoców są obliczane na podstawie granic. Moduł testu kolorów "Tomato Analyzer Color Test" jest przeznaczony do ilościowego określania parametrów koloru w granicach rozpoznawanych przez oprogramowanie. Pomiary kolorów są oparte na przestrzeni kolorów RGB: R (czerwony), G (zielony) i B (niebieski). Średnie wartości RGB dla każdego piksela są pobierane przez moduł Color test, a następnie przekształcane w przestrzeń kolorów CIELAB, która wykorzystuje L*, a*, b* do opisania koloru w sposób zbliżony do ludzkiej percepcji wzrokowej. Moduł testu kolorów oblicza deskryptory kolorów Barwa i Chroma na podstawie a* i b*.

Opisano krok po kroku protokół digitalizacji owoców pomidora i późniejszej półautomatycznej analizy morfologii i atrybutów koloru za pomocą pakietu oprogramowania TA. Protokół podzielony jest na osiem kroków: 1) Wybór i przygotowanie materiału roślinnego, 2) Zbieranie obrazów, 3) Instalacja oprogramowania, 4) Analiza obrazu i kalibracja do testu koloru TA, 5) Ręczna regulacja atrybutów, 6) Ustawienia zdefiniowane przez użytkownika, 7) Zapisywanie i eksport danych oraz 8) Przykłady analizy danych.

1. Wybór i przygotowanie materiału roślinnego

1. Owoce muszą być czyste i suche.
2. Mięsiste owoce nie powinny być przejrzałe, ponieważ zmiękczenie może spowodować deformację kształtu podczas krojenia owoców.
3. Pokrój owoce ostrym ząbkowanym nożem lub nową żyletką. W zależności od rodzaju analizy i atrybutów, które mają być oceniane, owoce należy kroić wzdłużnie lub poprzecznie przez środek. Analizę kolorystyczną można zastosować do owoców ciętych wzdłużnie lub poprzecznie, a także innych sekcji mających na celu podkreślenie określonych cech.
4. Osusz wewnętrzną część owocu, osuszając go chusteczką lub ręcznikiem papierowym, jeśli owoc jest bardzo soczysty.

2. Kolekcja obrazów

1. Pokrój owoce i umieść na skanerze ściętą stroną do dołu. Umieść linijkę powyżej i etykietę pod owocem. Linijka służy do sprawdzania, czy wybrano prawidłową rozdzielczość skanowania i jest ważna dla dokładnego pomiaru atrybutów owoców. W celu wysokoprzepustowej analizy danych konieczne jest skanowanie owoców tylko z jednej rośliny (lub genotypu) na raz oraz skanowanie owoców, które są cięte wzdłużnie lub poprzecznie, ale nie są mieszanką obu tych elementów na tym samym skanie. Umieść owoce blisko siebie, ale unikaj dotykania sąsiednich owoców. Unikaj również dużych pustych przestrzeni między owocami na skanerze. Jeśli obiekty są zbyt daleko od siebie, obraz musi zostać zmanipulowany za pomocą oprogramowania do obrazowania, takiego jak Adobe Photoshop lub GIMP przed analizą za pomocą TA.
2. Ponieważ oprogramowanie TA wykorzystuje rozdzielczość obrazu do dokładnego pomiaru rozmiaru, właściwy dobór rozdzielczości skanowania jest ważny dla późniejszej analizy.
   1. Z reguły, jeśli obiekty znajdują się w odległości od 1 do 8 cm, skanuj w rozdzielczości 200 lub 300 dpi (pikseli/cal). Jeśli obiekty znajdują się > 8 cm, skanuj w rozdzielczości 100 dpi. W przypadku bardzo małych (< 1 cm) obiektów, takich jak nasiona, skanuj w rozdzielczości 750 dpi lub wyższej. Gdy planowana jest analiza partii (patrz poniżej), a wielkość owoców nie jest bardzo zmienna w zależności od rośliny, wygodnie jest wybrać jedno ustawienie rozdzielczości skanera dla wszystkich obrazów, które mają być zbierane w tym samym eksperymencie.
   2. W przypadku testu koloru ustaw rozdzielczość skanera na 200 dpi, jeśli owoce mają < 8 cm. Jeśli owoce mają >8 cm, zeskanuj je w rozdzielczości 100 dpi. Ustaw również rozmiar obrazu wyjściowego na najwyższą liczbę kolorów dostępną w skanerze.
3. Obiekty powinny być skanowane na czarnym lub bardzo ciemnym tle, aby zapobiec cieniom, które będą przeszkadzać w analizie. Ciemne tło można uzyskać, umieszczając kartonowe pudełko nad skanerem tak, aby całe światło było ograniczone do ekranu. Jeśli używane jest białe tło, TA nie będzie działać, ponieważ aplikacja jest zoptymalizowana pod kątem korzystania z ciemnego tła.
4. Obraz powinien zostać przycięty po początkowym skanowaniu (przed zapisaniem obrazu), aby uniknąć dużych pustych przestrzeni. Jeśli obraz nie zostanie przycięty na tym etapie, należy go przyciąć za pomocą oprogramowania do obrazowania, takiego jak Adobe Photoshop lub GIMP przed analizą za pomocą TA.
5. W przypadku analiz kolorystycznych skaner będzie musiał zostać skalibrowany, jeśli użytkownik zamierza przetłumaczyć wartości RGB na uniwersalną skalę L*, a* i b*. Skanowanie wzornika kolorów (rysunek 1) powinno nastąpić przed lub w trakcie skanowania owoców. Zeskanowany wzornik kolorów powinien być zapisany w tym samym folderze, co obrazy owoców. Kalibracja skanera jest konieczna, ponieważ skanery różnią się sposobem przechwytywania danych o kolorach, a źródło światła może się zmieniać z czasem przy wielokrotnym użyciu.
   1. Uzyskiwanie wzorców kolorystycznych i skanowanie. Standardy kolorystyczne powinny być dobierane w oparciu o szeroką gamę kolorów obserwowanych w interesującej nas uprawie. W tym przykładzie wybraliśmy standardową 24-kolorową tabelę odwzorowania (ColorChecker, X-Rite, Grand Rapids, MI, Rysunek 1). Zeskanuj wzornik kolorów tak, jak skanujesz owoce. Kalibracja skanera jest wyjaśniona w sekcji 4.7.
6. Zapisz zeskanowany obraz jako plik JPEG.
   Uwaga: Zachowaj ostrożność i precyzję podczas umieszczania obiektów na skanerze na etapie zbierania obrazu. Im lepiej obiekty są wyrównane, tym mniej ręcznej regulacji będzie konieczne podczas analizy owoców w TA. Przykłady obrazów o niskiej i wysokiej jakości przedstawiono na rysunku 2.

