Tomato Analyzer: Przydatna aplikacja programistyczna do gromadzenia dokładnych i szczegółowych danych morfologicznych oraz kolorymetrycznych z obiektów dwuwymiarowych

Podsumowanie

Analizator Pomidorów (Tomato Analyzer, TA) w sposób powtarzalny i dokładny określa cechy dwuwymiarowych kształtów oraz koloru. Opisano procedurę krok po kroku w celu uzyskania wysokiej jakości zdigitalizowanych obrazów owoców pomidora, analizy morfologiczne i kolorystyczne tych obrazów oraz kilka zastosowań z wykorzystaniem danych generowanych przez to oprogramowanie.

Streszczenie

Obiektywny i powtarzalny pomiar morfologii oraz cech barwnych owoców upraw warzywnych i owocowych jest istotny dla szczegółowych analiz fenotypowych tych cech. Tomato Analyzer (TA) to program komputerowy, który w sposób półautomatyczny i powtarzalny mierzy 37 atrybutów związanych z kształtem dwuwymiarowym^1,2. Wiele z tych atrybutów, takich jak kąty na końcach dystalnych i proksymalnych owocu oraz powierzchnie wcięć, jest trudnych do ilościowego określenia metodą manualną. Atrybuty są zorganizowane w oprogramowaniu w dziesięciu kategoriach: Basic Measurement, Fruit Shape Index, Blockiness, Homogeneity, Proximal Fruit End Shape, Distal Fruit End Shape, Asymmetry, Internal Eccentricity, Latitudinal Section oraz Morphometrics. Ostatnia kategoria nie wymaga wcześniejszej wiedzy ani z góry określonych pojęć dotyczących atrybutów kształtu, zatem analiza morfometryczna stanowi obiektywną opcję, która może być lepiej dostosowana do analiz wysokoprzepustowych niż analiza atrybutów. TA oferuje również aplikację Color Test, która została zaprojektowana do gromadzenia pomiarów koloru z zeskanowanych obrazów oraz umożliwia kalibrację urządzeń skanujących przy użyciu wzorców kolorystycznych³.

TA oferuje kilka opcji eksportu i analizy danych dotyczących cech kształtu, morfometrii oraz koloru. Dane mogą być eksportowane do pliku Excel w trybie wsadowym (ponad 100 obrazów jednocześnie) lub eksportowane jako poszczególne obrazy. Użytkownik może wybrać wyjście wyświetlające średnią dla każdego atrybutu obiektów na każdym obrazie (wraz z odchyleniem standardowym) lub wyjście wyświetlające wartości atrybutów dla każdego obiektu na obrazie. TA okazało się wartościowym i skutecznym narzędziem do identyfikacji i potwierdzania loci cech ilościowych (QTL) kształtu owoców pomidora, a także do przeprowadzania szczegółowych analiz wpływu kluczowych genów kształtu owoców na morfologię rośliny. Ponadto TA może być wykorzystywane do obiektywnej klasyfikacji owoców do różnych kategorii kształtu. Wreszcie, za pomocą TA można oceniać cechy kształtu i koloru owoców u innych gatunków roślin, a także innych organów roślinnych, takich jak liście i nasiona.

Protokół

Oprogramowanie Tomato Analyzer (TA) zostało zaprojektowane do rozpoznawania obiektów o określonym rozmiarze i rozdzielczości obrazu, mierzonych w kropkach (pikselach) na cal (dpi). Oprogramowanie automatycznie wyznacza granice owoców na zeskanowanym obrazie. Granica obiektu jest określana poprzez śledzenie konturu, co skutkuje uzyskaniem listy sąsiadujących punktów opisujących obrys obiektu na obrazie. Wszystkie pomiary kształtu owoców są obliczane na podstawie tych granic. Moduł testu koloru „Tomato Analyzer Color Test” służy do ilościowego określania parametrów koloru wewnątrz granic rozpoznanych przez oprogramowanie. Pomiary koloru opierają się na przestrzeni barw RGB: R (czerwony), G (zielony) i B (niebieski). Średnie wartości RGB dla każdego piksela są pobierane przez moduł testu koloru, a następnie przekształcane do przestrzeni barw CIELAB, która wykorzystuje parametry L*, a*, b* do opisania koloru w sposób przybliżający ludzką percepcję wzrokową. Moduł testu koloru oblicza deskryptory barwy Hue (odcień) i Chroma (nasycenie) na podstawie wartości a* i b*.

Opisano szczegółowy protokół digitalizacji owoców pomidora oraz późniejszej półautomatycznej analizy cech morfologicznych i kolorystycznych przy użyciu pakietu oprogramowania TA. Protokół podzielono na osiem kroków: 1) Wybór i przygotowanie materiału roślinnego, 2) Gromadzenie obrazów, 3) Instalacja oprogramowania, 4) Analiza obrazów i kalibracja dla testu kolorystycznego TA (TA Color Test), 5) Ręczna regulacja parametrów, 6) Ustawienia zdefiniowane przez użytkownika, 7) Zapisywanie i eksport danych oraz 8) Przykłady analizy danych.

1. Wybór i przygotowanie materiału roślinnego

1. Owoce muszą być czyste i suche.
2. Owoce mięsiste nie powinny być przejrzałe, ponieważ zmiękczenie może spowodować deformację kształtu podczas krojenia.
3. Owoce należy przekroić ostrym nożem z ząbkami lub nową żyletką. W zależności od rodzaju analizy i ocenianych cech, owoce należy przeciąć wzdłużnie lub poprzecznie przez środek. Analizę koloru można przeprowadzać na owocach przekrojonych wzdłużnie lub poprzecznie, a także w innych przekrojach zaprojektowanych w celu uwypuklenia konkretnych cech.
4. Jeśli owoce są bardzo soczyste, należy osuszyć ich wnętrze, przykładając chusteczkę higieniczną lub ręcznik papierowy.

