Zalewanie w plastiku i skrawanie zarodków Xenopus laevis

Podsumowanie

Przekroje w plastiku pozwalają zachować rzeczywistą morfologię tkanek w cienkich skrawkach, które można poddać immunostainingowi z użyciem fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych, co czyni tę metodę bardziej użyteczną niż skrawki z tkanek zatopionych w parafinie lub mrożonych dla wielu typów tkanek. W niniejszym filmie zaprezentowano metodę barwienia, zatapiania w plastiku i wykonywania przekrojów.

Protokół

Fiksacja

1. Przenieść całe embriony lub wycięte eksplantaty do MEMFA lub 3,7% FA+PBS w małej szklanej fiolce do scyntylacji (Fisher kat. nr 03-339-25B). Inkubować fiolkę na nutatorze w temperaturze pokojowej wyłącznie przez 2 godziny, nie dłużej. Nie pozostawiać embrionu w FA przez więcej niż 2 godziny. Dłuższa inkubacja w FA spowoduje utwardzenie tkanki embrionalnej, co doprowadzi do słabej penetracji przeciwciał w procesie detekcji.
   
   
2. Odssać większość FA i dodać fiksatywa Denta aż do pełnej fiolki (~ 4,5ml). Delikatnie odwrócić fiolkę kilka razy, aby przemyć embriony w fiksatywie Denta, wymienić go na kolejne 4,5ml świeżego fik....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PBS	Bufor			Przepis na 1 L: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 2,68 g Na2HPO (optymalizacja hiperparametrów)4·7H2O 0,2 g KH2PO4pH powinno wynosić 7,4. Doprowadzić objętość do 1 l. Sterylizować w autoklawie.
PBT	Bufor			Dodać 0,5 ml Triton X-100 oraz 1,0 g BSA (klasy biologii molekularnej, odpowiednia jest frakcja V [>99%], ale nie’do 500 ml autoklawowanego PBS. Przefiltrować przez filtr o oczkach 0,2 mm. Przechowywać w temperaturze 4°C.ºC.
·Stomatologia’utrwalacz s	Odczynnik			Wymieszać 40 ml metanolu i 10 ml DMSO. Przechowywać w –20°C.
3,7% FA+PBS	Odczynnik			Wymieszać 37% formaldehyd z buforem PBS w stosunku 1:9. Roztwór należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem, a pozostałą nadwyżkę zutylizować.
biotynilowane przeciwciało anty-mysie IgG (H+L), wytworzone u kozy	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
biotynilowane przeciwciało anty-królicze IgG (H+L), wytworzone u kozy	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Przeciwciała	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), przeciwko mysi z kozy	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Zestaw do fluorescencyjnego znakowania streptawidyną	Odczynnik	Vector Laboratories	SA-1200	Zawiera streptawidynę znakowaną trzema różnymi fluoroforami (FITC, Texas Red oraz AMCA), odpowiednią do tej procedury.
20% surowicy koziej/PBT	Bufor			Roztwór ten zostanie wykorzystany jako roztwór blokujący.
Mały pędzelek	Narzędzie
Igła dyssekcyjna z tępym grotem	Narzędzie
Kulzer Technovit 7100 GMA, 3040	Odczynnik		7100 GMA , 3040	metakrylan glikolu
Kulzer Tungsten Histoknife H	Narzędzie	Nauki o wiązkach energii	H1310
75% MeOH/H2O2O	Bufor
50% MeOH/PBS	Bufor
25% MeOH/PBS	Bufor
30% EtOH/H2O22O	Bufor
50% EtOH/H2O2O	Bufor
75% EtOH/H₂O2O	Bufor
100% EtOH	Bufor
Małe szklane fiolki scyntylacyjne	Narzędzie	Fisher Scientific	03-339-25B
Probówki PCR o cienkiej ściance 0,5 ml	Narzędzie	Produkty biologii molekularnej	3430
Izolatory z gumy silikonowej montowane na prasę	Narzędzie	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm dł. x 19 mm szer., 2,5 mm gł.
Cienkie ostrze żyletki	Narzędzie
1,5% agarozy w PBS
Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko badanemu antygenowi lub znacznikom epitopowym: przygotować odpowiednie rozcieńczenie w buforze PBT. Przeciwciało wtórne sprzężone z biotyną: przeciwciała sprzężone z biotyną są oferowane przez różnych dostawców.