3. Instalacja oprogramowania

1. Tomato Analyzer (TA) w wersji 2.2.0.0 można pobrać ze strony http://www.oardc.osu.edu/vanderknaap/tomato_analyzer.htm. Na tej stronie internetowej dostępne są również Instrukcja obsługi analizatora pomidorów oraz instrukcja testu koloru analizatora pomidorów.
2. TA wymaga systemu operacyjnego Windows (wersja 2000 lub nowsza).

4. Analiza obrazu i kalibracja dla testu kolorów TA

1. Folder z obrazami musi być umieszczony na dysku twardym, a nie w folderze "Moje dokumenty" lub na serwerze zdalnym. W przeciwnym razie TA nie zapisze dopasowanych obrazów w tym samym folderze, co oryginalne obrazy. Upewnij się, że dopasowane obrazy z rozszerzeniem .tmt znajdują się w tym samym folderze, co oryginalne obrazy .jpg (patrz krok 6.1.1).
2. Uruchom program TA, tak jak każdą inną aplikację, klikając dwukrotnie ikonę.
3. Użytkownik musi ustawić dpi i jednostki miary na odpowiednie ustawienia, wybierając "DPI skanera" z menu "Ustawienia". Ustawienie dpi musi być takie samo jak w przypadku pliku obrazu, aby wymiary rozmiaru (wysokość, szerokość, obwód, powierzchnia) były dokładne. "Użyte jednostki" w oknie dialogowym określa jednostki (cm, mm, cale lub piksele) dla wyjścia danych. W tym samym oknie dialogowym może być konieczne dostosowanie jasności, gdy obiekty są stosunkowo ciemne.
   nuta: DPI i jednostki można również dostosować po ręcznej regulacji lub po analizie obrazu.
4. Użytkownik może wybrać atrybuty, które mają być mierzone, wybierając opcję "Pomiar zapisany" z menu "Ustawienia". Można to zrobić w dowolnym momencie w trakcie lub po zakończeniu analizy. Atrybuty są pogrupowane w dziesięć kategorii (tj. Pomiar podstawowy, Indeks kształtu owocu, Blokowość, Jednorodność, Kształt bliższego końca owocu, Dystalny kształt końca owocu, Asymetria, Ekscentryczność wewnętrzna, Przekrój równoleżnikowy i Morfometria). Poszczególne atrybuty lub całą grupę pomiarów można zaznaczyć lub odznaczyć, klikając grupę lub atrybut. Wszystkie atrybuty grupy miar można wyświetlić, klikając "+". Wybrane atrybuty są wyświetlane według kategorii w oknie w prawym dolnym rogu ekranu, jak pokazano na rysunku 3.
5. Aby rozpocząć, kliknij przycisk "Otwórz obraz" i wybierz plik obrazu z wyskakującego okna dialogowego. Wybrany obraz zostanie wyświetlony w lewym oknie.
6. Aby przeanalizować otwarty obraz, kliknij przycisk "Analizuj". Po zakończeniu obwód każdego owocu zostanie podświetlony żółtą linią, a dane zostaną wyświetlone w prawym dolnym oknie danych. Oprogramowanie automatycznie odznaczy bardzo duże lub małe obiekty, takie jak linijka lub etykieta. Odznaczone obiekty zostaną podświetlone niebieską linią. Dodatkowe owoce można odznaczyć, klikając prawym przyciskiem myszy na ich obrazie. Tylko elementy oznaczone kolorem żółtym zostaną wyświetlone w oknie danych i wyeksportowane (Rysunek 3). Elementy oznaczone kolorem niebieskim nie będą uwzględniane w analizach. Poszczególne obiekty są wyświetlane w prawym górnym oknie po kliknięciu ich lewym przyciskiem myszy.
   Uwaga: Dane modułu testu koloru nie są wyświetlane w prawym dolnym oknie danych.
7. Przeanalizuj wzornik kolorów pod kątem analizy kolorów.
   1. Sprawdzanie kolorów i zbieranie wartości L*, a*, b*. Otwórz zeskanowany obraz wzornika kolorów i przeanalizuj go zgodnie z opisem dla owoców. Upewnij się, że TA rozpoznaje każdą łatkę jako obiekt do analizy (żółta granica). Jeśli używasz standardowego wzornika kolorów, oprogramowanie może nie być w stanie rozpoznać ciemniejszych pasów. Te kolory nie zostaną uwzględnione w kalibracji. W menu Ustawienia wybierz "Test koloru". Pojawi się okno dialogowe. Upewnij się, że wartości korekcji są ustawione na 1 dla nachylenia (lewe pola) i 0 dla punktu przecięcia z osią y (prawe pola). Minimalna wartość koloru niebieskiego powinna być ustawiona na 0, a parametry 1 i 2 można zignorować. Kliknij przycisk Analizuj w oknie dialogowym testu koloru. Pojawi się nowe okno, w którym można zapisać dane wyjściowe jako dokument "CSV", który można otworzyć w programie EXCEL. Określ nazwę i katalog pliku danych. Plik danych wyjściowych będzie zawierał wartości RGB; wartości L*, a*, b*; oraz obliczenia barwy i nasycenia dla każdej łaty koloru.
   2. Określanie wartości korekcyjnych do kalibracji. Sporządzić zestawienie wartości L*, a*, b* dla każdej łaty barwnej w stosunku do wartości kolorymetru dla L*, a* i b*, które są dostępne u producenta wzornika kolorów lub w Tabeli 1. Określ równanie regresji i zapisz nachylenie oraz punkt przecięcia z osią y dla każdego parametru. W oknie dialogowym wprowadź odwrotność nachylenia i odwrotność znaku wartości punktu przecięcia z osią y dla L*, a* i b*. Wartości te są używane jako wartości korekcyjne dla ustawień "Test koloru".
8. Test koloru pozwala użytkownikowi na zdefiniowanie dwóch parametrów, które informują o proporcji (%) pikseli, które mieszczą się w określonych zakresach wybranych wartości odcienia. Na przykład w przypadku analizy pomidora dolne i górne wartości parametru 1 wynoszą odpowiednio 70 i 100, co odpowiada niepożądanemu żółtemu i zielono-żółtemu kolorowi miąższu. Dolne i górne wartości parametru 2 wynoszą 0 i 50 i odpowiadają żądanemu kolorowi czerwonemu. Zapisz ustawienia dla tych wartości. Wartości te zostaną zastosowane do wszystkich obrazów, które są analizowane do momentu zamknięcia programu. W przypadku zeskanowanych obrazów wybierz opcję "Illuminant C 2°". Opcja "Illuminant D65 10°" jest stosowana tylko w przypadku zdjęć uzyskanych w naturalnym świetle.
9. Wizualizacja wyników (patrz rysunek 3): Każdy wiersz danych w prawym dolnym rogu okna danych odpowiada określonemu obiektowi na obrazie. Dane są wyświetlane w tej samej kolejności, co obiekty na obrazie. W pierwszym wierszu wartości obiektu są wyświetlane w lewym górnym rogu, a w ostatnim wierszu danych wartości obiektu znajdują się w prawym dolnym rogu obrazu. Kliknij wiersz, aby wyświetlić odpowiadający mu owoc w górnym oknie po prawej stronie. Alternatywnie kliknij na owoc, a odpowiedni wiersz danych zostanie podświetlony. Klikając na zakładkę atrybutów w prawym dolnym oknie, można zobaczyć, w jaki sposób atrybut jest mierzony dla każdego konkretnego owocu. Na przykład, klikając dystalny kąt końca, zostanie pokazany kąt zmierzony przez oprogramowanie na owocu w lewym oknie. Ta funkcja jest bardzo przydatna podczas identyfikowania obiektów, które wymagają ręcznej regulacji w celu dokładniejszego pomiaru.
   Rysunek 4 przedstawia obraz do analizy za pomocą modułu testu kolorów. Wyniki nie są jednak widoczne w oknie danych. Dostęp do danych w pliku Excel można uzyskać dopiero po zapisaniu analizy.

5. Ręczna regulacja atrybutów

Czasami granica owocu oraz bliższe i dalsze końce nie są poprawnie znajdowane przez TA. Ponadto, jeśli owoce są umieszczone pod kątem na skanerze, obraz należy dostosować, aby uzyskać prawidłowe pomiary. Te i inne cechy można skorygować poprzez ręczną regulację obrazów po wstępnej analizie. Dostępne korekty pojawiają się pod przyciskiem menu "Korekta" i obejmują: Obróć, Granica, Koniec bliższy, Koniec dystalny, Automatyczne obracanie, Dostosuj elipsę, Dostosuj występ dystalnej, Dostosuj granicę owocni, Domyślna granica owocni.

Uwaga: Jeśli chcesz dokonać korekty, najpierw dostosuj granicę, a następnie obrót. Wszystkie inne regulacje można wprowadzić w dowolnej kolejności po tych dwóch regulacjach. Dopasowanie wybrane w menu Zmień pozostaje zaznaczone do momentu wybrania innego dopasowania. Dzięki temu użytkownik może wykonać tę samą korektę sekwencji plasterków, klikając obraz plasterka i klikając przycisk Zmień wersję. Poniżej szczegółowo opisano ręczne korekty różnych atrybutów owoców.