2. Gromadzenie obrazów

1. Przekrój owoce i umieść je na skanerze stroną przecięcia do dołu. Nad owocami umieść linijkę, a pod nimi etykietę. Linijka służy do weryfikacji wyboru odpowiedniej rozdzielczości skanowania i jest istotna dla dokładnego pomiaru cech owoców. W przypadku analizy danych wysokoprzepustowych niezbędne jest skanowanie owoców pochodzących tylko z jednej rośliny (lub genotypu) jednocześnie oraz skanowanie owoców przeciętych albo wzdłużnie, albo poprzecznie, bez mieszania obu typów cięć na jednym skanie. Umieść owoce blisko siebie, unikając jednak ich wzajemnego stykania się. Unikaj również pozostawiania dużych pustych przestrzeni między owocami na skanerze. Jeśli obiekty znajdują się zbyt daleko od siebie, obraz musi zostać poddany obróbce w programie do edycji grafiki, takim jak Adobe Photoshop lub GIMP, przed analizą w programie TA.
2. Ponieważ oprogramowanie TA wykorzystuje rozdzielczość obrazu do dokładnego pomiaru rozmiaru, właściwy dobór rozdzielczości skanowania jest kluczowy dla późniejszej analizy.
   1. Zasadniczo, jeśli obiekty mają rozmiar od 1 do 8 cm, należy skanować w rozdzielczości 200 lub 300 dpi (pikseli/cal). Jeśli obiekty mają rozmiar > 8 cm, należy skanować w 100 dpi. Dla bardzo małych obiektów (< 1 cm), takich jak nasiona, należy skanować w 750 dpi lub więcej. W przypadku planowania analizy seryjnej (patrz poniżej), gdy rozmiar owoców nie wykazuje dużej zmienności między różnymi roślinami, wygodnie jest wybrać jedno ustawienie rozdzielczości skanera dla wszystkich obrazów gromadzonych w ramach tego samego eksperymentu.
   2. W przypadku testu koloru ustaw rozdzielczość skanera na 200 dpi, jeśli owoce mają rozmiar < 8 cm. Jeśli owoce mają rozmiar > 8 cm, skanuj w 100 dpi. Ponadto ustaw rozmiar obrazu wyjściowego na najwyższą dostępną w skanerze liczbę kolorów.
3. Obiekty powinny być skanowane na czarnym lub bardzo ciemnym tle, aby zapobiec powstawaniu cieni, które zakłócałyby analizę. Ciemne tło można uzyskać, nakrywając skaner pudełkiem kartonowym, aby ograniczyć dostęp światła do szyby. W przypadku zastosowania białego tła program TA nie będzie działać, ponieważ aplikacja jest zoptymalizowana do pracy z ciemnym tłem.
4. Obraz powinien zostać przycięty po wstępnym skanowaniu (przed zapisaniem pliku), aby uniknąć dużych pustych przestrzeni. Jeśli obraz nie zostanie przycięty na tym etapie, należy to zrobić za pomocą oprogramowania do edycji grafiki, takiego jak Adobe Photoshop lub GIMP, przed analizą w programie TA.
5. W przypadku analiz koloru skaner będzie wymagał kalibracji, jeśli użytkownik zamierza przeliczyć wartości RGB na uniwersalną skalę L*, a* i b*. Skanowanie wzornika kolorów (Rysunek 1) powinno odbyć się przed lub w trakcie skanowania owoców. Zeskanowany wzornik kolorów należy zapisać w tym samym folderze co obrazy owoców. Kalibracja skanera jest konieczna, ponieważ skanery różnią się sposobem przechwytywania danych o kolorach, a źródło światła może ulec zmianie w czasie przy wielokrotnym użytkowaniu.
   1. Pozyskiwanie wzorców kolorystycznych i skanowanie. Wzorce kolorystyczne powinny zostać dobrane na podstawie szerokiej gamy kolorów obserwowanych u badanej uprawy. W tym przykładzie wybrano standardową kartę odwzorowania 24 kolorów (ColorChecker, X-Rite, Grand Rapids, MI, Rysunek 1). Zeskanuj wzornik kolorów w ten sam sposób, w jaki skanujesz owoce. Kalibracja skanera jest wyjaśniona w sekcji 4.7.
6. Zapisz zeskanowany obraz jako plik JPEG.
   Uwaga: Zachowaj ostrożność i precyzję podczas rozmieszczania obiektów na skanerze na etapie gromadzenia obrazów. Im lepiej wyrównane będą obiekty, tym mniej ręcznych korekt będzie wymaganych podczas analizy owoców w programie TA. Przykłady obrazów o niskiej i wysokiej jakości przedstawiono na Rysunku 2.

3. Instalacja oprogramowania

1. Program Tomato Analyzer (TA) w wersji 2.2.0.0 można pobrać ze strony http://www.oardc.osu.edu/vanderknaap/tomato_analyzer.htm. Podręcznik użytkownika Tomato Analyzer oraz instrukcja testu kolorystycznego Tomato Analyzer są również dostępne na tej stronie.
2. TA wymaga systemu operacyjnego Windows (wersja 2000 lub nowsza).

