Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

Podsumowanie

Mikrosekcja laserowa została zastosowana do analizy profilu ekspresji genów w konkretnych przedziałach tarczki skrzydła Drosophila poddanych lokalnemu RNAi in vivo. RNA wyekstrahowany z równoważnych obszarów przedziałów wyciszonych i niewyciszonych przeanalizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w celu określenia porównawczego profilu ekspresji genów w kontekście rodzimej mikroekologii tkanki.

Streszczenie

Heterogeniczność tkanek okazuje się być czynnikiem ograniczającym ilość informacji, jakie można uzyskać z próbek biologicznych, co utrudnia dalsze analizy. Biorąc pod uwagę złożone i dynamiczne powiązania komórkowe istniejące w wielu tkankach, w celu odtworzenia oddziaływań in vivo podczas szczegółowej analizy molekularnej, konieczna jest możliwość analizy specyficznych populacji komórek w ich naturalnym kontekście. Mikrodysekcja laserowa pozwala na osiągnięcie tego celu, umożliwiając jednoznaczną identyfikację i skuteczne wyizolowanie interesujących komórek pod bezpośrednią kontrolą mikroskopową przy jednoczesnym zachowaniu integralności molekularnej. Zastosowaliśmy tę technologię do analizy ekspresji genów w określonych obszarach rozwijającego się krążka skrzydłowego Drosophila, który stanowi korzystny model badawczy w zakresie kontroli wzrostu, różnicowania komórek i organogenezy. Larwalne krążki imaginalne są przedwcześnie podzielone na przednie i tylne oraz grzbietowe i brzuszne przedziały przez granice restrykcji linii komórkowej. Wykorzystując indukowalny binarny system ekspresji GAL4-UAS, każdy z tych przedziałów może zostać specyficznie oznakowany w muchach transgenicznych wykazujących ekspresję transgenu UAS-GFP pod kontrolą odpowiedniego konstruktu drivera GAL4. W krążkach transgenicznych profil ekspresji genów dla dyskretnych podzbiorów komórek może zostać precyzyjnie określony po mikrodysekcji laserowej, przy wykorzystaniu fluorescencyjnego sygnału GFP do prowadzenia cięcia laserowego.

Wśród wielu zastosowań analitycznych skupiliśmy się na profilowaniu transkryptów RNA po lokalnej interferencji RNA (RNAi). Dzięki rozwojowi technologii RNAi, znakowanie GFP można połączyć z lokalnym wyciszeniem (knockdown) konkretnego genu, co pozwala na określenie odpowiedzi transkrypcyjnej określonej populacji komórek na specyficzne wyciszenie genu. Aby zwalidować to podejście, wypreparowaliśmy równoważne obszary tarczki z przedziału tylnego (znakowanego ekspresją GFP) oraz przedniego (nieznakowanego) po regionalnym wyciszeniu w przedziale P genu, który w pozostałych obszarach ulega ekspresji powszechnej. RNA wyekstrahowano z mikropreparowanych obszarów wyciszonych i niewyciszonych, a porównujące profilowanie ekspresji genów określono za pomocą ilościowej RT-PCR w czasie rzeczywistym. Wykazujemy, że metoda ta może być skutecznie stosowana do dokładnej transkryptomiki podzbiorów komórek w tarczkach imaginalnych Drosophila. W rzeczywistości, podczas gdy przygotowanie całej tarczki jako źródła RNA zazwyczaj zakłada homogeniczność komórek, wiadomo, że ekspresja transkrypcyjna może się znacznie różnić w obrębie tych struktur w wyniku informacji pozycyjnej. Wykorzystanie lokalnego fluorescencyjnego sygnału GFP do prowadzenia cięcia laserowego pozwala na przeprowadzenie dokładniejszych analiz transkrypcyjnych, które można z korzyścią zastosować w różnych obszarach, w tym do profilowania transkrypcyjnego odrębnych linii komórkowych w ich naturalnym kontekście.

Protokół

Część 1. Przygotowanie tarczek imaginarnych skrzydeł Drosophila poddanych specyficznej i zlokalizowanej interferencji RNA (RNAi).