1. granica
   1. Kliknij lewym przyciskiem myszy na owoc w lewym oknie. Pojawi się w prawym górnym oknie.
   2. Kliknij strzałkę obok przycisku "Zmień " i wybierz "Granica" z listy rozwijanej w prawym górnym oknie. Wybierz położenie obwiedni, która ma zostać zmodyfikowana, klikając lewym przyciskiem myszy punkt początkowy i końcowy niewłaściwej granicy. W związku z tym granica graniczna zostanie usunięta.
   3. Aby dodać nową obwiednię, kliknij lewym przyciskiem myszy od punktu początkowego w kierunku punktu końcowego. Kontynuuj klikanie, aby podążać za żądanym konturem. Kliknięcie prawym przyciskiem myszy cofnie poprzednią modyfikację. Wiele modyfikacji można cofnąć, klikając prawym przyciskiem myszy.
   4. Aby potwierdzić nową granicę, naciśnij "Enter". W przeciwnym razie naciśnij "Esc", aby anulować tę operację.
   5. Kliknij "Resetuj obwiednię", aby powrócić do pierwotnego ustawienia granicy.
2. Obracać. Ta funkcja jest używana, gdy obiekt nie jest całkowicie pionowy.
   1. Kliknij odpowiedni owoc w lewym oknie. Pojawi się w prawym górnym oknie.
   2. Kliknij strzałkę obok przycisku "Zrewiduj" i wybierz "Obróć" z listy rozwijanej.
   3. Oś zostanie wyświetlona w prawym górnym oknie. Przeciągnij zielony kwadrat na końcu osi, a owoc odpowiednio się obróci.
   4. Kliknij dwukrotnie wewnątrz okna lub naciśnij "Enter", aby zakończyć.
   5. Kliknij "Resetuj obrót", aby powrócić do pierwotnego wyrównania.
3. Dostosuj bliższy koniec. Jeśli wystąpi błąd w położeniu bliższego końca, pomiary wyprowadzone z tej cechy będą nieprawidłowe. Wybierz owoc, który wymaga korekty, aby pojawił się w oknie po prawej stronie. Następnie wybierz zakładkę "Proksymalny kształt końca owocu" i "Kąt proksymalny mikro lub makro" w sekcji danych wyjściowych poniżej wybranego owocu. Kąty proksymalne będą teraz wyświetlane dla każdego owocu na obrazku po lewej stronie. W ten sposób można zidentyfikować kąty, które wydają się niezwykłe. Aby zmienić położenie bliższego końca, wykonaj następujące kroki:
   1. Kliknij żądany owoc w lewym oknie. Pojawi się w prawym górnym oknie.
   2. Kliknij strzałkę obok przycisku "Zrewiduj" i wybierz "Koniec bliższy" z listy rozwijanej.
   3. W prawym górnym oknie kliknij i przeciągnij wskaźnik wierzchołka we właściwe miejsce.
   4. Kliknij dwukrotnie lub naciśnij "Enter", aby zakończyć.
4. Dostosuj dystalny koniec. Położenie dystalnego końca obiektu można również zmienić ręcznie. Aby skutecznie znaleźć owoce, które wymagają regulacji dystalnego końca, postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co w przypadku końca proksymalnego.
   1. Kliknij żądany owoc w lewym oknie. Pojawi się w prawym górnym rogu.
      Kliknij strzałkę obok przycisku "Poprawiaj" i wybierz "Dystalny koniec" z listy rozwijanej.
   2. W prawym górnym oknie kliknij i przeciągnij wskaźnik wierzchołka we właściwe miejsce.
   3. Kliknij dwukrotnie lub naciśnij "Enter", aby zakończyć.
5. Dystalny występ końcowy. Ta funkcja pozwala użytkownikowi zdefiniować punkty końcowe na granicy końcówki.
   1. Na karcie "Kształt dystalnego końca owocu" wybierz kolumnę oznaczoną "Występ dystalnego końca" i wybierz obiekt, który chcesz dostosować.
   2. Kliknij strzałkę obok przycisku "Poprawiona" i wybierz "Dostosuj występ dystalnej" z menu rozwijanego.
   3. Przeciągnij pojawiające się punkty w żądane miejsca wzdłuż obwiedni.
   4. Naciśnij Enter, aby zakończyć. Pojawi się linia pokazująca odcięcie obszaru końcówki i ponownie oblicz obszar końcówki. Wyniki pojawią się w kolumnie Występ dystalnego końca. Jeśli obszar końcówki nie znajduje się w żądanej pozycji, wybranie opcji "Resetuj występ dystalny pod przyciskiem "Korekta" spowoduje zresetowanie punktów do ich początkowych pozycji. Jeśli obszar końcówki zostanie znaleziony, ale nie powinien istnieć, wybranie opcji "Wyeliminuj dystalny występ" z przycisku "Poprawione" przesunie punkty na dół owocu, co spowoduje wartość 0,0 dla kolumny "Dystalny występ końcowy