4. Analiza obrazu i kalibracja dla testu kolorystycznego TA

1. Folder z obrazami musi znajdować się na dysku twardym, a nie w folderze „Moje dokumenty” ani na zdalnym serwerze. W przeciwnym razie program TA nie zapisze skorygowanych obrazów w tym samym folderze co obrazy oryginalne. Upewnij się, że skorygowane obrazy z rozszerzeniem .tmt znajdują się w tym samym folderze co oryginalne obrazy .jpg (patrz krok 6.1.1).
2. Uruchom program TA w taki sam sposób jak każdą inną aplikację programową, klikając dwukrotnie ikonę.
3. Użytkownik musi ustawić odpowiednie wartości dpi i jednostki pomiarowe, wybierając „Scanner DPI” z menu „Settings”. Ustawienie dpi musi być zgodne z plikiem obrazu, aby pomiary rozmiarów (wysokość, szerokość, obwód, powierzchnia) były dokładne. Opcja „Units used” w oknie dialogowym określa jednostki (cm, mm, in lub piksel) dla danych wyjściowych. W tym samym oknie dialogowym może zajść potrzeba dostosowania jasności, gdy obiekty są stosunkowo ciemne.
   Uwaga: DPI i jednostki można dostosować również po wprowadzeniu ręcznych korekt lub po analizie obrazu.
4. Użytkownik może wybrać atrybuty do zmierzenia, wybierając „Measurement Saved” z menu „Setting”. Można to zrobić w dowolnym momencie w trakcie lub po analizie. Atrybuty są pogrupowane w dziesięć kategorii (tj. Basic Measurement, Fruit Shape Index, Blockiness, Homogenity, Proximal Fruit End Shape, Distal Fruit End Shape, Asymmetry, Internal Eccentricity, Latitudinal Section i Morphometrics). Poszczególne atrybuty lub całe grupy pomiarowe można zaznaczać lub odznaczać, klikając w grupę lub atrybut. Wszystkie atrybuty danej grupy pomiarowej można wyświetlić, klikając symbol „+”. Wybrane atrybuty są wyświetlane według kategorii w oknie w prawym dolnym rogu ekranu, jak pokazano na Rysunku 3.
5. Aby rozpocząć, kliknij przycisk „Open image” i wybierz plik obrazu z wyskakującego okna dialogowego. Wybrany obraz zostanie wyświetlony w lewym oknie.
6. Aby przeanalizować otwarty obraz, kliknij przycisk „Analyze”. Po zakończeniu obwód każdego owocu zostanie podświetlony żółtą linią, a dane zostaną wyświetlone w prawym dolnym oknie danych. Oprogramowanie automatycznie odznaczy bardzo duże lub małe obiekty, takie jak linijka lub etykieta. Odznaczone obiekty zostaną podświetlone niebieską linią. Dodatkowe owoce można odznaczyć, klikając prawym przyciskiem myszy na ich obraz. W oknie danych będą wyświetlane i eksportowane tylko elementy obrysowane na żółto (Rysunek 3). Elementy obrysowane na niebiesko nie zostaną uwzględnione w analizach. Poszczególne obiekty są wyświetlane w prawym górnym oknie po kliknięciu ich lewym przyciskiem myszy.
   Uwaga: Dane z modułu Color test nie są wyświetlane w prawym dolnym oknie danych.
7. Przeanalizuj wzornik kolorów dla analizy barwy.
   1. Wzornik kolorów i zbieranie wartości L*, a*, b*. Otwórz zeskanowany obraz wzornika kolorów i przeprowadź analizę w sposób opisany dla owoców. Upewnij się, że TA rozpoznaje każde pole jako obiekt do analizy (żółta granica). W przypadku korzystania ze standardowego wzornika kolorów oprogramowanie może nie rozpoznać ciemniejszych obszarów. Kolory te nie zostaną uwzględnione w kalibracji. W menu Settings wybierz „Color Test”. Pojawi się okno dialogowe. Upewnij się, że wartości korekcyjne są ustawione na 1 dla nachylenia (lewe pola) i 0 dla punktu przecięcia z osią y (prawe pola). Minimalna wartość niebieskiego powinna być ustawiona na 0, a parametry 1 i 2 można zignorować. Kliknij przycisk Analyze w oknie dialogowym testu kolorów. Pojawi się nowe okno umożliwiające zapisanie wyników jako dokument „CSV”, który można otworzyć w programie EXCEL. Określ nazwę i katalog pliku danych. Wyjściowy plik danych będzie zawierał wartości RGB, wartości L*, a*, b* oraz obliczenia odcienia i nasycenia dla każdego pola kolorystycznego.
   2. Wyznaczanie wartości korekcyjnych do kalibracji. Nanieś wartości L*, a*, b* dla każdego pola kolorystycznego względem wartości kolorymetru dla L*, a* i b*, które są dostępne od producenta wzornika kolorów lub w Tabeli 1. Wyznacz równanie regresji i zapisz nachylenie oraz punkt przecięcia z osią y dla każdego parametru. W oknie dialogowym wprowadź odwrotność nachylenia i zmianę znaku wartości punktu przecięcia z osią y dla L*, a* i b*. Wartości te służą jako wartości korekcyjne w ustawieniach „Color Test”.
8. Test kolorów pozwala użytkownikowi zdefiniować dwa parametry raportujące proporcję (%) pikseli, które mieszczą się w wybranych zakresach wartości odcienia. Na przykład dla analizy pomidorów dolne i górne wartości dla parametru 1 wynoszą odpowiednio 70 i 100, co odpowiada niepożądanemu żółtemu i żółto-zielonemu kolorowi miąższu. Dolne i górne wartości dla parametru 2 wynoszą 0 i 50 i odpowiadają pożądanemu czerwitemu kolorowi. Zapisz ustawienia dla tych wartości. Wartości te będą stosowane do wszystkich analizowanych obrazów aż do zamknięcia programu. W przypadku obrazów skanowanych wybierz opcję „Illuminant C 2°”. Opcja „Illuminant D65 10°” jest stosowana wyłącznie dla obrazów pozyskanych w świetle naturalnym.
9. Wizualizacja wyników (patrz Rysunek 3): Każdy wiersz danych w prawym dolnym oknie danych odpowiada konkretnemu obiektowi na obrazie. Dane są wyświetlane w tej samej kolejności, co obiekty na obrazie. Pierwszy wiersz wyświetla wartości dla obiektu w lewym górnym rogu, a ostatni wiersz danych wyświetla wartości dla obiektu w prawym dolnym rogu obrazu. Kliknij wiersz, aby wyświetlić odpowiadający mu owoc w górnym prawym oknie. Alternatywnie, kliknij owoc, a odpowiedni wiersz danych zostanie podświetlony. Klikając kartę atrybutu w prawym dolnym oknie, można zobaczyć, w jaki sposób dany atrybut jest mierzony dla każdego konkretnego owocu. Na przykład, klikając kąt końca dystalnego, zostanie pokazany kąt zmierzony przez oprogramowanie dla owocu w lewym oknie. Funkcja ta jest bardzo przydatna podczas identyfikacji obiektów wymagających ręcznej korekty w celu uzyskania dokładniejszego pomiaru.
   Rysunek 4 przedstawia obraz do analizy za pomocą modułu Color test. Jednak wyniki nie są widoczne w oknie danych. Dostęp do danych jest możliwy jedynie w pliku Excel po zapisaniu analizy.

