Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Podsumowanie

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Streszczenie

Angiogeneza to złożony, wieloetapowy proces, w którym w odpowiedzi na bodźce angiogenne z istniejącego układu naczyniowego powstają nowe naczynia. Etapy te obejmują: degradację błony podstawnej, proliferację i migrację (kiełkowanie) komórek śródbłonka (EC) do macierzy zewnątrzkomórkowej, układanie się komórek śródbłonka w sznury, rozgałęzianie, tworzenie światła naczynia, anastomozy oraz formowanie nowej błony podstawnej. Opracowano wiele testów in vitro do badania tego procesu, jednak większość z nich naśladuje jedynie określone stadia angiogenezy, a naczynia w tych testach często nie przypominają morfologicznie naczyń in vivo. W oparciu o wcześniejsze prace Nehlsa i Drenckhahna zoptymalizowaliśmy test angiogenezy in vitro z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej oraz fibroblastów. Model ten odtwarza wszystkie kluczowe wczesne etapy angiogenezy, a co istotne, naczynia wykazują drożne światła wewnątrzkomórkowe otoczone spolaryzowanymi komórkami śródbłonka. Komórki śródbłonka są nanoszone na mikronośniki Cytodex i zatapiane w żelu fibrynowym. Fibroblasty są nakładane warstwą na wierzch żelu, gdzie dostarczają niezbędnych czynników rozpuszczalnych, które stymulują kiełkowanie komórek śródbłonka z powierzchni kulek. Po kilku dniach powstaje liczne naczynia, które można łatwo obserwować w mikroskopie fazowo-kontrastowym oraz w technice time-lapse. Niniejsze wideo prezentuje kluczowe kroki przygotowania tych hodowli.

Protokół

PRZYGOTOWANIE KOMÓREK

1. Hodować komórki HUVEC i fibroblasty w pożywce M199 z dodatkiem 10% FBS i Pen-Strep (1:100) przez 1–2 dni przed formowaniem kulek.
2. Zmień pożywkę na EGM-2 (Clonetics) dzień przed formowaniem kuleczek w przypadku HUVEC oraz dzień przed zamykaniem w hydrożelu w przypadku fibroblastów.
3. A wymagane jest stężenie wynoszące ok. 400 komórek HUVEC na kuleczkę.
4. Wymagane jest 20 000 fibroblastów na dołek.

POKRYWANIE KULEK KOMÓRKAMI HUVEC – DZIEŃ -1

1. Przeprowadzić trypsynizację komórek HUVEC.
2. Pozostawić kuleczki do osadzenia (NIE WIROWAĆ!). Odessać nadsącz i krótko przemyć kuleczki w 1 mL ciepłego medium EGM-2.
3. W probówce do FACS zmieszać 2500 kuleczek z 1X10⁶ komórek HUVEC w 1,5 mL ciepłego medium EGM-2. Umieścić probówkę pionowo w inkubatorze. (Ilość ta będzie wystarczająca dla ok. 10 studzienek. W razie potrzeby zwiększyć skalę)
4. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37°C, wstrząsając probówką co 20 min. (Prawidłowe pokrycie kuleczek jest kluczowe dla procesu kiełkowania.)
5. Po 4 godzinach przenieść pokryte kuleczki do kolby T25 w 5 mL medium EGM-2 i pozostawić przez noc.

OSADZANIE POWLEKANYCH KULEK W ŻELU FIBRYNOWYM - DZIEŃ 0

1. Przygotować 2.0 mg/mL roztwór fibrynogenu (zob. sekcję z recepturami).
2. Do roztworu fibrynogenu dodać 0.15 Units/mL aprotininy.
3. Przenieść powlekane kuleczki do stożkowej probówki 15mL i odstawić do sedymentacji. Resuspendować kuleczki w 1mL EGM-2 i przenieść do probówki wirówkowej 1.5mL.
4. Przemyć kuleczki 3X w 1mL EGM-2, powoli pipetując ciecz w górę i w dół.
5. Policzyć kuleczki na szkiełku nakrywnym i resuspendować w roztworze fibrynogenu do stężenia ~500 beads/mL.
6. Do każdego dołka dodać 0.625 Units/mL trombiny.
7. Do każdego dołka płytki 24-dołkowej dodać 0.5 mL zawiesiny fibrynogenu z kuleczkami.
   