   ".
6. Automatyczne obracanie. Ta funkcja została opracowana specjalnie dla nasion pomidorów, dzięki czemu można je automatycznie wyrównać ze spiczastym końcem skierowanym w tym samym kierunku. W tej chwili funkcja automatycznego obracania nie działa na innych obiektach, takich jak owoce.
7. Dostosuj elipsę. Ta funkcja pozwala użytkownikowi zmienić rozmiar i/lub przesunąć wewnętrzną elipsę w celu zdefiniowania wewnętrznych obszarów owoców. Ten atrybut jest używany dla funkcji Ekscentryczność wewnętrzna i Indeks kształtu owoców Atrybut wewnętrzny TA.
   1. Wybierz kartę Mimośród wewnętrzny, a następnie wybierz dowolną kolumnę na karcie. Wybierz "Domyślny rozmiar elipsy" z menu "Ustawienia".
   2. Wybierz obiekt i kliknij przycisk "Zrewiduj". Wybierz "Dostosuj elipsę" z menu rozwijanego.
   3. Pojawią się dwa punkty reprezentujące górny i lewy punkt elipsy. Przesunięcie ich powoduje zmianę rozmiaru i wyśrodkowanie elipsy względem dwóch nowych punktów.
   4. Po ustawieniu tych punktów w żądanych pozycjach naciśnij Enter. Elipsa zostanie przerysowana. Jeśli pozycja jest akceptowalna, naciśnij ponownie Enter, a wartości w kolumnach zostaną zaktualizowane.
   5. Jeśli wewnętrzna elipta musi zostać przesunięta bez zmiany kształtu, kliknij środek obiektów, w miejscu, w którym znajdowały się punkty. Pojawią się dwie linie i trzy zielone punkty. Przesuń punkt znajdujący się mniej więcej w środku owocu w nowe miejsce, aby przesunąć elipsę bez zmiany jej rozmiaru.
   6. Naciśnij Enter, aby zakończyć.
8. Dostosuj granicę owocni. Funkcja ta pozwala użytkownikowi na zdefiniowanie obszaru owocni i należy ją dostosować, gdy w zakładce "Przekrój równoleżnikowy" wybrano "Obszar owocni" i "Grubość owocni".
   Uwaga: w przypadku owoców, które są przejrzałe, odróżnienie owocni od reszty owocu może być trudne lub niemożliwe.
   1. Wybierz obiekt i kliknij menu rozwijane "Poprawione". Wybierz "Domyślna granica owocni" i ustaw domyślną, która najlepiej pasuje do owocni.
   2. Aby uzyskać dalsze korekty, wybierz "Dostosuj granicę owocni" z menu rozwijanego "Korekta".
   3. W prawym górnym oknie wybierz położenie granicy owocni, które chcesz zmodyfikować. Odbywa się to poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy punktu początkowego i końcowego niewłaściwej granicy. W związku z tym granica graniczna zostanie usunięta. Aby uzyskać najlepszy wynik, należy wybrać najmniejszy możliwy odcinek granicy w dowolnym momencie.
   4. Aby dodać nową obwiednię, kliknij lewym przyciskiem myszy od drugiego punktu z powrotem do pierwszego punktu. Kontynuuj klikanie, aby podążać za żądanym konturem. Kliknięcie prawym przyciskiem myszy cofnie poprzednią modyfikację. Wiele modyfikacji można cofnąć, klikając prawym przyciskiem myszy.
      Uwaga: Zbyt wiele modyfikacji granic owocni może spowodować zawieszenie się programu.
   5. Aby potwierdzić nową granicę, naciśnij "Enter". W przeciwnym razie naciśnij "Esc", aby anulować tę operację.
   6. Wybierz "Resetuj granicę owocni", aby przywrócić obwiednię do pierwotnego położenia.
9. W celu analizy kolorystycznej, gdy granica miąższu nie znajduje się na krawędzi obrazu owocu (np. poprzeczne cięcie na ramieniu owocu, pokazujące skórkę owocu nad cięciem poprzecznym, jak pokazano na rysunku 4), użytkownik musi otworzyć okno dialogowe "Test koloru" w menu "Ustawienia". W tym oknie dialogowym minimalna wartość koloru niebieskiego musi być ustawiona na 30 i zapisana. Jeśli owoce mają < 3 cm, ustaw minimalną wartość koloru niebieskiego na 20. Ta wartość może wymagać dalszej korekty, jeśli TA ma problemy ze znalezieniem prawidłowych granic.