5. Ręczna korekta atrybutów

Czasami granice owocu oraz końce proksymalny i dystalny nie są prawidłowo wykrywane przez TA. Ponadto, jeśli owoce zostaną umieszczone w skanerze pod kątem, obraz musi zostać skorygowany w celu uzyskania prawidłowych pomiarów. Te oraz inne elementy mogą zostać poprawione poprzez ręczną regulację obrazów po wstępnej analizie. Dostępne opcje korekty znajdują się pod przyciskiem menu „Revise” i obejmują: Rotate, Boundary, Proximal End, Distal End, Auto-rotate, Adjust Ellipse, Adjust Distal Protrusion, Adjust Pericarp Boundary oraz Default Pericarp Boundary.

Uwaga: Jeśli wymagane są korekty, w pierwszej kolejności należy dostosować granicę, a następnie rotację. Wszystkie pozostałe korekty można przeprowadzać w dowolnej kolejności po wykonaniu tych dwóch kroków. Korekta wybrana w menu Revise pozostaje aktywna do momentu wybrania innej opcji. Pozwala to użytkownikowi na wykonanie tej samej korekty w serii przekrojów poprzez kliknięcie obrazu przekroju i naciśnięcie przycisku Revise. Poniżej szczegółowo opisano manualne korekty różnych cech owoców.

