Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Podsumowanie

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Streszczenie

Usuwanie genów i nadekspresja białek to powszechne metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek wSaccharomyces cerevisiaeChociaż niniejszy protokół opiera się na nadekspresji białka, można go łatwo dostosować do fenotypów morfologicznych zależnych od supresji ekspresji białka. Nasze laboratorium jest zainteresowane badaniem właściwości sygnałowych białka adaptorowego endocytozy epsyny. W tym celu zastosowaliśmy podejście z wykorzystaniem dominującego negatywu, w którym nadekspresywowano konserwowanąEProszę podać treść HTML do przetłumaczenia. Nie załączyłeś żadnego tekstu w swojej wiadomości.NDepending on the input you provide, I will translate the HTML content. Please provide the source HTML.TWygląda na to, że Twoja wiadomość została przerwana. Czy chciałbyś przekazać treść do tłumaczenia, czy potrzebujesz pomocy w czymś innym?Hdomena homologiczna (ENTH), aby zakłócić funkcje endogennej epsyny-2 (Ent2 lub YLR206W). Zaobserwowaliśmy, że nadekspresja domeny ENTH białka Ent2 (ENTH2) w komórkach typu dzikiego prowadziła do defektu podziału komórkowego, który zależy od błędnej lokalizacji rodziny białek rusztowaniowych – septyn.

Protokół

A. Hodowla komórek i indukcja białka

W tej sekcji opisano warunki hodowli komórkowej, synchronizację cyklu komórkowego za pomocą nocodazolu, a następnie indukcję ekspresji białka z promotora regulowanego w komórkach drożdży.

1. Szczep drożdży typu dzikiego W303 (leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15) jest transformowany plazmidowym DNA o wysokiej liczbie kopii (2μ), zawierającym gen docelowy (ENTH2) pod kontrolą promotora tłumionego przez metioninę (MET25). Stężenie 2mM metioniny jest wystarczające do zahamowania aktywności promotora, natomiast pożywki pozbawione metioniny umożliwiają maksymalną ekspresję. W związku z tym można zastosować różne stężenia metioniny, aby uzyskać pożądany poziom ekspresji białka. Transformację DNA plazmidowego w komórkach W303 przeprowadza się metodą LiAc-TE zgodnie ze standardowymi procedurami.²
   Uwaga: Eksperyment ten należy przeprowadzić, hodując komórki przez noc w obecności 2mM metioniny, aby zapewnić ekspresję białka jedynie na poziomie tła. Następnego ranka ekspresję białka należy indukować poprzez resuspensję komórek w pożywce pozbawionej metioniny bezpośrednio po synchronizacji cyklu komórkowego (około 4h). Stwierdzono jednak, że fenotyp podziału komórkowego zależny od ENTH2 indukuje się dopiero po nagromadzeniu w komórkach znacznego stężenia ENTH2 (zazwyczaj po 4-6h indukcji białka³), co sprawia, że przebieg czasowy analizy wszystkich przejawów fenotypu jest bardzo długi (co najmniej 16h). Zaobserwowano, że hodowanie komórek przez noc w obecności 0,2mM metioniny tłumi fenotyp morfologiczny, ale pozwala na utrzymanie podkrytycznego stężenia białka, które można szybko zwiększyć do poziomów indukujących fenotyp po przeniesieniu na pożywkę pozbawioną metioniny. Umożliwia to szczegółową analizę ciężkich przejawów defektu podziału komórkowego w stosunkowo krótszym czasie. Zaleca się zatem, aby badacz dobierał stężenie metioniny poniżej progu indukcji fenotypu w zależności od konkretnego przypadku.
2. Wybrać sześć kolonii z płytki zawierającej niedawno transformowane komórki i zaszczepić je do 50 ml selektywnej pożywki z 0,2mM metioniny w sterylnej kolbie stożkowej, stosując standardowe techniki sterylne. Inkubować przez noc w temperaturze 30°C przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm. (Więcej informacji na temat standardowych warunków hodowli drożdży znajduje się w ref. 4)
3. Następnego ranka oszacować gęstość komórek, mierząc gęstość optyczną kultury przy 600nm. Przenieść ilość komórek odpowiadającą 20 OD_600nm do sterylnej probówki do wirowania i zebrać poprzez wirowanie przy 2200 rpm przez 5min w temperaturze pokojowej.
4. Resuspender komórki w YPD do stężenia 0,4 OD_600nm/ml i dodać Nocodazole do końcowego stężenia 15μg/ml ze stoku 1mg/ml w DMSO. Inkubować przez 4h w temperaturze 30°C przy wstrząsaniu z prędkością 200rpm.
   Uwaga: Można zastosować alternatywne metody zatrzymania cyklu, w tym zatrzymanie w fazie G0 przy użyciu czynnika alfa lub w fazie G1-S przy użyciu hydroksymocznika. Stwierdzono, że zatrzymanie w mitozie przy użyciu Nocodazole jest wystarczająco proste i skuteczne dla naszych celów.
5. Po 4h sprawdzić odsetek komórek zatrzymanych w mitozie, licząc pod mikroskopem liczbę komórek z pączkami o tej samej wielkości. Jeśli odsetek zatrzymania przekracza 90%, przejść do następnego kroku. W przeciwnym razie utrzymywać komórki w Nocodazole aż do uzyskania pożądanego odsetka zatrzymania mitotycznego.
6. Zebrać komórki przez wirowanie przy 2200 rpm przez 5min i przemyć trzy razy lodowatą wodą. Po ostatnim przemyciu resuspender osad w selektywnej pożywce pozbawionej metioniny do gęstości komórek ~ 0,5 OD_600nm/ml. Przenieść połowę objętości komórek do nowej sterylnej probówki i dodać metioninę do końcowego stężenia 0,2mM. Będzie to służyć jako kontrola efektów wynikających z podstawowego poziomu ekspresji białka. Wyznacza to pierwszy punkt czasowy eksperymentu (czas = 0h). Analizować komórki co godzinę przez 6h.