6. Ustawienia zdefiniowane przez użytkownika

Dla niektórych atrybutów, użytkownik musi wybrać ustawienia, przy których powinien być wykonywany pomiar. Można to zrobić przed lub po analizie i będzie to zależało od tego, czy eksperyment ma zostać powtórzony z tymi samymi ustawieniami, które były używane wcześniej, czy też użytkownik chce przeprowadzić analizy eksploracyjne w celu zdefiniowania odpowiedniego ustawienia dla nowej analizy.

1. Ustawienie blokowości końca dystalnego i bliższego. Blokowość oblicza się jako stosunek szerokości w wybranej przez użytkownika proporcji wysokości najbliższej dystalnemu/proksymalnej długości owocu do środkowej szerokości (ryc. 5A). Dzięki temu użytkownik może wybrać lub zmienić lokalizację na obiekcie, w którym wykonywany jest pomiar. Górną i dolną pozycję blokowości można zmienić, wprowadzając nową wartość w polu "Pozycja blokowości" pod przyciskiem "Ustawienia".
2. Ustawianie kątów mikro i makro. Ustawienia te służą do obliczania kątów w różnych pozycjach od końców owocu (rysunek 5B). Ustawienie makro jest zwykle używane dla kątów od 5 do 40% wzdłuż granicy, a ustawienie mikro jest używane dla kątów od 2 do 10% wzdłuż granicy.
3. Liczba punktów morfometrycznych. Ta funkcja znajduje punkty wzdłuż granicy każdego obiektu na załadowanym obrazie. Dystalne i proksymalne końce są używane jako punkty orientacyjne dla każdego obiektu na obrazie. Liczbę punktów mierzonych wzdłuż granicy można wybrać za pomocą opcji "# punktów morfometrycznych" w menu "Ustawienia". Można wybrać od 4 do 30 punktów. Oprogramowanie automatycznie podzieli liczbę wybranych punktów na pół i równomiernie rozprowadzi je po każdej stronie owocu między dystalnym i bliższym końcem.

