Zalewanie w plastiku i skrawanie zarodków Xenopus laevis

Podsumowanie

Przekroje w plastiku pozwalają zachować rzeczywistą morfologię tkanek w cienkich skrawkach, które można poddać immunostainingowi z użyciem fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych, co czyni tę metodę bardziej użyteczną niż skrawki z tkanek zatopionych w parafinie lub mrożonych dla wielu typów tkanek. W niniejszym filmie zaprezentowano metodę barwienia, zatapiania w plastiku i wykonywania przekrojów.

Protokół

Fiksacja

1. Przenieść całe embriony lub wycięte eksplantaty do MEMFA lub 3,7% FA+PBS w małej szklanej fiolce do scyntylacji (Fisher kat. nr 03-339-25B). Inkubować fiolkę na nutatorze w temperaturze pokojowej wyłącznie przez 2 godziny, nie dłużej. Nie pozostawiać embrionu w FA przez więcej niż 2 godziny. Dłuższa inkubacja w FA spowoduje utwardzenie tkanki embrionalnej, co doprowadzi do słabej penetracji przeciwciał w procesie detekcji.
   
   
2. Odssać większość FA i dodać fiksatywa Denta aż do pełnej fiolki (~ 4,5ml). Delikatnie odwrócić fiolkę kilka razy, aby przemyć embriony w fiksatywie Denta, wymienić go na kolejne 4,5ml świeżego fiksatywu Denta i inkubować w temperaturze -20ºC przez co najmniej 48 godzin. Inkubacja przez noc NIE jest wystarczająca. Ten etap zwiększa przepuszczalność embrionów dla przeciwciał. Embriony mogą być przechowywane w tych warunkach przez kilka tygodni.

Immunofluorescencja

1. Rehydratyzuj preparat. Inkubuj go w gradowanej serii metanolu, zgodnie z poniższym schematem:
   
   

   75% MeOH/H2O	10min
   50% MeOH/PBS	10min
   25% MeOH/PBS	10min
   PBS	10min
   PBS	10min

   
   
2. Przygotuj płytki z 1,5% agarozy/PBS w plastikowych naczyniach o średnicy 60mm. Po zastygnięciu agarozy wlej na jej powierzchnię PBS.
   
   
3. Przecięcie embrionów na pół: Umieść embriony na płytce z 1,5% agarozy/PBS. Chwyć embrion pęsetą i przetnij go na pół przez środek, używając cienkiej żyletki. Wybierz te okazy, które zostały pomyślnie przecięte wzdłuż prostej płaszczyzny cięcia.
   
   
   
   
4. Przenieś przecięte embriony do szklanej fiolki scyntylacyjnej z PBT. Wymień roztwór na 4,5ml 20% surowicy koziej + PBT. Inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 godziny na nutatorze (blokowanie).
   
   
5. Przygotuj odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego w PBT. Na każdą próbkę wymagane jest 0,5ml. Przykładowo, do badania lokalizacji subkomórkowej C-kadheryny w plastikowych sekcjach 5mm zastosowano rozcieńczenie 1/200 królika przeciwko C-kadherynie pAb.
   
   
6. Odsuń roztwór blokujący i dodaj 0,5ml rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego. Umieść fiolki w pozycji pionowej w styropianowym uchwycie na probówki. Inkubuj przez noc w temperaturze 4ºC na nutatorze.
   
   
7. Usuń rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe (może ono zostać zachowane i ponownie wykorzystane w ciągu kolejnych 1-2 tygodni). Przemyj 4,5ml PBT czterokrotnie (każdorazowo przez 40-60 minut) w temperaturze pokojowej.
   
   
8. Wymień roztwór na 0,5ml rozcieńczenia 1/100 przeciwciała wtórnego sprzężonego z biotyną w PBT. Inkubuj przez noc w temperaturze 4ºC na nutatorze. Przykryj fiolki folią aluminiową, aby chronić biotynę przed światłem.
   
   
9. Od tego momentu należy zachować szczególną ostrożność, aby chronić próbkę przed światłem, np. trzymając fiolki pod osłoną lub folią aluminiową.
   
   
10. Usuń przeciwciało wtórne z biotyną (może ono również być ponownie wykorzystane w ciągu kolejnych 1-2 tygodni). Przemyj 4,5ml PBT czterokrotnie (każdorazowo przez 40-60 minut) w temperaturze pokojowej.
    
