Method Article

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka w pączkujących drożdżach

DOI:

10.3791/1863

⸱

March 24th, 2010

 ,  , 
1Department of Biological Sciences and Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Delcja genów i nadekspresja białek są powszechnymi metodami badania funkcji białek. W tym artykule opisano protokół analizy rozwoju fenotypu w funkcji stężenia białka na poziomie populacji i pojedynczej komórki u Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Delecja genów i nadekspresja białek są powszechnymi metodami badania funkcji białek. W tym artykule opisano protokół analizy rozwoju fenotypu w funkcji stężenia białka na poziomie populacji i pojedynczej komórki u Saccharomyces cerevisiae. Chociaż protokół ten opiera się na nadekspresji białka, można go łatwo dostosować do fenotypów morfologicznych zależnych od supresji ekspresji białka. Nasze laboratorium jest zainteresowane badaniem właściwości sygnalizacyjnych endocytarnego białka adaptorowego epsyny. W tym celu zastosowaliśmy dominujące podejście negatywne, w którym nadmiernie eksprymowaliśmy konserwatywną domenę Epsin N-T erminal Homology (ENTH) w celu zakłócenia funkcji endogennej epsyny-2 (Ent2 lub YLR206W). Zaobserwowaliśmy, że nadekspresja domeny ENTH Ent2 (ENTH2) w komórkach typu dzikiego doprowadziła do defektu podziału komórki, który jest zależny od nieprawidłowej lokalizacji rodziny białek rusztowania, septyn.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. Hodowla komórkowa i indukcja białek

Ta sekcja opisuje warunki hodowli komórek, synchronizację cyklu komórkowego z nokodazolem, a następnie indukcję ekspresji białka z regulowanego promotora w komórkach drożdży.

  1. Szczep drożdży typu dzikiego W303 (leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15) jest przekształcany z plazmidowym DNA o wysokiej kopii (2μ), który zawiera nasz gen zainteresowania (ENTH2) pod kontrolą promotora tłumionego metioniną (MET25). Metionina 2mM jest wystarczająca do tłumienia aktywności promotora, podczas gdy pożywka pozbawiona metioniny umożliwia maksymalną ekspresję. W związku ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje, w jaki sposób monitorować rozwój fenotypu morfologicznego (komórka drożdży niezdolna do prawidłowego podziału komórkowego) w przypadku nadekspresji białka. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zbieraniu komórek drożdży przez granulowanie z zalecaną prędkością wirowania, ponieważ większe prędkości mogą uszkodzić komórki i zaciemnić wyniki. Błękit metylenowy i biel kalkofluorowa powinny być dodawane do żywych komórek tuż przed obrazowaniem, ponieważ są toksyczne. Procedura ta m.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Brianowi G. Coonowi i Claudii B. Hannie za pomocne dyskusje i wsparcie. Projekt ten był wspierany przez fundusze startowe z Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu Purdue dla R. Claudio Aguilara oraz grant na badania instytucjonalne American Cancer Society dla R. Claudio Aguilara za pośrednictwem Purdue Cancer Center.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Odczynnik do nokodazoluSigma-AldrichM1404
Błękit metylenowy 1% (w/v)OdczynnikVWR internationalVW6276-0
Calcofluor WhiteOdczynnikSigma-AldrichF3543
Odczynnikdo wazelinyVWR internationalVW3339-2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
  2. Gietz, R. D., Woods, R. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein ConcentrationMorphological PhenotypeBudding YeastWestern BlottingMicroscopy AnalysisTime Lapse VideoSeptin MislocalizationCell Division DefectMethionine Repressible PromoterAgrose Bed Preparation

Related Articles