7. Zapisywanie i eksportowanie danych

1. Zapisywanie danych
   1. Po ręcznym dostosowaniu obrazu i analizie obrazu przez TA, kliknij przycisk "Zapisz owoce". Wszystkie bieżące informacje, w tym ręczne dopasowania i odznaczone obiekty, zostaną zapisane w nowym pliku o tej samej nazwie, co oryginalny obraz i rozszerzeniu tmt. Za każdym razem, gdy plik zostanie wybrany, zapisany plik tmt o tej samej nazwie zostanie automatycznie otwarty, ponieważ jest połączony z oryginalnym plikiem. Jednakże, plik tmt powinien być przechowywany w tym samym folderze co plik obrazu jpg (patrz sekcja 4.1). Jeśli oprogramowanie nie przechowuje plików tmt i jpg w tym samym folderze, przenieś folder obrazu na dysk C.
   2. Aby powrócić do oryginalnego pliku obrazu, bez żadnych zmian, po prostu usuń powiązany plik tmt. Alternatywą jest wybranie opcji "Analizuj" i ponowna analiza oryginalnego obrazu. Należy jednak pamiętać, że każdy tmt o tej samej nazwie co obraz będzie nadal powiązany z obrazem przy następnym otwarciu pliku, chyba że oczywiście korekty zostaną zapisane na pliku tmt.
2. Eksport danych
   1. Użytkownik może wyeksportować dane dla pojedynczego obrazu, wybierając przycisk "Eksportuj". Dane zostaną wyeksportowane do pliku Excel i wyświetlą wartości atrybutów dla każdego owocu, średnią i odchylenie standardowe.
   2. Aplikacja TA może również eksportować wartości atrybutów z dwóch lub więcej obrazów (funkcja "Analiza wsadowa").
      1. Aby rozpocząć analizę wsadową, kliknij przycisk "Otwórz obraz".
      2. Wybierz pliki obrazów, które mają zostać przeanalizowane wsadowo. Wiele plików jest wybieranych za pomocą "Shift" lub "Ctrl" podczas wybierania dodatkowych plików. Po wybraniu plików kliknij przycisk "Otwórz".
      3. Użytkownik zostanie poproszony o wybranie typu danych wyjściowych analizy wsadowej: "Tylko średnia", "Średnia i odchylenie standardowe" lub "Indywidualne pomiary na obraz". Przykład dwóch trybów eksportu pokazano na rysunku 6.
      4. Wybierz nazwę pliku Excel, który zostanie utworzony, i kliknij przycisk "Zapisz". Oprogramowanie automatycznie otworzy pliki i rozpocznie analizę wsadową. Jeśli pliki obrazów zostały wcześniej przeanalizowane i zapisane przez TA, zapisane pliki .tmt zostaną otwarte do analizy wsadowej. Jeśli pliki nie były wcześniej analizowane, oprogramowanie przeprowadzi analizę obrazów bez ręcznych korekt i deznaczeń. TA może wykonać analizę wsadową co najmniej 100 obrazów w rozdzielczości 600 dpi.
      5. Analiza wsadowa do analizy kolorystycznej. Otwórz opcję "Test koloru" w menu ustawień. Sprawdź Analiza wsadowa i kliknij przycisk Analizuj. Pojawi się nowe okno, w którym można wybrać obrazy do analizy. W następnym oknie określ nazwę i katalog pliku danych. Kliknij Zapisz. Plik wyjściowy będzie zawierał nazwę każdego obrazu (na podstawie nazwy pliku) oraz średnie wartości kolorów dla każdego owocu na obrazie. Parametry zawarte w danych wyjściowych to: parametr 1, parametr 2, wartości R, G i B, jasność, wartości L*, a* i b*, a także wartości odcienia i nasycenia. Moduł testu kolorów może wykonać analizę wsadową do 100 obrazów owoców, w zależności od sprzętu komputera.

8. Przykłady analizy danych

Dane wyjściowe generowane przez TA mogą być używane w wielu aplikacjach. W badaniach genetycznych wyniki są wykorzystywane do wykrywania kształtu owoców QTL (Quantitative Trait Loci) w kilku segregujących populacjach pochodzących z krzyżówek między różnymi uprawianymi odmianami pomidorów (S. lycopersicum) oraz dziki gatunek S. pimpinellifolium akces LA1589^1,4,5. TA może być również używana do klasyfikowania owoców w kategoriach kształtu⁶ i analizy przebarwień koloru owoców pomidora spowodowanych zaburzeniem fizjologicznym "żółte ramię"³. Ponadto oprogramowanie zostało wykorzystane do analizy innych organów roślinnych, takich jak liście⁷ i nasiona^8,9.

9. Reprezentatywne wyniki

Wyjście TA było wykorzystywane do bardzo różnych zastosowań. W badaniach nad kształtem owoców QTL obrazy owoców (od 8 do 10 owoców na roślinę na jednym obrazie) zebrano z łącznie od 96 do 130 roślin w każdej populacji. Następnie obrazy te zostały przeanalizowane za pomocą TA^4,5. Aby wykryć związek między fenotypami a genotypami, przeprowadzono analizy QTL przy użyciu złożonego mapowania interwałowego^10,11 oraz wielocechowego złożonego mapowania interwałowego dla podzbiorów atrybutów w każdej populacji¹². W rezultacie zidentyfikowano wiele regionów genomu pomidora kontrolujących kształt owoców. Niektóre z tych regionów występowały w kilku populacjach, podczas gdy inne były unikalne dla jednej populacji. Podczas gdy niektóre QTL w kształcie owoców (takie jak jajowate, słoneczne i fs8.1) były znane z poprzednich badań mapowania, kilka innych loci zostało niedawno odkrytych. W sumie wykryto od 17 do 36 QTL kontrolujących atrybuty kształtu owoców w trzech segregujących populacjach^2,4.