1. Obrys
   1. Kliknij lewym przyciskiem myszy owoc w lewym oknie. Pojawi się on w prawym górnym oknie.
   2. Kliknij strzałkę obok przycisku „Revise” i wybierz opcję „Boundary” z listy rozwijanej w prawym górnym oknie. Wybierz miejsce obrysu do modyfikacji, klikając lewym przyciskiem myszy punkt początkowy i końcowy błędnego obrysu. W rezultacie wyznaczony fragment obrysu zostanie usunięty.
   3. Aby dodać nowy obrys, klikaj lewym przyciskiem myszy od punktu początkowego w stronę punktu końcowego. Kontynuuj klikanie, aby odwzorować pożądany kontur. Kliknięcie prawym przyciskiem myszy cofnie poprzednią modyfikację. Kilka modyfikacji można cofnąć poprzez kolejne kliknięcia prawym przyciskiem myszy.
   4. Aby potwierdzić nowy obrys, naciśnij klawisz „Enter”. W przeciwnym razie naciśnij klawisz „Esc”, aby anulować tę operację.
   5. Kliknij „Reset Boundary”, aby powrócić do pierwotnych ustawień obrysu.
2. Obrót. Funkcja ta jest używana, gdy obiekt nie jest całkowicie pionowy.
   1. Kliknij odpowiedni owoc w lewym oknie. Pojawi się on w prawym górnym oknie.
   2. Kliknij strzałkę obok przycisku „Revise” i wybierz z listy rozwijanej opcję „Rotate”.
   3. W prawym górnym oknie zostanie wyświetlona oś. Przeciągnij zielony kwadrat na końcu osi, a owoc obróci się odpowiednio.
   4. Kliknij dwukrotnie wewnątrz okna lub naciśnij klawisz „Enter”, aby zakończyć.
   5. Kliknij „Reset Rotation”, aby powrócić do oryginalnego ustawienia.
3. Korekta końca proksymalnego. Jeśli występuje błąd w pozycji końca proksymalnego, pomiary uzyskane dzięki tej funkcji będą nieprawidłowe. Wybierz owoc wymagający korekty, tak aby pojawił się on w oknie po prawej stronie. Następnie wybierz kartę „Proximal fruit end shape” oraz opcję „Proximal angle micro or macro” w sekcji wyjściowej danych poniżej wybranego owocu. Kąty proksymalne zostaną teraz wyświetlone dla każdego owocu na obrazie po lewej stronie. W ten sposób można zidentyfikować kąty, które wydają się nietypowe. Aby zmienić pozycję końca proksymalnego, wykonaj następujące kroki:
   1. Kliknij wybrany owoc w lewym oknie. Pojawi się on w prawym górnym oknie.
   2. Kliknij strzałkę obok przycisku „Revise” i wybierz z listy rozwijanej opcję „Proximal End”.
   3. W prawym górnym oknie kliknij i przeciągnij wskaźnik wierzchołka do prawidłowej pozycji.
   4. Kliknij dwukrotnie lub naciśnij klawisz „Enter”, aby zakończyć.
4. Korekta końca dystalnego. Pozycję końca dystalnego obiektu można również zmienić ręcznie. Aby sprawnie znaleźć owoce wymagające korekty końca dystalnego, zastosuj tę samą procedurę co w przypadku końca proksymalnego.
   1. Kliknij wybrany owoc w lewym oknie. Pojawi się on w prawym górnym rogu.
      Kliknij strzałkę obok przycisku „Revise” i wybierz z listy rozwijanej opcję „Distal End”.
   2. W prawym górnym oknie kliknij i przeciągnij wskaźnik wierzchołka do prawidłowej pozycji.
   3. Kliknij dwukrotnie lub naciśnij klawisz „Enter”, aby zakończyć.
5. Wystup końca dystalnego. Funkcja ta pozwala użytkownikowi zdefiniować punkty końcowe na obrysie wierzchołka.
   1. W karcie „Distal Fruit End Shape” wybierz kolumnę oznaczoną jako „Distal End Protrusion” i zaznacz obiekt do korekty.
   2. Kliknij strzałkę obok przycisku „Revise” i wybierz z menu rozwijanego opcję „Adjust Distal Protrusion”.
   3. Przeciągnij pojawiające się punkty do pożądanych pozycji wzdłuż obrysu.
   4. Naciśnij klawisz Enter, aby zakończyć. Pojawi się linia wskazująca odcięcie obszaru wierzchołka, a następnie obszar ten zostanie przeliczony. Wyniki pojawią się w kolumnie Distal End Protrusion. Jeśli obszar wierzchołka nie znajduje się w pożądanej pozycji, wybranie opcji „Reset Distal Protrusion” pod przyciskiem „Revise” przywróci punkty do ich początkowych pozycji. Jeśli obszar wierzchołka został znaleziony, ale nie powinien istnieć, wybranie opcji „Eliminate Distal Protrusion” z przycisku „Revise” przesunie punkty na dół owocu, co spowoduje uzyskanie wartości 0,0 w kolumnie „Distal End Protrusion”.
6. Auto-obrót. Funkcja ta została opracowana specjalnie dla nasion pomidora, aby można było je automatycznie wyrównać tak, by ich zaostrzone końce były skierowane w tę samą stronę. Obecnie funkcja auto-obrotu nie działa dla innych obiektów, takich jak owoce.
7. Korekta elipsy. Funkcja ta pozwala użytkownikowi zmienić rozmiar i/lub przenieść wewnętrzną elipsę w celu zdefiniowania wewnętrznych obszarów owocu. Atrybut ten jest wykorzystywany w funkcji Internal Eccentricity oraz atrybucie Fruit Shape Index Internal w programie TA.
   1. Wybierz kartę Internal Eccentricity, a następnie zaznacz dowolną kolumnę w tej karcie. Wybierz „Default ellipse size” z menu „Settings”.
   2. Wybierz obiekt i kliknij przycisk „Revise”. Wybierz z menu rozwijanego opcję „Adjust Ellipse”.
   3. Pojawią się dwa punkty reprezentujące górny i lewy punkt elipsy. Ich przesuwanie zmienia zarówno rozmiar, jak i położenie środka elipsy względem dwóch nowych punktów.
   4. Po ustawieniu tych punktów w pożądanych pozycjach naciśnij klawisz Enter. Elipsa zostanie przerysowana. Jeśli pozycja jest prawidłowa, naciśnij Enter ponownie, a wartości w kolumnach zostaną zaktualizowane.
   5. Jeśli wewnętrzna elipsa musi zostać przeniesiona bez zmiany jej kształtu, kliknij w środek obiektów, w miejscu, gdzie znajdowały się punkty. Pojawią się dwie linie i trzy zielone punkty. Przenieś punkt znajdujący się mniej więcej w centrum owocu w nowe miejsce, aby przesunąć elipsę bez zmiany jej rozmiaru.
   6. Naciśnij Enter, aby zakończyć.
8. Korekta obrysu perykarpium. Funkcja ta pozwala użytkownikowi zdefiniować obszar perykarpium i musi zostać dostosowana, gdy w karcie „Latitudinal section” wybrano opcje „Pericarp area” oraz „Pericarp thickness”.
   Uwaga: w przypadku owoców przdojrzałych odróżnienie perykarpium od pozostałej części owocu może być trudne lub niemożliwe.
   1. Wybierz obiekt i kliknij rozwijane menu „Revise”. Wybierz „Default pericarp boundary” i ustaw domyślny obrys najlepiej pasujący do perykarpium.
   2. Aby wprowadzić dalsze korekty, wybierz z rozwijanego menu „Revise” opcję „Adjust pericarp boundary”.
   3. W prawym górnym oknie wybierz miejsce obrysu perykarpium, które wymaga modyfikacji. Odbywa się to poprzez kliknięcie lewym przyciskiem myszy punktu początkowego i końcowego błędnego obrysu. W rezultacie wyznaczony fragment obrysu zostanie usunięty. Dla uzyskania najlepszych rezultatów za jednym razem należy wybierać jak najmniejszy fragment obrysu.
   4. Aby dodać nowy obrys, klikaj lewym przyciskiem myszy od drugiego punktu z powrotem do pierwszego. Kontynuuj klikanie, aby odwzorować pożądany kontur. Kliknięcie prawym przyciskiem myszy cofnie poprzednią modyfikację. Kilka modyfikacji można cofnąć poprzez kolejne kliknięcia prawym przyciskiem myszy.
      Uwaga: Zbyt wiele modyfikacji obrysu perykarpium może doprowadzić do zawieszenia programu.
   5. Aby potwierdzić nowy obrys, naciśnij klawisz „Enter”. W przeciwnym razie naciśnij klawisz „Esc”, aby anulować tę operację.
   6. Wybierz „Reset Pericarp Boundary”, aby przywrócić obrys do jego pierwotnej pozycji.
9. W przypadku analizy koloru, gdy obrys miąższu nie znajduje się na krawędzi obrazu owocu (np. w przypadku cięcia poprzecznego w obrębie ramienia owocu, gdzie powyżej cięcia widoczna jest skórka, jak pokazano na Rysunku 4), użytkownik musi otworzyć okno dialogowe „Color Test” w menu „Settings”. W tym oknie minimalna wartość niebieskiego (blue) musi zostać ustawiona na 30 i zapisana. Jeśli owoce mają rozmiar < 3 cm, ustaw minimalną wartość niebieskiego na 20. Wartość ta może wymagać dalszej korekty, jeśli program TA ma problem z odnalezieniem prawidłowych obrysów.

