Zalewanie w plastiku i skrawanie zarodków Xenopus laevis

Podsumowanie

Przekroje w plastiku pozwalają zachować rzeczywistą morfologię tkanek w cienkich skrawkach, które można poddać immunostainingowi z użyciem fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych, co czyni tę metodę bardziej użyteczną niż skrawki z tkanek zatopionych w parafinie lub mrożonych dla wielu typów tkanek. W niniejszym filmie zaprezentowano metodę barwienia, zatapiania w plastiku i wykonywania przekrojów.

Protokół

Fiksacja

1. Przenieść całe zarodki lub wycięte eksplantaty do MEMFA lub 3,7% FA+PBS w małej szklanej fiolce scyntylacyjnej (Fisher kat# 03-339-25B). Inkubować fiolkę na nutatorze w RT wyłącznie przez 2 godziny, nie dłużej. Nie pozostawiać zarodka w FA przez więcej niż 2 godziny. Dłuższa inkubacja w FA spowoduje utwardzenie tkanki zarodkowej, co doprowadzi do słabej penetracji przeciwciał podczas procesu detekcji.
   
   
2. Odssać większość FA i dodać fiksatywa Denta do pełna fiolki (~ 4,5ml). Delikatnie odwrócić fiolkę kilka razy, aby przemyć zarodki w fiksatywie Denta, wymienić go na kolejne 4,5ml świeżego fiksatywa Denta i inkubować w -20ºC przez co najmniej 48 godzin. Inkubacja przez noc NIE jest wystarczająca. Ten etap zwiększa przepuszczalność zarodków dla przeciwciał. Zarodki mogą być przechowywane w tych warunkach przez kilka tygodni.

Immunofluorescencja

1. Rehydratyzuj preparat. Inkubuj go w szeregu rozcieńczalnym metanolu, zgodnie z poniższym schematem:
   
   

   75% MeOH/H2O	10min
   50% MeOH/PBS	10min
   25% MeOH/PBS	10min
   PBS	10min
   PBS	10min

   
   
2. Przygotuj płytki z 1,5% agarozy/PBS w plastikowych naczyniach o średnicy 60mm. Po zestaleniu agarozy wlej na jej powierzchnię PBS.
   
   
3. Przecięcie embrionów na pół: Umieść embriony na płytce z 1,5% agarozy/PBS. Chwyć embrion pęsetą i przetnij go na pół przez środek, używając cienkiego ostrza żyletki. Wybierz te okazy, które zostały pomyślnie przecięte wzdłuż prostej płaszczyzny cięcia.
   
   
   
   
4. Przenieś przecięte embriony do szklanej fiolki scyntylacyjnej z PBT. Wymień roztwór na 4,5ml 20% surowicy koziej+PBT. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny na nutatorze (blokowanie).
   
   
5. Przygotuj odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego w PBT. Na każdą próbkę wymagane jest 0,5ml roztworu. Przykładowo, do badania lokalizacji subkomórkowej C-cadherin w plastikowych przekrojach 5mm zastosowano rozcieńczenie 1/200 królika przeciwko C-cadherin pAb.
   
   
6. Odsącz roztwór blokujący i dodaj 0,5ml rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego. Ustaw fiolki pionowo w styropianowym uchwycie na probówki. Inkubuj przez noc w temperaturze 4ºC na nutatorze.
   
   
7. Usuń rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe (roztwór ten można zachować i ponownie wykorzystać w ciągu kolejnych 1-2 tygodni). Przemyj 4,5ml PBT 4 razy (każdorazowo przez 40-60 minut) w temperaturze pokojowej.
   
   
8. Wymień roztwór na 0,5ml rozcieńczenia 1/100 przeciwciała wtórnego koniugowanego z biotyną w PBT. Inkubuj przez noc w temperaturze 4ºC na nutatorze. Przykryj fiolki folią aluminiową, aby chronić biotynę przed światłem.
   
   
9. Od tego momentu należy dbać o ochronę próbki przed światłem, np. przechowując fiolki pod przykryciem lub folią aluminiową.
   
   
10. Usuń przeciwciało wtórne z biotyną (można je również ponownie wykorzystać w ciągu kolejnych 1-2 tygodni). Przemyj 4,5ml PBT 4 razy (każdorazowo przez 40-60 minut) w temperaturze pokojowej.
    