Dane wygenerowane przez TA zostały również przeanalizowane za pomocą Analizy Głównych Składowych (PCA). W jednym z badań piętnaście atrybutów kształtu poddano PCA, a pierwsze trzy główne składniki (PC) zostały następnie zmapowane jako cechy. Dane pokazują, że QTL PC pokrywały się z QTL atrybutów, które współtworzyły komponent⁴. Populacje segregujące wykorzystano również do porównania QTL identyfikowanego za pomocą morfometrii z QTL identyfikowanym za pomocą atrybutów kształtu. Ponownie wykazano, że morfometria QTL pokrywa się z QTL kontrolującym atrybuty kształtu i wielkości owoców w 93% przypadków². Wyniki te wyraźnie pokazują ważność i odtwarzalność danych uzyskanych przez TA w analizie morfologii owoców.

Innym zastosowaniem TA jest stworzenie systemu klasyfikacji kształtów owoców do identyfikacji odmian pomidorów na podstawie obiektywnych pomiarów kształtu owoców. Oceniono kolekcję plazmy zarodkowej ~350 odmian pomidorów o różnym pochodzeniu i morfologii owoców. Około ośmiu owoców z każdej rośliny zostało zdigitalizowanych i przeanalizowanych za pomocą TA. Dwa istniejące systemy klasyfikacji, IPGRI¹³ i UPOV¹⁴, zostały ocenione i porównane za pomocą wizualnych porównań ze zdjęciami owoców w naszej kolekcji. Zmodyfikowaliśmy klasyfikację morfologiczną tych dwóch układów, łącząc kilka kategorii i tworząc dwie nowe⁶. Proponowane kategorie to płaskie, okrągłe, długie, prostokątne, jajowate, elipsoidalne, sercowe i wołowe. Osiem nowych kategorii zaadaptowanych z systemów IPGRI¹³ i UPOV¹⁴ jest bardziej rozpoznawalnych wizualnie i zostało przetestowanych przy użyciu pomiarów TA. Wynik TA składający się z 37 atrybutów z każdego akcesji został poddany PCA i Liniowej Analizie Dyskryminacyjnej (LDA) w celu zidentyfikowania pomiarów, które najlepiej definiują każdą kategorię kształtu owocu, a także w celu oceny, jak dokładnie atrybuty dyskryminatora wyjaśniają wizualną klasyfikację każdego przystąpienia. Jednym z możliwych zastosowań tego systemu klasyfikacji kształtów owoców byłoby wykorzystanie wyników TA do grupowania akcesji na podstawie danych fenotypowych i identyfikowania powiązań między różnymi kategoriami kształtów owoców.

Moduł testu kolorów w TA został porównany z pomiarami kolorów wykonanymi za pomocą kolorymetru (CR300) w populacji IBC pochodzącej z krzyżówek między odmianami przetwarzającymi S. lycopersicum ³. Wartości L*, a* i b* z kolorymetru były porównywalne z wartościami kolorów uzyskanymi z trzech różnych skanerów z TA. Jednak różnice między trzema skanerami zaobserwowano ze względu na sprzęt, oprogramowanie lub niestandardowe wartości RGB. W związku z tym w Color Test zaimplementowano opcję wprowadzania wartości korekcyjnych, aby umożliwić kalibrację skanera. W badaniu genetycznym z użyciem testu kolorów z TA, wariancja genetyczna dla koloru i jednorodności koloru była znacznie wyższa niż w przypadku uzyskania tych wartości z kolorymetru. Różnice te wynikają z tego, że TA mierzy parametry barwy całej powierzchni, podczas gdy kolorymetr analizuje tylko kilka punktów na powierzchni. Na koniec przetestowano TA i udało się przeanalizować kolor i jednorodność koloru w innych uprawach, takich jak ziemniaki, ogórki, piżmowe i truskawki³.

Rysunek 1. Standardowy wzornik kolorów dla modułu Color Test do kalibracji wartości kolorów uzyskanych z różnych skanerów i w różnym czasie.

Rysunek 2. Do prawidłowego funkcjonowania TATA wymagane są wysokiej jakości obrazy cyfrowe. A) Przykład obrazu niskiej jakości. TA spróbuje odnaleźć obiekty na całym obrazie. W przypadku dużych pustych przestrzeni, takich jak pokazane tutaj, TA może nie działać poprawnie lub ulec awarii. Niektóre owoce nie zostały osuszone na sucho, a sok na ekranie skanera uniemożliwi TA rozpoznanie prawidłowej granicy owoców. Ponadto, gdy większość owoców jest nieprawidłowo zorientowana pionowo, wiele atrybutów nie zostanie poprawnie obliczonych. Te obrazy o niskiej jakości znacznie spowolnią analizę kształtu owoców ze względu na rozległe ręczne korekty, które będą musiały zostać wykonane przed analizą. B) Przykład obrazu wysokiej jakości. Owoce są prawidłowo zorientowane pionowo, rozmieszczone blisko siebie, nie stykając się ze sobą i osuszone.