6. Ustawienia zdefiniowane przez użytkownika

W przypadku niektórych parametrów użytkownik musi wybrać ustawienia, przy których należy przeprowadzić pomiar. Można to zrobić przed lub po analizie, w zależności od tego, czy eksperyment ma zostać powtórzony przy tych samych ustawieniach, które były stosowane wcześniej, czy też użytkownik chce przeprowadzić analizy eksploracyjne w celu określenia odpowiednich ustawień dla nowej analizy.

1. Ustawianie masywności końca dystalnego i proksymalnego. Masywność jest obliczana jako stosunek szerokości w wybranym przez użytkownika procencie wysokości najbliżej końca dystalnego/proksymalnego owocu do szerokości środkowej (Rycina 5A). Pozwala to użytkownikowi wybrać lub zmienić miejsce na obiekcie, w którym dokonuje się pomiaru. Górną i dolną pozycję masywności można zmienić, wprowadzając nową wartość w polu „Blockiness position” w sekcji przycisku „Setting”.
2. Ustawianie kątów mikro i makro. Ustawienia te są wykorzystywane do obliczania kątów w różnych pozycjach od końców owocu (Rycina 5B). Ustawienie makro jest zazwyczaj stosowane dla kątów od 5 do 40% wzdłuż obrysu, a ustawienie mikro od 2 do 10% wzdłuż obrysu.
3. Liczba punktów morfometrycznych. Funkcja ta wyznacza punkty wzdłuż obrysu każdego obiektu na wczytanym obrazie. Końce dystalny i proksymalny służą jako punkty charakterystyczne dla każdego obiektu na obrazie. Liczbę punktów mierzonych wzdłuż obrysu można wybrać w opcji „# of morphometric points” w menu „Settings”. Można wybrać od 4 do 30 punktów. Oprogramowanie automatycznie podzieli wybraną liczbę punktów na pół i równomiernie rozmieści je po obu stronach owocu pomiędzy końcem dystalnym a proksymalnym.

7. Zapisywanie i eksportowanie danych

1. Zapisywanie danych
   1. Po ręcznej korekcie obrazu i analizie obrazu za pomocą TA, kliknij przycisk „Save Fruit”. Wszystkie aktualne informacje, w tym ręczne korekty i odznaczone obiekty, zostaną zapisane w nowym pliku o tej samej nazwie co oryginalny obraz i z rozszerzeniem tmt. Za każdym razem, gdy zostanie wybrany plik, zapisany plik tmt o tej samej nazwie zostanie automatycznie otwarty, ponieważ jest powiązany z plikiem oryginalnym. Jednak plik tmt powinien być przechowywany w tym samym folderze co plik obrazu jpg (patrz sekcja 4.1). Jeśli oprogramowanie nie przechowuje plików tmt i jpg w tym samym folderze, przenieś folder z obrazami na dysk C.
   2. Aby powrócić do oryginalnego pliku obrazu, bez żadnych korekt, po prostu usuń powiązany plik tmt. Alternatywnie można wybrać opcję „Analyze” i ponownie przeanalizować oryginalny obraz. Należy jednak pamiętać, że każdy plik tmt o tej samej nazwie co obraz nadal będzie powiązany z obrazem przy następnym otwarciu pliku, chyba że korekty zostaną zapisane w pliku tmt.
2. Eksport danych
   1. Użytkownik może wyeksportować dane dla pojedynczego obrazu, wybierając przycisk „Export”. Dane zostaną wyeksportowane do pliku Excel i będą zawierać wartości atrybutów dla każdego owocu, średnią oraz odchylenie standardowe.
   2. Aplikacja TA może również eksportować wartości atrybutów z dwóch lub więcej obrazów (funkcja „Batch Analysis”).
      1. Aby rozpocząć analizę wsadową, kliknij przycisk „Open Image”.
      2. Wybierz pliki obrazów do analizy wsadowej. Wiele plików wybiera się, używając klawisza „Shift” lub „Ctrl” podczas zaznaczania dodatkowych plików. Po wybraniu plików kliknij przycisk „Open”.
      3. Użytkownik zostanie poproszony o wybranie typu wyjścia analizy wsadowej: „Average Only”, „Average and Standard Deviation” lub „Individual Measurements per image”. Przykład dwóch trybów eksportu przedstawiono na Rysunku 6.
      4. Wybierz nazwę dla pliku Excel, który zostanie utworzony, i kliknij przycisk „Save”. Oprogramowanie automatycznie otworzy pliki i rozpocznie analizę wsadową. Jeśli pliki obrazów zostały wcześniej przeanalizowane i zapisane przez TA, do analizy wsadowej zostaną otwarte zapisane pliki .tmt. Jeśli pliki nie były wcześniej analizowane, oprogramowanie przeprowadzi analizę obrazów bez ręcznych korekt i odznaczeń. TA może przeprowadzić analizę wsadową co najmniej 100 obrazów w rozdzielczości 600 dpi.
      5. Analiza wsadowa dla analizy koloru. Otwórz opcję „Color Test” w menu ustawień. Zaznacz Analizę Wsadową (Batch Analysis) i kliknij Analyze. Pojawi się nowe okno wyboru obrazów do analizy. W następnym oknie określ nazwę i katalog pliku danych. Kliknij Save. Plik wyjściowy będzie zawierał nazwę każdego obrazu (na podstawie nazwy pliku) oraz średnie wartości kolorów dla każdego owocu na obrazie. Parametry zawarte w wyniku to: parametr 1, parametr 2, wartości R, G i B, jasność, wartości L*, a* i b* oraz wartości odcienia i chromatyczności. Moduł testu kolorów może przeprowadzić analizę wsadową do 100 obrazów owoców, w zależności od sprzętu komputerowego.