    
11. Wymień roztwór na 0,5ml rozcieńczenia 1/200 znakowanej fluorescencyjnie (FITC, Texas-red itp.) streptawidyny w PBT. Inkubuj przez noc w temperaturze 4ºC na nutatorze.
    
    
12. Usuń streptawidynę (można ją również ponownie wykorzystać). Przemyj 4,5ml PBT 3 razy (każdorazowo przez 15-30 minut) w temperaturze pokojowej.
    
    
13. Utrwal embriony w 4,5ml 3,7% FA+PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    
    
14. Przemyj dwukrotnie 4,5ml PBS.
    
    
15. Odwodnij preparat. Inkubuj go w szeregu rozcieńczalnym etanolu, zgodnie z poniższym schematem:
    
    

    30% EtOH/H2O	10 min
    50% EtOH/H2O	10 min
    75% EtOH/H2O	10 min
    100% EtOH	10 min

    
    
    
16. Preparat można przechowywać w 100% EtOH w temperaturze 4ºC pod przykryciem chroniącym przed światłem.

Infiltracja

1. Przygotować mieszaninę infiltracyjną Technovit 7100. Zazwyczaj do probówki stożkowej o pojemności 50 ml wlewa się 15 ml cieczy bazowej, dodaje 150 mg utwardzacza I i miesza na nutatorze przez 15 minut. Taką mieszaninę infiltracyjną można przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie jeden miesiąc.
   
   
2. Przeprowadzić infiltrację preparatu za pomocą mieszaniny infiltracyjnej poprzez wymianę w szeregu rozcieńczeń mieszaniny Technovit/EtOH w następujący sposób:
   
   
   1. 50% Technovit/EtOH – 1 godzina
      
      
   2. 100% Technovit – 1 godzina
      
      
   3. 100% Technovit – przez noc
      
      
3. Preparat można przechowywać w 100% mieszaninie infiltracyjnej przez maksymalnie jeden miesiąc w temperaturze 4ºC. Próbki należy przykryć, aby chronić je przed światłem.

Zatapianie

1. Przygotować mieszankę do zatapiania Technovit 7100: do probówki o pojemności 1,5ml odlać 0,75ml mieszanki do infiltracji i dodać 50µl utwardzacza II. Wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę.
   
   
2. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieść jeden preparat, który był infiltrowany przez noc, do cienkościennej probówki PCR o pojemności 0,5ml. Usunąć większość nadsączu.
   
   
3. Do preparatu dodać 0,25ml mieszanki do zatapiania przygotowanej w kroku nr 1 tej sekcji („Zatapianie”). Ustawić przekrojony embrion tak, aby płaszczyzna cięcia była skierowana w stronę dna probówki, delikatnie przesuwając go tępą igłą sekcyjną (igłą z drewnianym uchwytem).
   
   
4. Zamknąć nakrętkę i inkubować probówkę w ciemnym miejscu przez około cztery godziny, aby umożliwić polimeryzację tworzywa.
   
   
5. Przygotować mieszankę Technovit 3040. Odważyć 1 gram proszku do naczynia wagowego i dodać 0,5ml cieczy. Natychmiast wymieszać proszek z cieczą za pomocą końcówki typu bluetip. Wylać mieszankę na wierzch utwardzonego preparatu. Żółty Technovit 3040 zapobiegnie wypadnięciu całego bloku tworzywa z probówki.

Krojenie

1. Przetrzyj nóż Histoknife H ksylenem (EtOH często okazuje się niewystarczający) i zamontuj go w mikrotomie. Ustaw kąt ostrza na około 45°. Przetrzyj również ksylenem obszar stołu przed ostrzem, ponieważ czystość tego miejsca ma krytyczny wpływ na jakość wycinanych przekrojów.
   
   
2. Przetnij bok probówki i odetnij końcówkę za pomocą noża kartonowego.
   
   
   
   
3. Umieść preparat w uchwycie mikrotomu.
   
   
4. Przymocuj silikonowy izolator typu „press-to-seal” do szkiełka przedmiotowego, aby stworzyć komorę montażową dla przekrojów. Mocno dociśnij izolator do szkiełka na czystym blacie laboratoryjnym i sprawdź z drugiej strony, czy izolator przylega całkowicie i nie ma pęcherzyków powietrza. Za pomocą pipety Pasteura wlej do powstałej niecki na szkiełku czystą i ciepłą dH₂O (~ 40°C), aż do poziomu, w którym powierzchnia wody stanie się płaska, a nie wklęsła lub wypukła.
   
