Linearyzacja testu Bradforda na oznaczenie białek

Podsumowanie

Dokładność i czułość oznaczania białek za pomocą szybkiej i wygodnej metody Bradforda są ograniczone przez wewnętrzną nieliniowość. Przedstawiamy prostą procedurę linearyzacji, która znacznie zwiększa dokładność, poprawia czułość analizy około 10-krotnie i istotnie redukuje interferencje wywołane przez detergenty.

Streszczenie

Oznaczanie mikrogramowych ilości białka w teście Bradforda z użyciem Coomassie brilliant blue odbywa się poprzez pomiar absorbancji przy 590 nm. Ten najpowszechniejszy test umożliwia szybką i prostą kwantyfikację białek w lizatach komórkowych, frakcjach komórkowych lub próbkach białek rekombinowanych w celu normalizacji pomiarów biochemicznych. Jednakże immanentna nieliniowość obniża czułość i dokładność tej metody. Wykazano, że w standardowych warunkach testu stosunek pomiarów absorbancji przy 590 nm i 450 nm jest ściśle liniowy względem stężenia białka. Ta prosta procedura zwiększa dokładność i poprawia czułość testu około 10-krotnie, umożliwiając kwantyfikację białka w ilościach sięgających 50 ng albuminy surowicy bydlęcej. Ponadto nowy protokół znacznie redukuje interferencję powszechnie wywoływaną przez detergenty stosowane do przygotowania lizatów komórkowych. Równanie liniowe opracowane na podstawie prawa działania mas oraz prawa Beer-a idealnie pasuje do danych eksperymentalnych.

Protokół

Linearyzacja wykresu kalibracyjnego białek metodą Bradforda:

Analiza białek metodą barwnika Coomassie brilliant blue, powszechnie znana jako metoda Bradforda ¹, jest szeroko stosowana ze względu na szybki i wygodny protokół oraz względną czułość. Niestety, w szerokim zakresie stężeń białek występuje znaczny stopień zakrzywienia krzywej (Rys. 1). W związku z tym do wykresu kalibracyjnego wykorzystuje się jedynie wąski zakres stosunkowo wysokich stężeń białek, od 2-10 μg/ml BSA, co pozwala na lepsze dopasowanie regresji liniowej (Rys. 1, kolor zielony). Jednak nieliniowość ta sprawia, że stężenie białka w nieznanych próbkach musi mie....

Dyskusja

Metoda Bradforda do oznaczania białek jest popularna ze względu na łatwość wykonania i względną czułość. Linearyzacja w całym zakresie stężeń białek uzyskana dzięki przedstawionemu tutaj protokołowi dodatkowo upraszcza analizę, ponieważ próbki o nieznanym stężeniu nie muszą mieścić się w zakresie wykresu kalibracyjnego.

Co istotne, ulepszony protokół zapewnia dodatkowo następujące korzyści w porównaniu z oryginalnym protokołem Bradforda:

1. Zwiększona dokładność.
2. Czułość.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynik Bradforda	Bio-Rad	500-0006
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	Amersco	0332
Wielopłytkowy czytnik absorbancji	BioTek	Synergy2