   Zmieniać końcówkę pipety dla każdego dołka !!!
   
   
8. Wymieszać trombinę z fibrynogenem, delikatnie pipetując w górę i w dół około 4 do 5 razy. Należy uważać, aby nie wytworzyć dużych pęcherzyków powietrza.
9. Pozostawić płytkę na 5 min w dygestorium, a następnie umieścić w inkubatorze 37°C na 10-15 min w celu wytworzenia skrzepu.
10. Podczas oczekiwania na utworzenie się skrzepu przeprowadzić trypsynizację fibroblastów.
11. Do każdego dołka dodać kroplami 1 mL EGM-2.
12. Wysiać fibroblasty na powierzchnię żelu fibrynowego w zagęszczeniu 20 000 komórek na dołek.

UWAGI:

Zazwyczaj po utworzeniu się żelu fibrynowego w żelu widoczne są maleńkie pęcherzyki powietrza. Nie należy się nimi niepokoić, ponieważ znikną one w ciągu 3-4 dni.

Wymieniaj pożywkę co drugi dzień, t.j. w dniu 2, 4, 6 itd...

W 3. lub 4. dniu powinny zacząć pojawiać się pędy.

Dyskusja

Rośnie przekonanie, że trójwymiarowe (3D) testy angiogenezy in vitro stanowią model znacznie bardziej zbliżony do rzeczywistego środowiska in vivo niż to, co można osiągnąć w hodowlach 2D. Oczywiste jest, że doskonałe systemy 3D powinny być powtarzalne i zdolne do naśladowania kilku głównych etapów angiogenezy. Choć opracowano już kilka wcześniejszych testów 3D, wiele z nich wykorzystuje trudnodostępne komórki mikrovascularne lub odtwarza jedynie niektóre etapy procesu. W tym filmie opisujemy i przeprowadzamy zoptymalizo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kuleczki Cytodex-3	Odczynnik	Amersham	17-0485-01	10 g/opakowanie. 1.0.5 g suchych kuleczek hydratuje się i pęcznieje w 50 mL PBS (pH = 7.4) przez co najmniej 3 h w RT. Należy użyć probówki 50 mL i umieścić ją na homogenizatorze obrotowym.2.Pozostawić kuleczki do osadzenia (~ 15 min). Odlać nadsącz i przemyć kuleczki przez kilka minut w świeżym PBS (50 mL).3.Odlać PBS i zastąpić świeżym PBS: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 kuleczek/mL lub 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 kuleczek/mL4.Umieścić zawiesinę kuleczek w silikonizowanej butelce szklanej (Windshield Wiper lub Sigmacote).5.Sterylizować kuleczki w autoklawie przez 15 min w 115°C.6.Przechowywać w 4°C.
Aprotynina	Odczynnik	Sigma-Aldrich	A-1153	10 mg/opakowanie. Zrekonstytuować liofilizowaną aprotyninę do stężenia 4 U/mL w wodzie DI. Przefiltrować sterylnie. Przygotować aliquoty po 1 mL każdy. Przechowywać w -20 °C.
Fibrynogen typu I	Odczynnik	Sigma-Aldrich	F-8630	1 g. Rozpuścić 2 mg/mL fibrynogenu w DPBS. Należy odnotować % białka krzepliwego i odpowiednio dostosować. Podgrzać w kąpieli wodnej 37 °C, aby rozpuścić fibrynogen. Mieszać poprzez odwracanie probówki. Nie używać wirówki typu vortex. Przefiltrować sterylnie przez membranę 0.22 um
Trombina	Odczynnik	Sigma-Aldrich	T-3399	22 mg = 1,000 jednostek. Zrekonstytuować w sterylnej wodzie do stężenia 50 U/mL. Przygotować aliquoty po 0.5 mL każdy. Przechowywać w -20 °C.