Mikrodysekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydła Drosophila

Summary

Mikrodysekcja laserowa została zastosowana do analizy profilowania ekspresji genów w specyficznych przedziałach dysku skrzydłowego Drosophila poddanych działaniu zlokalizowanego RNAi in vivo. RNA wyekstrahowane z równoważnych obszarów wyciszonych i niewyciszonych kompartmentów analizowano za pomocą ilościowego RT-PCR w celu określenia porównawczego profilowania ekspresji genów w kontekście natywnej mikroekologii tkanek.

Abstract

Heterogeniczność tkanek okazała się czynnikiem ograniczającym ilość informacji, które można wygenerować z próbek biologicznych, co utrudnia dalsze analizy. Biorąc pod uwagę złożone i dynamiczne asocjacje komórkowe istniejące w wielu tkankach, aby podsumować interakcje in vivo, należy przeprowadzić dokładną analizę molekularną, aby przeanalizować określone populacje komórek w ich rodzimym kontekście. Mikrodysekcja za pośrednictwem lasera może osiągnąć ten cel, umożliwiając jednoznaczną identyfikację i pomyślne pobranie interesujących komórek pod bezpośrednią wizualizacją mikroskopową przy jednoczesnym zachowaniu integralności molekularnej. Zastosowaliśmy tę technologię do analizy ekspresji genów w określonych obszarach rozwijającego się dysku skrzydła Drosophila, który stanowi korzystny system modelowy do badania kontroli wzrostu, różnicowania komórek i organogenezy. Dyski imaginalne larw są przedwcześnie podzielone na przedziały przednie i tylne, grzbietowe i brzuszne według granic ograniczeń linii. Wykorzystując indukowalny binarny system ekspresji GAL4-UAS, każdy z tych przedziałów może być specyficznie znakowany u transgenicznych muszek eksprymujących transgen UAS-GFP pod kontrolą odpowiedniego konstruktu GAL4-driver. W dyskach transgenicznych profilowanie ekspresji genów dyskretnych podzbiorów komórek można precyzyjnie określić po mikrodysekcji za pośrednictwem lasera, wykorzystując fluorescencyjny sygnał GFP do kierowania cięciem laserowym.

Wśród różnorodnych zastosowań niższego szczebla, skupiliśmy się na profilowaniu transkryptów RNA po zlokalizowanej interferencji RNA (RNAi). Wraz z pojawieniem się technologii RNAi, znakowanie GFP może być połączone z miejscowym knockdownem danego genu, co pozwala określić odpowiedź transkrypcyjną dyskretnej populacji komórek na określone wyciszenie genu. Aby potwierdzić to podejście, przeprowadziliśmy analizę równoważnych obszarów dysku z tylnego (oznaczonego ekspresją GFP) i przedniego (nieznakowanego) przedziału po regionalnym wyciszeniu w przedziale P powszechnie wyrażanego genu. RNA wyekstrahowano z mikropreparowanych obszarów wyciszonych i niewyciszonych, a porównawcze profilowanie ekspresji genów określono za pomocą ilościowego RT-PCR w czasie rzeczywistym. Pokazujemy, że metoda ta może być skutecznie stosowana do dokładnej transkryptomiki podzbiorów komórek w krążkach wyobrażeniowych Drosophila. Rzeczywiście, podczas gdy przygotowanie masywnego dysku jako źródła RNA na ogół zakłada jednorodność komórki, dobrze wiadomo, że ekspresja transkrypcyjna może się znacznie różnić w tych strukturach w wyniku informacji o położeniu. Wykorzystując zlokalizowany fluorescencyjny sygnał GFP do prowadzenia cięcia laserowego, można przeprowadzać dokładniejsze analizy transkrypcji i z zyskiem stosować je do różnych zastosowań, w tym do profilowania transkryptów różnych linii komórkowych w ich natywnym kontekście.

Protocol

Część 1. Przygotowanie imaginalnych krążków skrzydeł Drosophila poddanych specyficznym i zlokalizowanym RNAi.