8. Przykłady analizy danych

Wyniki generowane przez TA mogą być wykorzystane w wielu zastosowaniach. W badaniach genetycznych dane te służą do wykrywania QTL (Quantitative Trait Loci) kształtu owoców w kilku populacjach segregujących, pochodzących z krzyżówek między różnymi odmianami pomidora uprawnego (S. lycopersicum) a dzikim gatunkiem S. pimpinellifolium (akcesja LA1589)^1,4,5. TA może być również wykorzystywane do klasyfikacji owoców pod kątem kategorii kształtu⁶ oraz analizy przebarwień owoców pomidora wynikających z zaburzenia fizjologicznego zwanego „żółtym barkiem”³. Ponadto oprogramowanie to było stosowane do analizy innych organów roślin, takich jak liście⁷ i nasiona^8,9.

9. Reprezentatywne wyniki

Wyniki TA były wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań. W badaniach QTL kształtu owoców zebrano obrazy owoców (od 8 do 10 owoców z rośliny na jednym obrazie) z łącznie 96 do 130 roślin w każdej populacji. Następnie obrazy te przeanalizowano za pomocą TA^4,5. Aby wykryć powiązania między fenotypami a genotypami, analizy QTL przeprowadzono z wykorzystaniem mapowania przedziałowego złożonego (composite interval mapping)^10,11 oraz wielocechowego mapowania przedziałowego złożonego dla podzbiorów cech w każdej populacji¹². W rezultacie zidentyfikowano wiele regionów genomu pomidora kontrolujących kształt owoców. Niektóre z tych regionów występowały w kilku populacjach, podczas gdy inne były unikalne dla jednej populacji. Choć niektóre QTL kształtu owoców (takie jak ovate, sun i fs8.1) były znane z wcześniejszych badań mapowania, odkryto kilka innych nowych loci. Łącznie w trzech populacjach segregujących wykryto od 17 do 36 QTL kontrolujących cechy kształtu owoców^2,4.

Dane wygenerowane przez TA zostały również przeanalizowane przy użyciu analizy głównych składowych (PCA). W jednym z badań PCA poddano piętnastu atrybutom kształtu, a następnie trzy pierwsze główne składowe (PC) zmapowano jako cechy. Dane wykazują, że QTL dla PC pokrywały się z QTL atrybutów, które przyczyniały się do danej składowej⁴. Populacje segregujące zostały również wykorzystane do porównania QTL zidentyfikowanych za pomocą morfometrii z QTL zidentyfikowanymi na podstawie atrybutów kształtu. Ponownie wykazano, że QTL morfometryczne w 93% przypadków pokrywały się z QTL kontrolującymi atrybuty kształtu i wielkości owoców². Wyniki te wyraźnie potwierdzają poprawność i powtarzalność danych generowanych przez TA w analizie morfologii owoców.

Inną zastosowaniem TA jest stworzenie systemu klasyfikacji kształtu owoców w celu identyfikacji odmian pomidora na podstawie obiektywnych pomiarów kształtu owoców. Oceńiono kolekcję plazmową obejmującą około 350 accessionów pomidora o różnym pochodzeniu i morfologii owoców. Około ośmiu owoców z każdej rośliny zostało zdigitalizowanych i przeanalizowanych za pomocą TA. Dwa istniejące systemy klasyfikacji, IPGRI¹³ oraz UPOV¹⁴, zostały ocenione i porównane poprzez wizualne zestawienie z obrazami owoców w naszej kolekcji. Zmodyfikowano klasyfikację morfologiczną tych dwóch systemów poprzez połączenie kilku kategorii oraz stworzenie dwóch nowych⁶. Zaproponowane kategorie to: spłaszczony, okrągły, długi, prostokątny, odwajajecowaty, elipsoidalny, sercowaty oraz wołowe serce. Osiem nowych kategorii dostosowanych z systemów IPGRI¹³ i UPOV¹⁴ jest bardziej rozróżnialnych wizualnie i zostało przetestowanych przy użyciu pomiarów TA. Wyniki TA obejmujące 37 atrybutów dla każdego accessionu poddano analizie PCA oraz liniowej analizie dyskryminacyjnej (LDA), aby zidentyfikować pomiary najlepiej definiujące każdą kategorię kształtu owoców, a także ocenić, jak dokładnie atrybuty dyskryminacyjne wyjaśniają wizualną klasyfikację każdego accessionu. Jednym z możliwych zastosowań tego systemu klasyfikacji kształtu owoców byłoby wykorzystanie wyników TA do grupowania accessionów na podstawie danych fenotypowych oraz identyfikacji powiązań między różnymi kategoriami kształtu owoców.

Moduł Color Test w programie TA porównano z pomiarami barwy wykonanymi kolorymetrem (CR300) w populacji wsobicznej z krzyżowania wstecznego (IBC) pochodzącej z krzyżówek odmian przetwórczych S. lycopersicum³. Wartości L*, a* oraz b* z kolorymetru były porównywalne z wartościami barwy uzyskanymi za pomocą trzech różnych skanerów przy użyciu TA. Zaobserwowano jednak różnice między trzema skanerami wynikające z różnic w sprzęcie, oprogramowaniu lub niestandaryzowanych wartościach RGB. W związku z tym w module Color Test zaimplementowano opcję wprowadzania wartości korekcyjnych w celu umożliwienia kalibracji skanera. W badaniu genetycznym z wykorzystaniem modułu Color Test z TA wariancja genetyczna dla barwy oraz jednolitości barwy była znacznie wyższa niż w przypadku uzyskania tych wartości za pomocą kolorymetru. Różnice te wynikają z faktu, że TA mierzy parametry barwy całej powierzchni, podczas gdy kolorymetr analizuje jedynie kilka punktów na powierzchni. Na koniec przetestowano TA, który okazał się zdolny do analizy barwy i jednolitości barwy w innych uprawach, takich jak ziemniak, ogórek, melon miodowy i truskawka³.

Rycina 1. Standardowy wzornik kolorów dla modułu Color Test służący do kalibracji wartości kolorów uzyskanych z różnych skanerów i w różnych odstępach czasu.

