Linearyzacja testu Bradforda na oznaczenie białek

Podsumowanie

Dokładność i czułość oznaczania białek za pomocą szybkiej i wygodnej metody Bradforda są ograniczone przez wewnętrzną nieliniowość. Przedstawiamy prostą procedurę linearyzacji, która znacznie zwiększa dokładność, poprawia czułość analizy około 10-krotnie i istotnie redukuje interferencje wywołane przez detergenty.

Streszczenie

Oznaczanie mikrogramowych ilości białka w teście Bradforda z użyciem Coomassie brilliant blue odbywa się poprzez pomiar absorbancji przy 590 nm. Ten najpowszechniejszy test umożliwia szybką i prostą kwantyfikację białek w lizatach komórkowych, frakcjach komórkowych lub próbkach białek rekombinowanych w celu normalizacji pomiarów biochemicznych. Jednakże immanentna nieliniowość obniża czułość i dokładność tej metody. Wykazano, że w standardowych warunkach testu stosunek pomiarów absorbancji przy 590 nm i 450 nm jest ściśle liniowy względem stężenia białka. Ta prosta procedura zwiększa dokładność i poprawia czułość testu około 10-krotnie, umożliwiając kwantyfikację białka w ilościach sięgających 50 ng albuminy surowicy bydlęcej. Ponadto nowy protokół znacznie redukuje interferencję powszechnie wywoływaną przez detergenty stosowane do przygotowania lizatów komórkowych. Równanie liniowe opracowane na podstawie prawa działania mas oraz prawa Beer-a idealnie pasuje do danych eksperymentalnych.

Protokół

Linearyzacja wykresu kalibracyjnego białek metodą Bradforda:

Analiza białek metodą barwnika Coomassie brilliant blue, powszechnie znana jako metoda Bradforda ¹, jest szeroko stosowana ze względu na szybki i wygodny protokół oraz względną czułość. Niestety, w szerokim zakresie stężeń białek występuje znaczny stopień zakrzywienia krzywej (Rys. 1). W związku z tym do wykresu kalibracyjnego wykorzystuje się jedynie wąski zakres stosunkowo wysokich stężeń białek, od 2-10 μg/ml BSA, co pozwala na lepsze dopasowanie regresji liniowej (Rys. 1, kolor zielony). Jednak nieliniowość ta sprawia, że stężenie białka w nieznanych próbkach musi mieścić się w ograniczonym zakresie wykresu kalibracyjnego, aby uniknąć dużego błędu, co ponadto zmniejsza dokładność pomiaru w tym zakresie. Nieliniowość stanowi poważny problem szczególnie wtedy, gdy nie dysponujemy mikrogramowymi ilościami białka, co często wymaga wielokrotnych rozcieńczeń nieznanych próbek.

Jak zaznaczono w oryginalnej pracy Bradforda, „źródłem nieliniowości jest sam odczynnik, ponieważ występuje nakładanie się widm dwóch różnych form barwnika” ¹. W rzeczywistości trzy formy barwnika Coomassie brilliant blue znajdują się w równowadze kwasowo-zasadowej przy typowym dla tego testu niskim pH ². Formy czerwona, niebieska i zielona mają maksima absorbancji odpowiednio przy 470, 590 i 650 nm (Rys. 2). Forma niebieska jest tą, która wiąże białko, tworząc kompleks intensywnie absorbujący światło przy 594 nm ^{3, 4} (Rys. 2). Bradford zauważył również, że „wartość tła dla odczynnika stale maleje w miarę wiązania coraz większej ilości barwnika z białkiem” ¹ (Rys. 3). W związku z tym podjęliśmy próbę obliczenia redukcji tła przy 590 nm wraz z dodawaniem coraz większych ilości białka, mierząc zmianę absorbancji przy 450 nm, gdzie kompleks białko-barwnik nie absorbuje światła. Stwierdziliśmy, że malejące tło częściowo, ale nie w pełni, wyjaśnia występującą nieliniowość (Rys. 4).

Następnie wysunęliśmy hipotezę, że spadek stężenia wolnego barwnika powoduje kolejne zaburzenie odpowiedzi liniowej, ponieważ wiązanie białka z barwnikiem przebiega w stanie równowagi ⁵, zatem tworzenie kompleksu zależy nie tylko od stężenia wolnego białka, ale także od stężenia wolnego barwnika (Ryc. 5). Uwzględniając oba problemy związane ze zmiennym stężeniem wolnego barwnika, opracowaliśmy równanie matematyczne opisujące liniową zależność między stężeniem białka a stosunkiem pomiarów absorbancji przy 590 nm do 450 nm (Ryc. 6). Szczegółowy opis badania teoretycznego i eksperymentalnego znajduje się w naszej publikacji z 1996 roku w czasopiśmie Analytical Biochemistry ⁶. Równanie matematyczne zostało przetestowane eksperymentalnie, wykazując liniową krzywą kalibracyjną w całym zakresie stężeń białka (Ryc. 7). Ponadto równanie zostało zwalidowane poprzez niezależne wyznaczenie prawidłowej, zależnej od pH wartości punktu przecięcia z osią Y ⁶.