Jako materiał biologiczny, użyliśmy imaginalnych dysków skrzydeł Drosophila uzyskanych z transgenicznych larw poddanych zlokalizowanemu i specyficznemu wyciszaniu genów za pomocą systemu GAL4/UAS ¹. To larwalne potomstwo wywodzi się z krzyżówki genetycznej obejmującej dwie linie rodzicielskie: jedna z nich jest nosicielem kierowcy GAL4, a druga ratownikiem UAS. Oprócz ekspresji GAL4 w określonym wzorcu czasowym i/lub przestrzennym, na linii sterującej znajduje się reporter UAS-GFP, który pozwala na wizualizację domeny ekspresji GAL4. Linia odpowiedzi UAS wyraża, pod kontrolą sekwencji UAS, RNA wyciszający spinkę do włosów (hpRNA) zdolną do specyficznego celowania w wybrany gen zainteresowania (nazwijmy go genem X) ². Po ekspresji w komórce hpRNA X jest rozszczepiany w celu wytworzenia małego interferującego RNA (siRNA) zdolnego do specyficznego wyciszenia wybranego genu. W potomstwie larwalnym, które jest nosicielem zarówno transgenów kierujących, jak i reagujących, konstrukt wyciszający UAS jest transkrybowany tylko w tych komórkach, które wyrażają białko GAL4, a zatem jest w stanie wywołać przestrzennie ograniczone wyciszenie wybranego genu X.

Wśród wielu możliwych zastosowań, zastosowaliśmy to podejście, aby wyciszyć wybrany przez nas interesujący nas gen (gen X) pod kontrolą sterownika engrailed-GAL4 (en), który może wywołać specyficzne wyciszenie w tylnym komorze dysku ^{skrzydła 3}, którego terytorium zostało oznaczone ekspresją transgenu UAS-GFP.

Wyciszone wyimaginowane dyski skrzydeł zostały ręcznie wypreparowane, dbając o wyeliminowanie otaczających tkanek zanieczyszczających, zwłaszcza przylegających tchawic. Każdy izolowany dysk skrzydła został następnie szybko i delikatnie przeniesiony do wcześniej potraktowanej, wolnej od RNaz ramy preparacyjnej w celu natychmiastowej mikrodysekcji laserowej wybranych obszarów.

Część 2. Mikrodysekcja laserowa wybranych obszarów z wyciszonego (tylnego) i niewyciszonego (przedniego) przedziału tarczy skrzydła.

Gdy dysk skrzydła znalazł się na membranie, laserowa mikrodysekcja określonych obszarów z wyciszonego (tylnego; znakowane GFP) i niewyciszone (przednie; GFP-nieoznakowane) osiągnięto. Dokonano tego poprzez narysowanie obszaru, który z łatwością zmieściłby się zarówno po stronie GFP-dodatniej, jak i GFP-ujemnej tarczy. Pod mikrodysektorem najpierw skupiliśmy wiązkę lasera na tkance GFP-dodatniej, wykonując cięcie wzdłuż wybranego obwodu. Mikrodysektor kontynuuje cięcie z wybraną prędkością i mocą, ale istnieje możliwość udoskonalenia cięcia ręcznie, aż wybrany obszar tkanki wpadnie do rurki pod spodem. Probówka ta zawiera niewielką objętość odczynnika TRI, dzięki czemu tkanka GFP-dodatnia jest gotowa do późniejszej ekstrakcji RNA.

Następnie przenieśliśmy obszar cięcia na przeciwną, ujemną GFP stronę tarczy skrzydła, aby wyciąć równoważny obszar z niewyciszonej, ujemnej tkanki GFP. Po raz kolejny, po automatycznym cięciu, przystąpiliśmy do ręcznego dopracowywania cięcia. Po wykonaniu cięcia, również tkanka GFP-ujemna została odzyskana w odczynniku TRI, gotowa do ekstrakcji RNA.