Rysunek 3. Zrzut ekranu oprogramowania TA. W górnym oknie znajdują się przyciski kilku dostępnych narzędzi (tj. otwórz obraz, zapisz owoce, eksport danych, dopasuj rozmiar, analizuj i poprawiaj). Obiekt w prawym górnym oknie został wybrany do ręcznej korekty, a dane są wyświetlane w prawym dolnym oknie. Wartości dla tego owocu są podświetlone na szaro w prawym dolnym oknie danych. Obiekty oznaczone kolorem żółtym w lewym oknie zostaną uwzględnione w analizach, natomiast obiekty oznaczone kolorem niebieskim nie zostaną uwzględnione w analizach.

Rysunek 4. Obraz używany w aplikacji Tomato Analyzer - Color Test.

Rysunek 5. Ustawienia zdefiniowane przez użytkownika. A) Atrybuty blokowości. Górna pozycja służy do obliczania blokowości bliższego końca i atrybutów trójkąta. Ustawienie Górna pozycja określa, gdzie mierzony jest X (=10% na rysunku). Dolna pozycja służy do obliczania blokowości dystalnego końca i atrybutów trójkąta. Ustawienie Dolna pozycja określa, gdzie mierzone jest Y (= 90% na rysunku). Wartości dla tych pozycji są równe procentowi wysokości od wierzchołka owocu. B) Atrybuty kąta makro. Zielone linie reprezentują procent (= 20 % na rysunku) wzdłuż granicy od końca (kwadrat na rysunku), gdzie zostanie zmierzony kąt. Oprogramowanie określi nachylenie na podstawie +/- 5% wybranej wartości. Dla mikrokątów oprogramowanie określi nachylenie przy użyciu +/- 2% wybranej wartości.

Rysunek 6. Przykład danych wyjściowych uzyskanych za pomocą narzędzia Eksport z obrazu pokazanego na rysunku 3. A) Dane wyjściowe przedstawiające wartości atrybutów dla każdego owocu, średnią i odchylenie standardowe. B) Dane wyjściowe przedstawiające średnie wartości atrybutów i odchylenie standardowe dla 10 odmian pomidorów.

  L* za* b* 1 37.986 Rozdział 13 555 Nasion 14.059 szt. cyfra arabska 65.711 Cz.C. Godzina 18.13 Godzina 17,81 3 49 927 TGL -4,88 pkt. -21,925 jedn. 4 43 139 szt. -13.095 jedn. Z dnia 21 905 zł 5 55.112 Rozdział 8,844 pkt. -25.399 TGL 6 70,719 TGL -33,397 TGL -0,199 pkt. 7 62 661 szt. Nr 36.067 TGL 57.096 TGL 8 Norma 40.02 Godzina 10.41 -45.964 jedn. 9 51 124 szt. 48 239 szt. 16.248 Rozdział 10 Nr 30 325 TGL 22 976 TGL -21.587 jedni 11 72 532 szt. -23,709 jedn. 57 255 szt. 12 71 941 szt. 19 363 TGL 67.857 Cz.C. 13 Z dnia 28 778 zł Godzina 14 179 TGL -50,297 jedn. 14 55 261 szt. -38.342 jedn. Do godziny 31,37 15 42.101 szt. 53 378 Nasion O godz. 28.19 16 81 733 TGL 4,039 pkt. 79.819 Rozdział 17 51 935 TGL 49.986 TGL -14,574 jedn. Rozdział 18 51 038 szt. -28.631 jedn. -28.638 jedn. Rozdział 19 96 539 TGL -0,425 prospektu 1,186 pkt. 20 81 257 szt. -0,638 szt. -0,335 propozycji 21 66.766 TGL -0,734 pkt. -0,504 pkt. 22 Rozdział 22 50 867 TGL -0,153 pkt. -0,27 pkt. 23 35 656 szt. -0,421 pkt. -1,231 jedn. 24 Z dnia 20 461 zł -0,079 pkt. -0,973 pkt.

Tabela 1. Wartości L*, a*, b* dla każdej łaty wzornika kolorów (patrz Rysunek 1). Źródłem światła był D50, a kąt obserwacji wynosił 2°.

Dyskusja

Wysokoprzepustowa i dokładna ocena morfologii i barwy organów roślinnych jest trudna ze względu na jej ilościowy charakter i często subiektywną ocenę ilościową. TA zapewnia obiektywne i dokładne pomiary kilku cech morfologicznych i kolorymetrycznych owoców w sposób półautomatyczny i o wysokiej przepustowości. Przydatność TA została wykazana w badaniach, które doprowadziły do identyfikacji kształtu owoców pomidora QTL^2,4,5. Ponadto klasyfikacja odmian6 i taksonomia grupy gatunków zostały ocenione przy użyciu wyników TA^15,16. Wysoka ekspresja genu kształtu owoców pomidora SUN skutkuje wydłużonymi owocami¹⁷. Za pomocą TA określono kształt liścia i liścienia w liniach wyrażających SUN do wysokiego poziomu⁷, co pokazuje, że aplikacja może być skutecznie wykorzystywana do pomiaru morfologii również innych organów roślinnych. Co więcej, TA odegrała kluczową rolę w identyfikacji genetycznych podstaw wielkości nasion pomidora i słonecznika^8,9. Wreszcie, moduł Color Test zaimplementowany w TA jest bardziej precyzyjny i dokładny, a także tańszy niż inne metody analizy koloru owoców pomidora. Podsumowując, TA stała się kluczowym narzędziem do obiektywnej i wiarygodnej oceny morfologii i zmienności kolorystycznej organów roślinnych.