B. Analiza rozwoju fenotypu

Uwaga: Wszystkie opisane poniżej metody analizy nie muszą być wykonywane jednocześnie.

Oznaczanie poziomu ekspresji białek metodą Western blotting

1. W każdym punkcie czasowym zmierz OD_600nm hodowli i zbierz ekwiwalent 2 OD_600nm komórek poprzez wirowanie przy 2200 rpm przez 5 mins.
2. Resuspenduj osad w 1ml sterylnej wody i przenieś zawiesinę do probówki eppendorfa o pojemności 1,5ml. Powtórz wirowanie, aby uzyskać osad. Odessij supernatant.
3. Resuspenduj osad w 50μl buforu do próbek SDS-PAGE Laemmli (50mM Tris pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerolu, 2% β-merkaptoetanolu i 0,006% błękitu bromofenolowego). Dodaj 50μl mytych kwasem szklanych kulek (o średnicy 0,2-0,4 mikrona) i mieszaj w wortexie przez 1 min.
4. Gotuj probówki na bloku grzewczym w 95°C przez 2 mins, ponownie wymieszaj w wortexie przez 30 secs, a następnie kontynuuj gotowanie przez 5 mins. Zamroź próbkę białka w -20°C.
5. Rozdziel próbki białek na żelu SDS-PAGE 12%, przenieś je na membranę nitrocelulozową i przeprowadź analizę Western blotting z użyciem odpowiednich przeciwciał w celu wykrycia białka docelowego. W tym przykładzie badamy obecność domen ENTH znakowanych hemaglutyniną (HA), inkubując je z przeciwciałem mysim anty-HA (Covance, Princeton, NJ) w rozcieńczeniu 1:2000 w buforze Blotto-Tween (1XPBS, 5% beztłustego mleka w proszku, 0,1% Tween). Pozwala się, aby przeciwciało wtórne kozie anty-mysie znakowane HRP (Pierce) w rozcieńczeniu 1:2500, również w Blotto-Tween, związało się z przeciwciałem pierwotnym na membranie przez 1h w temperaturze pokojowej. Do wykrycia przeciwciała anty-mysiego znakowanego HRP zastosowano substrat chemiluminescencyjny Supersignal West Pico.
6. Ilościowo określ poziomy ekspresji białka za pomocą densytometrii.

W tej sekcji opisano dwie metody śledzenia rozwoju fenotypu w funkcji zwiększenia stężenia białka. Pierwsza metoda opiera się na populacji komórek, natomiast druga analizuje go na poziomie pojedynczej komórki.