Rysunek 2. Do prawidłowego funkcjonowania TA wymagane są wysokiej jakości zdigitalizowane obrazy. A) Przykład obrazu niskiej jakości. TA będzie próbować wyszukiwać obiekty na całym obrazie. W przypadku występowania dużych pustych przestrzeni, jak pokazano tutaj, TA może nie działać prawidłowo lub ulec awarii. Niektóre owoce nie zostały osuszone, a sok na ekranie skanera uniemożliwi TA rozpoznanie prawidłowej granicy owocu. Ponadto, gdy większość owoców jest błędnie zorientowana w pionie, wiele atrybutów nie zostanie obliczonych prawidłowo. Obrazy słabej jakości znacznie spowolnią analizę kształtu owoców ze względu na rozległe korekty manualne, które będą musiały zostać wykonane przed analizą. B) Przykład obrazu wysokiej jakości. Owoce są prawidłowo zorientowane w pionie, rozmieszczone blisko siebie, ale nie stykają się, oraz zostały osuszone.

Rysunek 3. Zrzut ekranu oprogramowania TA. Górne okno pokazuje przyciski kilku dostępnych narzędzi (np. otwórz obraz, zapisz owoc, eksportuj dane, dopasuj rozmiar, analizuj i popraw). Obiekt w prawym górnym oknie został wybrany do ręcznych korekt, a dane są wyświetlane w prawym dolnym oknie. Wartości dla tego owocu są wyróżnione kolorem szarym w prawym dolnym oknie danych. Obiekty obrysowane na żółto w lewym oknie zostaną uwzględnione w analizach, natomiast obiekty obrysowane na niebiesko nie zostaną uwzględnione w analizach.

Rycina 4. Obraz wykorzystywany w aplikacji Tomato Analyzer - Color Test.

Rycina 5. Ustawienia zdefiniowane przez użytkownika. A) Atrybuty kanciastości (blockiness). Położenie górne służy do obliczania kanciastości końca proksymalnego oraz atrybutów trójkąta. Ustawienie Położenia górnego określa miejsce pomiaru X (=10% na rysunku). Położenie dolne służy do obliczania kanciastości końca dystalnego oraz atrybutów trójkąta. Ustawienie Położenia dolnego określa miejsce pomiaru Y (= 90% na rysunku). Wartości dla tych pozycji odpowiadają procentowi wysokości mierzonej od góry owocu. B) Atrybuty makro kątów. Zielone linie reprezentują procent (=20% na rysunku) wzdłuż krawędzi od końca (czarny kwadrat na rysunku), w którym mierzony będzie kąt. Oprogramowanie wyznaczy nachylenie, korzystając z +/- 5% wybranej wartości. W przypadku mikro kątów oprogramowanie wyznaczy nachylenie, korzystając z +/- 2% wybranej wartości.

Rysunek 6. Przykład danych wyjściowych uzyskanych za pomocą narzędzia Export z obrazu przedstawionego na Rysunku 3. A) Wynik przedstawiający wartości atrybutów dla każdego owocu, średnią oraz odchylenie standardowe. B) Wynik przedstawiający średnie wartości atrybutów oraz odchylenie standardowe dla 10 odmian pomidora.

	L*	a*	b*
1	37.986	13.555	14.059
2	65.711	18.13	17.81
3	49.927	-4.88	-21.925
4	43.139	-13.095	21.905
5	55.112	8.844	-25.399
6	70.719	-33.397	-0.199
7	62.661	36.067	57.096
8	40.02	10.41	-45.964
9	51.124	48.239	16.248
10	30.325	22.976	-21.587
11	72.532	-23.709	57.255
12	71.941	19.363	67.857
13	28.778	14.179	-50.297
14	55.261	-38.342	31.37
15	42.101	53.378	28.19
16	81.733	4.039	79.819
17	51.935	49.986	-14.574
18	51.038	-28.631	-28.638
19	96.539	-0.425	1.186
20	81.257	-0.638	-0.335
21	66.766	-0.734	-0.504
22	50.867	-0.153	-0.27
23	35.656	-0.421	-1.231
24	20.461	-0.079	-0.973

Tabela 1. Wartości L*, a*, b* dla każdego pola wzornika kolorów (patrz Rysunek 1). Jako źródło oświetlenia zastosowano D50, a kąt obserwatora wynosił 2°.

Dyskusja

Wysokoprzepustowa i dokładna ocena morfologii oraz koloru organów roślin jest trudna ze względu na ilościowy charakter tych cech i często subiektywny sposób ich kwantyfikacji. TA zapewnia obiektywne i dokładne pomiary kilku morfologicznych i kolorymetrycznych cech owoców w sposób wysokoprzepustowy i półautomatyczny. Użyteczność TA została wykazana w badaniach, które doprowadziły do identyfikacji QTL kształtu owoców pomidora^2,4,5. Ponadto, z wykorzystaniem wyników z TA przeprowadzono klasyfikację odmian6 oraz ocenę taksonomii grupy gatunków^15,16. Wysoka ekspresja genu kształtu owoców pomidora SUN prowadzi do powstania wydłużonych owoców¹⁷. Przy użyciu TA określono kształt liści i liści zakotwiczeniowych w liniach wykazujących wysoki poziom ekspresji SUN⁷, co dowiodło, że aplikacja może być skutecznie wykorzystywana również do pomiaru morfologii innych organów roślin. Co więcej, TA odegrała kluczową rolę w identyfikacji podłoża genetycznego wielkości nasion u pomidora i słonecznika^8,9. Na koniec, moduł Color Test zaimplementowany w TA jest bardziej precyzyjny, dokładny i tańszy niż inne metody analizy koloru owoców pomidora. Podsumowując, TA stała się kluczowym narzędziem do obiektywnej i wiarygodnej oceny zmienności morfologicznej i kolorystycznej organów roślin.