   
5. Rozpocznij wycinanie przekrojów. Dla badań immunofluorescencyjnych wykonuję przekroje o grubości 5 mm. W przypadku próbek do hybrydyzacji in situ grubość przekrojów można dostosować w zakresie ~ 3 - 8 mm, w zależności od celu i intensywności sygnałów.
   
   
6. Przenieś przekroje ze stołu przed ostrzem do komory montażowej z wodą, używając małego pędzla. Trzymaj pędzel z przekrojem nad powierzchnią wody i delikatnie opuść go do niej, uderzając w niego tępą igłą sekcyjną. Przekrój rozwinie się w kształt kolisty natychmiast po dotknięciu powierzchni wody.
   
   
7. Gdy większość powierzchni wody w komorze montażowej zostanie wypełniona przekrojami, odessij za pomocą pipety Pasteura prawie połowę wody. Inkubuj szkiełko na podgrzewaczu do szkiełek przez noc, aby próbka całkowicie wyschła.
   
   
8. Wykonaj przeciwbarwienie, stosując 1ml DAPI (0,1mg/ml w TE) przez pięć minut. Odessij DAPI i wysusz próbkę.
   
   
9. Usuń silikonowy izolator ze szkiełka. Teraz można wykonać zdjęcia próbki. Przechowuj próbkę w temperaturze 4°C, chroniąc ją przed światłem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PBS	Bufor			Przepis na 1 L: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 2,68 g Na2HPO (optymalizacja hiperparametrów)4·7H2O 0,2 g KH2PO4pH powinno wynosić 7,4. Doprowadzić objętość do 1 l. Sterylizować w autoklawie.
PBT	Bufor			Dodać 0,5 ml Triton X-100 oraz 1,0 g BSA (klasy biologii molekularnej, odpowiednia jest frakcja V [>99%], ale nie’do 500 ml autoklawowanego PBS. Przefiltrować przez filtr o oczkach 0,2 mm. Przechowywać w temperaturze 4°C.ºC.
·Stomatologia’utrwalacz s	Odczynnik			Wymieszać 40 ml metanolu i 10 ml DMSO. Przechowywać w –20°C.
3,7% FA+PBS	Odczynnik			Wymieszać 37% formaldehyd z buforem PBS w stosunku 1:9. Roztwór należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem, a pozostałą nadwyżkę zutylizować.
biotynilowane przeciwciało anty-mysie IgG (H+L), wytworzone u kozy	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
biotynilowane przeciwciało anty-królicze IgG (H+L), wytworzone u kozy	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Przeciwciała	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), przeciwko mysi z kozy	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Zestaw do fluorescencyjnego znakowania streptawidyną	Odczynnik	Vector Laboratories	SA-1200	Zawiera streptawidynę znakowaną trzema różnymi fluoroforami (FITC, Texas Red oraz AMCA), odpowiednią do tej procedury.
20% surowicy koziej/PBT	Bufor			Roztwór ten zostanie wykorzystany jako roztwór blokujący.
Mały pędzelek	Narzędzie
Igła dyssekcyjna z tępym grotem	Narzędzie
Kulzer Technovit 7100 GMA, 3040	Odczynnik		7100 GMA , 3040	metakrylan glikolu
Kulzer Tungsten Histoknife H	Narzędzie	Nauki o wiązkach energii	H1310
75% MeOH/H2O2O	Bufor
50% MeOH/PBS	Bufor
25% MeOH/PBS	Bufor
30% EtOH/H2O22O	Bufor
50% EtOH/H2O2O	Bufor
75% EtOH/H₂O2O	Bufor
100% EtOH	Bufor
Małe szklane fiolki scyntylacyjne	Narzędzie	Fisher Scientific	03-339-25B
Probówki PCR o cienkiej ściance 0,5 ml	Narzędzie	Produkty biologii molekularnej	3430
Izolatory z gumy silikonowej montowane na prasę	Narzędzie	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm dł. x 19 mm szer., 2,5 mm gł.
Cienkie ostrze żyletki	Narzędzie
1,5% agarozy w PBS
Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko badanemu antygenowi lub znacznikom epitopowym: przygotować odpowiednie rozcieńczenie w buforze PBT. Przeciwciało wtórne sprzężone z biotyną: przeciwciała sprzężone z biotyną są oferowane przez różnych dostawców.