Ilościowe oznaczenie fenotypu podziału komórek i śmierci komórkowej

1. W każdym punkcie czasowym przenieść 1ml zawiesiny komórkowej do sterylnej probówki Eppendorf, stosując techniki sterylne, a następnie zebrać komórki poprzez wirowanie przy 2200 rpm przez 5 mins.
2. Odssać nadsącz i resuspender osad w 70μl medium, a następnie dodać 30μl błękitu metylenowego z roztworu stokowego o stężeniu 1mg/ml w sterylnej wodzie. Błękit metylenowy jest niebieskim barwnikiem witalnym, który staje się bezbarwny w środowisku redukującym cytozolu, w związku z czym martwe komórki można zidentyfikować po ich niebieskim kolorze.
3. Nanieść pipetą ~6μl tej zawiesiny na czyste szkiełko przedmiotowe i przykryć kroplę szkiełkiem nakrywką. Delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby utworzyć cienką, jednorodną warstwę komórek między powierzchniami szkła.
4. Podzielić szkiełko nakrywkowe na 9 kwadrantów i wykonać po 3 zdjęcia z każdego kwadrantu, zgodnie z instrukcją na Rys. 2. Liczba komórek w polu nie powinna przekraczać 30 komórek, aby umożliwić dokładną kwantyfikację. Każde szkiełko nakrywkowe można obrazować przez około 15 mins, zanim pęcherzyki powietrza uszkodzą preparat.
5. Policzyć liczbę komórek wykazujących badany fenotyp. Defekt podziału komórek indukowany nadekspresją ENTH2 prowadzi do śmierci komórkowej, dlatego liczymy również liczbę martwych komórek zidentyfikowanych po niebieskim kolorze.
6. Obliczyć procent komórek o określonym fenotypie.
7. Przedstawić dane na wykresie, jak pokazano na Rys. 3.

Wizualizacja defektów specyficznych dla fenotypu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Komórki z zaburzeniami podziału, obserwowane przy nadekspresji ENTH2, często charakteryzują się defektami ściany komórkowej oraz błędną lokalizacją septyn3 (wizualizowaną za pomocą białek fuzji z GFP). Ścianę komórkową drożdży pączkujących można łatwo zwizualizować poprzez barwienie Calcofluor White (CfW), który nieodwracalnie wiąże się z chityną w ścianach komórkowych drożdży.

1. W każdym punkcie czasowym odlać 1ml kultury do sterylnej probówki typu Eppendorf i zebrać komórki poprzez wirowanie przy 2200 rpm przez 5 mins w temperaturze pokojowej.
2. Resuspender osad komórkowy w 100μl roztworu CfW o stężeniu 1mg/ml w sterylnej wodzie i inkubować przez 5 mins w temperaturze pokojowej w ciemności.
3. Zebrać komórki poprzez wirowanie i przemyć 3 razy przy użyciu 1X PBS.
4. Resuspender osad w 100μl 1X PBS i obrazować pod mikroskopem, korzystając z optyki UV (ściana komórkowa) oraz filtra FITC (GFP-septin) przy powiększeniu 100X.
5. Ilościowo określić procent komórek z defektem ściany komórkowej i błędną lokalizacją septyn, postępując zgodnie z krokami 4-6 w sekcji B.2.1.

B.3. Określanie rozwoju fenotypu na poziomie pojedynczej komórki: mikroskopia wideo time-lapse.