    
11. Wymień roztwór na 0,5ml rozcieńczenia 1/200 znakowanej fluorescencyjnie (FITC, Texas-red itd.) streptawidyny w PBT. Inkubuj przez noc w temperaturze 4ºC na nutatorze.
    
    
12. Usuń streptawidynę (może ona również zostać ponownie wykorzystana). Przemyj 4,5ml PBT trzykrotnie (każdorazowo przez 15-30 minut) w temperaturze pokojowej.
    
    
13. Utrwal embriony w 4,5ml 3,7% FA + PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    
    
14. Przemyj dwukrotnie 4,5ml PBS.
    
    
15. Dehydratyzuj preparat. Inkubuj go w gradowanej serii etanolu, zgodnie z poniższym schematem:
    
    

    30% EtOH/H2O	10 min
    50% EtOH/H2O	10 min
    75% EtOH/H2O	10 min
    100% EtOH	10 min

    
    
    
16. Preparat można przechowywać w 100% EtOH w temperaturze 4ºC pod osłoną chroniącą przed światłem.

Infiltracja

1. Przygotować mieszankę infiltracyjną Technovit 7100. Zazwyczaj odmierza się 15 ml cieczy bazowej do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, dodaje 150 mg utwardzacza I, a następnie miesza na nutatorze przez 15 minut. Tak przygotowaną mieszankę infiltracyjną można przechowywać w temperaturze 4°C do jednego miesiąca.
   
   
2. Infiltrować preparat mieszanką infiltracyjną, wymieniając go w gradacji mieszanki Technovit/EtOH w następujący sposób:
   
   
   1. 50% Technovit/EtOH – 1 godzina
      
      
   2. 100% Technovit – 1 godzina
      
      
   3. 100% Technovit – przez noc
      
      
3. Preparat można przechowywać w 100% mieszance infiltracyjnej do jednego miesiąca w temperaturze 4ºC. Próbki należy przykryć, aby chronić je przed światłem.

Zatapianie

1. Przygotuj mieszaninę do zatapiania Technovit 7100: przelej 0,75 ml mieszaniny infiltracyjnej do probówki 1,5 ml i dodaj 50 µl utwardzacza II. Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę.
   
   
2. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś jeden okaz, który był infiltrowany przez noc, do probówki PCR o cienkich ściankach o pojemności 0,5 ml. Usuń większość supernatantu.
   
   
3. Dodaj do okazu 0,25 ml mieszaniny do zatapiania przygotowanej w kroku nr 1 tej sekcji („Zatapianie”). Uorientuj przecięty embrion tak, aby płaszczyzna cięcia była skierowana w stronę dna probówki, delikatnie przesuwając go tępą igłą sekcyjną (igłą sekcyjną z drewnianym uchwytem).
   
   
4. Zamknij nakrętkkę i inkubuj probówkę w ciemnym miejscu przez około cztery godziny, aby umożliwić polimeryzację tworzywa.
   
   
5. Przygotuj mieszaninę Technovit 3040. Odważ 1 g proszku do naczynia wagowego i dodaj 0,5 ml cieczy. Natychmiast wymieszaj proszek z cieczą za pomocą końcówki typu bluetip. Wlej mieszaninę na wierzch utwardzonego okazu. Żółty Technovit 3040 zapobiegnie wypadnięciu całego plastikowego bloku z probówki.

Przygotowanie skrawków

1. Przetrzyj nóż Histoknife H ksylenem (EtOH często okazuje się niewystarczający) i zamontuj go w mikrotomie. Ustaw kąt ostrza na około 45°. Przetrzyj również obszar stolika przed ostrzem ksylenem, ponieważ czystość tego miejsca jest krytyczna dla jakości wycinanych skrawków.
   
   
2. Przetnij bok probówki i odlej końcówkę za pomocą noża kartonowego.
   
   
   
   
3. Umieść preparat w uchwycie mikrotomu.
   
   
4. Przymocuj silikonowy izolator typu „press-to-seal” do szkiełka przedmiotowego, aby stworzyć komorę montażową dla skrawków. Mocno dociśnij izolator do szkiełka na czystym blacie i sprawdź z drugiej strony, czy izolator jest całkowicie przylegający i nie ma pęcherzyków powietrza. Za pomocą pipety Pasteura wlej do powstałego zagłębienia na szkiełku czystą i ciepłą dH₂O (~ 40°C), aż do poziomu, w którym powierzchnia wody stanie się płaska, a nie wklęsła lub wypukła.
   