Jako materiału biologicznego użyto tarczek skrzydłowych Drosophila uzyskanych z larw transgenicznych poddanych lokalnemu i specyficznemu wyciszeniu genów za pomocą systemu GAL4/UAS ¹. Potomstwo larwalne pochodzi z krzyżówki genetycznej dwóch linii rodzicielskich: jednej niosącej sterownik GAL4 oraz drugiej niosącej responder UAS. Oprócz ekspresji GAL4 w określonym wzorcu czasowym i/lub przestrzennym, linia sterownika niesie reporter UAS-GFP, który umożliwia wizualizację domeny ekspresji GAL4. Linia respondera UAS wykazuje, pod kontrolą sekwencji UAS, ekspresję spinki ryżowej wyciszającego RNA (hpRNA) zdolnej do specyficznego celowania w wybrany gen zainteresowania (oznaczony jako gen X) ². Po ekspresji w komórce, hpRNA X jest rozcinane w celu wytworzenia krótkich interferujących RNA (siRNA) zdolnych do specyficznego wyciszenia wybranego genu. W potomstwie larwalnym, niosącym oba transgeny sterownika i respondera, konstrukt UAS-silencing jest transkrybowany tylko w tych komórkach, które wykazują ekspresję białka GAL4, co pozwala na indukcję przestrzennie ograniczonego wyciszenia wybranego genu X.

Spośród wielu możliwych zastosowań, wykorzystaliśmy to podejście do wyciszenia wybranego genu będącego przedmiotem naszych zainteresowań (gen X) pod kontrolą drivera engrailed-GAL4 (en), który może wywołać specyficzne wyciszenie w tylnym przedziale krążka skrzydłowego ³, którego obszar był oznakowany ekspresją transgenu UAS-GFP.

Wyciszone imaginalne krążki skrzydłowe wypreparowano ręcznie, dbając o usunięcie otaczających tkanek zanieczyszczających, w szczególności przylegających tchawek. Każdy wyizolowany krążek skrzydłowy przeniesiono następnie szybko i delikatnie na uprzednio potraktowaną, wolną od RNaz ramkę do preparowania w celu natychmiastowej mikrodysekcji laserowej wybranych obszarów.

Część 2. Mikrosekcja laserowa wybranych obszarów z wyciszonego (tylnego) i niewyciszonego (przedniego) przedziału tarczki skrzydła.

Po umieszczeniu krążka skrzydłowego na membranie przeprowadzono mikrodysekcję laserową określonych obszarów z przedziałów wyciszonych (tylny; znakowany GFP) i niewyciszonych (przedni; nieznakowany GFP). Wykonano to poprzez wyznaczenie obszaru, który mógłby łatwo zmieścić się zarówno po stronie dodatniej pod kątem GFP, jak i ujemnej pod kątem GFP krążka. Za pomocą mikrodysektora najpierw skupiono wiązkę lasera na tkance GFP-dodatniej, wykonując cięcie wzdłuż wybranego obrysu. Mikrodysektor wykonuje cięcie z wybraną prędkością i mocą, jednak możliwe jest ręczne doprecyzowanie cięcia, aż wybrany obszar tkanki wpadnie do znajdującej się poniżej probówki. Probówka ta zawiera niewielką objętość TRI Reagent, dzięki czemu tkanka GFP-dodatnia jest gotowa do późniejszej ekstrakcji RNA.

Następnie przenieśliśmy obszar cięcia na przeciwległą, GFP-ujemną stronę tarczy skrzydła, aby wyciąć równoważny obszar z nieuwyciszonej, GFP-ujemnej tkanki. Ponownie, po automatycznym cięciu, przystąpiliśmy do jego ręcznego dopracowania. Po zakończeniu cięcia tkankę GFP-ujemną również odzyskano w odczynniku TRI, przygotowując ją do ekstrakcji RNA.

Część 3. Ekstrakcja RNA i profilowanie transkrypcyjne z mikrodysekcyjnych obszarów tkanki.