1. Oczyścić szkiełko przedmiotowe z wklęsłym wgłębieniem 70% alkoholem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
2. Zagotować 0,06 g agarozy w 5 ml selektywnego podłoża pozbawionego metioniny w sterylnym szklanym probówce w mikrofalówce, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
3. Szybko nanieść pipetą 200 μl podłoża z agarozą do wgłębienia w szkiełku i przykryć je innym czystym szkiełkiem przedmiotowym, upewniając się, że pod spodem nie pozostały pęcherzyki powietrza.
4. Po zestaleniu się żelu gładko odsunąć górne szkiełko od szkiełka z wgłębieniem, utrzymując ich powierzchnie przez cały czas równolegle do siebie. Zapewnia to, że powierzchnia warstwy agarozy jest zlicowana z powierzchnią szkiełka z wgłębieniem. Oczyścić obszar szkiełka wokół warstwy agarozy delikatną chusteczką. Szkiełko jest teraz gotowe do użycia.
5. W czasie t = 4 godziny przenieść 1 ml komórek z hodowli do sterylnej probówki typu Eppendorf i zebrać poprzez wirowanie przy 2200 rpm przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   Uwaga: Zaleca się wybór późniejszego punktu czasowego, aby zapewnić wysoki poziom ekspresji białka i zagwarantować rozwój fenotypu. Wymagane są eksperymenty pilotażowe w celu ustalenia czasu indukcji dla każdego przypadku z osobna.
6. Odssać nadsącz i resuspendować komórki w 100 μl świeżego selektywnego podłoża pozbawionego metioniny.
7. Nanieść wazelinę na krawędzie szkiełka cover-slip. Następnie nanieść kroplę zawiesiny komórkowej na środek warstwy agarozy i rozprowadzić ją równomiernie, delikatnie dociskając do niej szkiełko cover-slip.
8. Uszczelnić krawędzie szkiełka cover-slip wazeliną i utrwalić jego położenie, obrysowując brzegi lakierem do paznokci. Odczekać do wyschnięcia lakieru.
9. Umieścić szkiełko na podgrzewanym stoliku mikroskopu i wybrać pole widzenia zawierające nie więcej niż 10 odpowiednio rozmieszczonych komórek. W miarę podziałów komórek pole widzenia z czasem będzie stawało się bardziej zatłoczone.
10. Wykonować zdjęcie pola widzenia co 5 minut przez ok. 5 godzin. Progresję fenotypu można badać, składając zdjęcia w film za pomocą oprogramowania ImageJ (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2005).

Uwaga: Do obrazowania żywych komórek wykorzystujemy mikroskop Zeiss Axiovert 200M, monochromatyczną kamerę cyfrową Zeiss Axiocam MRm oraz oprogramowanie do akwizycji obrazów Carl Zeiss Axiovision (wersja 4.4). Kontrolę temperatury uzyskuje się poprzez umieszczenie preparatów na podgrzewanym stoliku utrzymywanym w temperaturze 30°C za pomocą urządzenia PeCon Tempcontrol 37.

Aby uniknąć wielokrotnej konieczności ponownego ustawiania ostrości, warto zaprogramować oprogramowanie do akwizycji obrazu tak, aby automatycznie rejestrowało kilka obrazów w stosie z (z-stack) w każdym punkcie czasowym, a następnie wybrać obraz z najlepszą ostrością podczas montażu filmu. Niektóre oprogramowania do akwizycji obrazu oferują funkcję autofokusu dla eksperymentów w serii czasowej. W takim przypadku zaleca się korzystanie z tej opcji.

Komórki drożdży typu dzikiego najlepiej rosną w temperaturze 30°C, dlatego kontrola temperatury jest kluczowa. Aby zapewnić odpowiednie ciepło, pomocne jest zastosowanie zewnętrznego źródła ciepła jako uzupełnienie podgrzewanego stolika. Na przykład w naszym przypadku pozostawiamy włączone prześwietlenie białym światłem mikroskopu przez cały czas trwania obrazowania.

Kluczowe jest również unikanie pęcherzyków powietrza podczas przygotowywania warstwy agarozy i „kanapki” komórkowej. Powietrze uwięzione w pęcherzykach rozszerza się podczas długotrwałego ogrzewania, co może spowodować przemieszczenie komórek poza obszar obrazowania.

Ważne jest również upewnienie się, że pozycje poszczególnych komórek w polu widzenia nie zmieniają się znacząco w trakcie procesu obrazowania, zwłaszcza podczas prób ponownego ustawienia ostrości. Dla programu ImageJ dostępne są wtyczki do stabilizacji obrazu, które pozwalają korygować niewielkie przesunięcia pozycji komórek po zmontowaniu filmu. (http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje sposób monitorowania rozwoju fenotypu morfologicznego (komórki drożdży niezdolnej do prawidłowego podziału komórkowego) po nadekspresji białka. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zbieraniu komórek drożdży poprzez wirowanie z zalecaną prędkością, ponieważ wyższe prędkości mogą uszkodzić komórki i zafałszować wyniki. Błękit metylenowy oraz Calcofluor white należy dodać do żywych komórek bezpośrednio przed obrazowaniem, gdyż są one toksyczne. Procedurę tę można również łatwo dosto...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nocodazole	Odczynnik	Sigma-Aldrich	M1404
Błękit metylenowy 1% (w/v)	Odczynnik	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Odczynnik	Sigma-Aldrich	F3543
Wazelina	Odczynnik	VWR international	VW3339-2