   
5. Rozpocznij wykonywanie skrawków. Do badań immunofluorescencyjnych wykonuję skrawki o grubości 5 mm. W przypadku próbek do hybrydyzacji in situ grubość skrawków można dostosować w zakresie ~ 3 - 8 mm, w zależności od celu badania i intensywności sygnałów.
   
   
6. Przenieś skrawki ze stolika przed ostrzem do komory montażowej z wodą, używając małego pędzelka. Przytrzymaj pędzelek ze skrawkiem nad lustrem wody i zwolnij skrawka do wody, delikatnie uderzając w niego tępo zakończoną igłą sekcyjną. Skrawka rozprzestrzeni się do kształtu kolistego natychmiast po zetknięciu z powierzchnią wody.
   
   
7. Gdy większość powierzchni wody w komorze montażowej zostanie wypełniona skrawkami, odessij niemal połowę wody za pomocą pipety Pasteura. Inkubuj szkiełko na podgrzewaczu do szkiełek przez noc, aby całkowicie wysuszyć próbkę.
   
   
8. Przeprowadź barwienie kontrastowe przy użyciu 1ml DAPI (0,1mg/ml w TE) przez pięć minut. Odessij DAPI i wysusz próbkę.
   
   
9. Usuń silikonowy izolator ze szkiełka. Teraz można wykonać zdjęcia próbki. Próbkę przechowuj w temperaturze 4°C, chroniąc ją przed światłem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PBS	Bufor			Przepis na 1 L: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 2,68 g Na2HPO (optymalizacja hiperparametrów)4·7H2O 0,2 g KH2PO4pH powinno wynosić 7,4. Doprowadzić objętość do 1 l. Sterylizować w autoklawie.
PBT	Bufor			Dodać 0,5 ml Triton X-100 oraz 1,0 g BSA (klasy biologii molekularnej, odpowiednia jest frakcja V [>99%], ale nie’do 500 ml autoklawowanego PBS. Przefiltrować przez filtr o oczkach 0,2 mm. Przechowywać w temperaturze 4°C.ºC.
·Stomatologia’utrwalacz s	Odczynnik			Wymieszać 40 ml metanolu i 10 ml DMSO. Przechowywać w –20°C.
3,7% FA+PBS	Odczynnik			Wymieszać 37% formaldehyd z buforem PBS w stosunku 1:9. Roztwór należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem, a pozostałą nadwyżkę zutylizować.
biotynilowane przeciwciało anty-mysie IgG (H+L), wytworzone u kozy	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
biotynilowane przeciwciało anty-królicze IgG (H+L), wytworzone u kozy	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Przeciwciała	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), przeciwko mysi z kozy	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Zestaw do fluorescencyjnego znakowania streptawidyną	Odczynnik	Vector Laboratories	SA-1200	Zawiera streptawidynę znakowaną trzema różnymi fluoroforami (FITC, Texas Red oraz AMCA), odpowiednią do tej procedury.
20% surowicy koziej/PBT	Bufor			Roztwór ten zostanie wykorzystany jako roztwór blokujący.
Mały pędzelek	Narzędzie
Igła dyssekcyjna z tępym grotem	Narzędzie
Kulzer Technovit 7100 GMA, 3040	Odczynnik		7100 GMA , 3040	metakrylan glikolu
Kulzer Tungsten Histoknife H	Narzędzie	Nauki o wiązkach energii	H1310
75% MeOH/H2O2O	Bufor
50% MeOH/PBS	Bufor
25% MeOH/PBS	Bufor
30% EtOH/H2O22O	Bufor
50% EtOH/H2O2O	Bufor
75% EtOH/H₂O2O	Bufor
100% EtOH	Bufor
Małe szklane fiolki scyntylacyjne	Narzędzie	Fisher Scientific	03-339-25B
Probówki PCR o cienkiej ściance 0,5 ml	Narzędzie	Produkty biologii molekularnej	3430
Izolatory z gumy silikonowej montowane na prasę	Narzędzie	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm dł. x 19 mm szer., 2,5 mm gł.
Cienkie ostrze żyletki	Narzędzie
1,5% agarozy w PBS
Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko badanemu antygenowi lub znacznikom epitopowym: przygotować odpowiednie rozcieńczenie w buforze PBT. Przeciwciało wtórne sprzężone z biotyną: przeciwciała sprzężone z biotyną są oferowane przez różnych dostawców.