Probiówki wirowano, aby oddzielić ciecz od zakrętki, a następnie dodano TRI Reagent do objętości 1 ml i przeprowadzono ekstrakcję RNA zgodnie ze standardowym protokołem dla TRI Reagent. Aby zebrać wystarczającą ilość materiału, procedurę wycinania powtórzono na 100 dyskach skrzydłowych imaginalnych. Przy wyjściowym materiale obejmującym 100 obszarów o powierzchni około 5000 μm² każdy, uzyskano 1,5 μg RNA. Dokładność manualnej dysekcji zweryfikowano następnie poprzez sprawdzenie ekspresji GFP w próbkach wyciszonych i niewyciszonych za pomocą RT-PCR, wykorzystując Super Script III (Invitrogen) do syntezy cDNA z Random Hexamers. Następnie przeprowadzono analizy ilościowe w celu określenia poziomów ekspresji wyciszonego genu X oraz domniemanych celów jego szlaku regulacyjnego, stosując Real Time RT-PCR z użyciem Master Mix (Invitrogen).

Dyskusja

W odniesieniu do bazowych poziomów ekspresji w przednich i tylnych przedziałach niewyciszonych krążków skrzydeł, stwierdzono, że aktywność wybranego genu X uległa zmniejszeniu do 40% po wyciszeniu. Przeciwnie, jeden z jego domniemanych celów (geny Y) wykazał znaczną nadekspresję (7-krotny wzrost), co skłoniło nas do zweryfikowania hipotezy, że jest on regulowany negatywnie przez gen X.

Wnioskujemy, że opisane powyżej podejście eksperymentalne może zostać z sukcesem zastosowane do walidacji do...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
woda z DEPC	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Mieszanina główna (Master Mix)	Invitrogen	11761100
Agaroza	Sigma-Aldrich	A9539
Alkohol izopropylowy	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
DreamTaq	Fermentas	EP0701
Szczepy much Linie Drosophila z wyciszaniem UAS można uzyskać z kolekcji RNAi VDRC 2Kolekcja linii sterujących GAL4 jest dostępna w Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Sprzęt Wymagany sprzęt obejmuje mikrosekcjoner laserowy (Leica LMD6000), wirówkę Coulter Microfuge 22R (Beckman), termocykler PCR (BIO-RAD My Cycler) oraz system Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Narzędzia Wymagane narzędzia obejmują: dołki szklane, pędzel, pęsetę do mikrodysekcji, szkiełka do metody wiszącej kropli, szpilki entomologiczne osadzone na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET, probówki plastikowe (50 ml, 0,5 ml, 0,25 ml).
Linie Drosophila z wyciszeniem UAS można uzyskać z kolekcji RNAi VDRC 2Kolekcja linii sterujących GAL4 jest dostępna w Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Sprzęt Wymagane wyposażenie obejmuje mikrosekcjoner laserowy (Leica LMD6000), wirówkę Coulter Microfuge 22R (Beckman), termocykler PCR (BIO-RAD My Cycler) oraz system Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Narzędzia Wymagane narzędzia obejmują: dołki szklane, pędzelek, pęsetę do mikrodyssekcji, szkiełka do metody wiszącej kropli, szpilki entomologiczne zamocowane na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET oraz probówki plastikowe (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).
Sprzęt Wymagany sprzęt obejmuje: laserowy mikrosekcjoner (Leica LMD6000), wirówkę Coulter Microfuge 22R (Beckman), termocykler PCR (BIO-RAD My Cycler) oraz system Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Narzędzia Wymagane narzędzia obejmują: dołki szklane, pędzelek, pincetę do mikrosekcji, szkiełka do metody wiszącej kropli, szpilki entomologiczne zamocowane na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET, probówki plastikowe (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).
Wymagane wyposażenie obejmuje mikrodissektor laserowy (Leica LMD6000), wirówkę Coulter Microfuge 22R (Beckman), termocykler PCR (BIO-RAD My Cycler) oraz system Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Narzędzia Wymagane narzędzia obejmują: dołki szklane, pędzelek, pęsetę do mikrodysekcji, szkiełka do metody wiszącej kropli, szpilki entomologiczne osadzone na igłach strzykawki, ramki metalowe z membraną PET, probówki plastikowe (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).
Narzędzia Wymagane narzędzia obejmują: dołki szklane, pędzelek, pęsetę do mikrosekcji, szkiełka do metody wiszącej kropli, szpilki entomologiczne zamocowane na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET, probówki plastikowe (50 ml, 0,5 ml, 0,25 ml).
Wymagane narzędzia obejmują: dołki szklane, pędzelek, pęsetę do mikrodysekcji, szkiełka do metody wiszącej kropli, szpilki entomologiczne osadzone na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET oraz probówki plastikowe (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).