Szczegółowy protokół ulepszonego oznaczenia białka metodą Bradforda z wykorzystaniem mikro płytkowego czytnika absorbancji:

1. Przygotować roztwór zapasowy standardu, albuminy surowicy bydlęcej (BSA), o stężeniu 0,1 mg/ml. Można wybrać inny standard, jednak należy pamiętać, że w każdym eksperymencie musi być stosowany ten sam standard.
2. Próbki o nieznanym stężeniu rozcieńczyć w wodzie dejonizowanej. Należy dążyć do uzyskania stężenia 5-50 μg/ml. Wyższe lub niższe stężenia białka są dopuszczalne, ponieważ zakres liniowy testu nie posiada wyraźnego ograniczenia. Pomiary muszą być jednak przeprowadzone w zakresie liniowym czytnika absorbancji.
3. Odczynnik Bradforda (Bio-Rad) rozcieńczyć 2,5-krotnie w wodzie dejonizowanej.
4. Do dołków w trzech powtórzeniach dodać 0 oraz 10-50 μl roztworu zapasowego BSA (tworząc krzywą kalibracyjną dla 0-5 μg BSA). Uzupełnić wodą dejonizowaną do objętości 100 μl/dołek.
5. W oddzielnych dołkach dodać po 100 μl próbki o nieznanym stężeniu w trzech powtórzeniach. W celu zwiększenia dokładności można zastosować kilka stężeń próbki nieznanej.
6. Do wszystkich dołków dodać 100 μl rozcieńczonego odczynnika Bradforda. Objętość całkowita wynosi 200 μl/dołek.
7. Odczekać co najmniej 5 min, ale nie więcej niż 60 min, do czasu wybarwienia.
8. Próba ślepa musi składać się z 200 μl wody dejonizowanej (a nie z dołka z samym barwnikiem bez białka).
9. Zmierzyć absorbancję przy 590 nm oraz 450 nm.
10. Przygotować wykres kalibracyjny, dzieląc wartości absorbancji netto przy 590 nm przez wartości przy 450 nm. Należy pamiętać, aby wartość dla braku białka (sam barwnik) uwzględnić jako punkt danych (Rys. 8).
11. Obliczyć stężenie próbki nieznanej na podstawie równania liniowego krzywej kalibracyjnej (Rys. 9).

Reprezentatywne wyniki:

W przeciwieństwie do absorbancji przy pojedynczej długości fali 590 nm, stosunek wartości absorbancji przy 590 nm do 450 nm jest liniowy względem stężenia białka (Rys. 10).

Stężenie białka w nieznanej próbce można łatwo obliczyć, korzystając z równania liniowego krzywej kalibracyjnej (Rys. 10, równanie).

Jednakże większą dokładność uzyskuje się poprzez pomiar kilku rozcieńczeń nieznanej próbki. W tym celu należy przygotować dwa wykresy. Pierwszy to wykres kalibracyjny dla wzorca, z wartością μg białka na osi X (Rys. 11, prawa strona). Drugi wykres dotyczy nieznanej próbki, z wartością μl oryginalnej, nierozcieńczonej próbki na osi X (Rys. 11, lewa strona). Wartość dla samego barwnika powinna zostać uwzględniona na obu wykresach (Rys. 11). Stężenie białka w nieznanej próbce wyznacza się poprzez podzielenie nachylenia prostej dla nieznanej próbki przez nachylenie prostej dla wzorca (Rys. 11, równanie).

Rycina 1. Konwencjonalny wykres kalibracyjny metodą Bradforda. Zakres liniowy przedstawiono za pomocą zielonych symboli.

Rysunek 2. Widma kompleksu białko-barwnik oraz samego barwnika.

Rysunek 3. Równowaga białko-barwnik.

Rysunek 4. Redukcja poprawnie obliczonego tła częściowo zmniejsza nieliniowość.

Rysunek 5. Równowaga białko-barwnik.

Rysunek 6. Podstawy matematyczne linearyzacji metody Bradforda do oznaczania białek.

Rysunek 7. Linearyzacja wykresu kalibracyjnego metody Bradforda.

Rycina 8. Obliczanie wartości stosunku absorbancji.

Rysunek 9. Liniowy wykres kalibracyjny metody Bradforda.

Rysunek 10. Linearyzacja wykresu kalibracyjnego metodą Bradforda.

Rysunek 11. Obliczanie stężenia nieznanej próbki.

Dyskusja

Metoda Bradforda do oznaczania białek jest popularna ze względu na łatwość wykonania i względną czułość. Linearyzacja w całym zakresie stężeń białek uzyskana dzięki przedstawionemu tutaj protokołowi dodatkowo upraszcza analizę, ponieważ próbki o nieznanym stężeniu nie muszą mieścić się w zakresie wykresu kalibracyjnego.

Co istotne, ulepszony protokół zapewnia dodatkowo następujące korzyści w porównaniu z oryginalnym protokołem Bradforda:

1. Zwiększona dokładność.
2. Czułość...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynik Bradforda	Bio-Rad	500-0006
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	Amersco	0332
Wielopłytkowy czytnik absorbancji	BioTek	Synergy2