Część 3. Ekstrakcja RNA i profilowanie transkrypcji z mikrowypreparowanych obszarów tkanek.

Odkręciliśmy probówki, aby odłączyć płyn od nakrętki i dodaliśmy odczynnik TRI do 1 ml, a następnie przeprowadziliśmy ekstrakcję RNA zgodnie ze standardowym protokołem odczynnika TRI. Aby zebrać wystarczającą ilość materiału, powtórzyliśmy procedurę cięcia na 100 wyimaginowanych tarczach skrzydeł. Zaczynając od 100 obszarów o wielkości około 5000^μm2 każdy, uzyskaliśmy 1,5 μg RNA. Dokładność ręcznej sekcji była następnie kontrolowana poprzez sprawdzenie ekspresji GFP w wyciszonych i niewyciszonych próbkach za pomocą RT-PCR, przy użyciu Super Script III (Invitrogen) do syntezy cDNA za pomocą losowych heksamerów. Kolejne analizy ilościowe skoncentrowane na określeniu poziomów ekspresji wyciszonego genu X, wraz z poziomami przypuszczalnych celów jego szlaku regulacyjnego, przeprowadzono za pomocą Real Time RT-PCR przy użyciu Master Mix (Invitrogen).

Discussion

W odniesieniu do ich podstawowych poziomów ekspresji osiągniętych w przednich/tylnych przedziałach niewyciszonych dysków skrzydeł, stwierdzono, że aktywność wybranego genu X zmniejszyła się do 40% po wyciszeniu. W przeciwieństwie do tego, jeden z jego domniemanych celów (gen Y) okazał się znacznie podwyższony (7-krotny wzrost), co doprowadziło nas do potwierdzenia hipotezy, że był negatywnie regulowany przez gen X.

Dochodzimy do wniosku, że opisane powyżej podejście eksperymentalne można z po...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC woda	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Odczynnik	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Alkohol izopropylowy	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Szczepy much Linie wyciszające Drosophila UAS można uzyskać z kolekcji VDRC RNAi 2. Kolekcja linii GAL4-driver jest dostępna w Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Wymagane wyposażenie obejmuje mikrodyssektor laserowy (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), PCR w czasie rzeczywistym (BIO-RAD iQ5). Narzędzia Wymagane narzędzia to: szklane studzienki, szczotka, kleszcze do mikrodysekcji, wiszące szkiełka zrzutowe, szpilki do owadów zamontowane na igłach strzykawkowych, metalowe ramy z membraną PET, plastikowe rurki (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).
Equipment Wymagane wyposażenie obejmuje mikrodyssektor laserowy (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), PCR w czasie rzeczywistym (BIO-RAD iQ5). Narzędzia Wymagane narzędzia to: szklane studnie, szczotka, kleszcze do mikrodysekcji, wiszące szkiełka upuszczające, szpilki do owadów montowane na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET, plastikowe rurki (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).
Sprzęt Wymagane wyposażenie obejmuje mikrodyssektor laserowy (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Narzędzia Wymagane narzędzia to: szklane studnie, szczotka, kleszcze do mikrodysekcji, wiszące szkiełka spadkowe, szpilki do owadów montowane na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET, plastikowe rurki (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).
Wymagane wyposażenie obejmuje mikrodyssektor laserowy (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Narzędzia Wymagane narzędzia to: szklane studnie, szczotka, kleszcze do mikrodysekcji, wiszące szkiełka do kropli, szpilki do owadów zamontowane na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET, plastikowe rurki (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).
Narzędzia Wymagane narzędzia to: szklane studzienki, szczotka, kleszcze do mikrodysekcji, wiszące szkiełka upuszczające, szpilki do owadów montowane na igłach strzykawkowych, metalowe ramki z membraną PET, plastikowe rurki (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).
Wymagane narzędzia to: szklane studzienki, szczotka, kleszcze do mikrodysekcji, wiszące szkiełka zrzutowe, szpilki do owadów montowane na igłach strzykawek, metalowe ramki z membraną PET, probówki plastikowe (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).