Los replisomu po zderzeniu z polimerazą RNA (RNAP) w układzie czołowym pozostaje nieznany. Wykazaliśmy, że replisom zatrzymuje się po zderzeniu z RNAP w układzie czołowym, lecz wznawia elongację po usunięciu RNAP z DNA. Białko Mfd wspomaga restart replikacji, ułatwiając przemieszczenie RNAP po kolizji.
Artykuł metodologiczny
Bezpośrednie wznowienie ruchu widelca replikacyjnego zablokowanego przez polimerazę RNA w kolizji czołowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
In vivobadania sugerują, że widelce replikacyjne zostają zatrzymane w wyniku napotkania kompleksów transkrypcyjnych w kolizji czołowej. Jednakże los replisomu i polimerazy RNA (RNAP) po takiej kolizji czołowej pozostaje nieznany. W niniejszej pracy wykazujemy, żeE. colireplisom ulega zatrzymaniu w wyniku kolizji z czołowym kompleksem transkrypcyjnym, lecz zamiast ulec rozpadowi, widełki replikacyjne pozostają wysoce stabilne i ostatecznie wznawiają elongację po usunięciu RNAP z DNA. Stwierdziliśmy również, że czynnik sprzęgający transkrypcję z naprawą, Mfd, wspomaga bezpośredni restart widełek po kolizji, ułatwiając wypieranie RNAP. Wyniki te wykazują wewnętrzną stabilność aparatu replikacyjnego oraz nową rolę szlaku naprawy sprzężonej z transkrypcją w promowaniu replikacji poza blokadą utworzoną przez RNAP.
Protokół
Metoda ta została wykorzystana w badaniach opisanych w pracy Pomerantz and O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010).
1. Zespół elongacyjny RNAP w stanie zatrzymania został zmontowany w następujący sposób:
Końcowe stężenie 500 nM RNAP σ70 HE z E. coli zmieszano z końcowym stężeniem 5 nM biotynilowanej matrycy DNA o długości 3,6 kb zawierającej promotor T7A1 w 100 μl buforu A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glicerolu) przez 10 min w temperaturze 37 °C. Następnie dodano 100 μM ApU oraz po 40 μM GTP, ATP i CTP i inkubowano przez kolejne 10 min w temperaturze 37 °C.
2. Immobilizację zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP na kuleczkach z streptawidyną przeprowadzono w następujący sposób:
Do powyższej reakcji dodano 200 μl kulek magnetycznych powlekanych streptawidyną (Invitrogen) na 10 min w temperaturze pokojowej.
3. Oczyszczanie unieruchomionego, zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP przeprowadzono w następujący sposób:
Kuleczki (opisane powyżej) przemyto 5 razy 0,9 ml buforu A zawierającego 0,75 M NaCl, 200 μg/ml heparyny oraz 20 μg/ml ssDNA (po każdym etapie płukania nadmiar cieczy usuwano za pomocą separacji magnetycznej). Następnie kuleczki przemyto 2 razy 0,9 ml buforu A.
4. Formowanie widełek replikacyjnych poniżej polimerazy RNA (RNAP) w konfiguracji czołowej przeprowadzono w następujący sposób:
Kuleczki (opisane powyżej) resuspendowano w 100 μl buforu 4 firmy New England Biolabs, a następnie dodano 10 jednostek enzymu Sap I (New England Biolabs) i inkubowano przez 10 min w 37 °C. Kuleczki przemyto 3 razy 0,9 ml buforu A, a następnie ponownie suspendowano w 50 μl buforu do reakcji Quick T4 Ligation (New England Biolabs). Dodano 2 μl ligazy Quick T4 (New England Biolabs) oraz uprzednio wygrzane forkowane DNA (RP10, RP22, RP25) do końcowego stężenia 6 nM i inkubowano przez 10 min w temperaturze pokojowej. Kuleczki przemyto 3 razy 0,9 ml buforu A.
5. Montaż replisomu i inicjację syntezy nici prowadzącej w widełkach replikacyjnych przeprowadzono w następujący sposób:
448 pmol DnaB (w formie heksameru) inkubowano z kuleczkami i 150 μl buforu A (20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 8 mM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glicerolu) przez 30 s w temperaturze 23 °C. Następnie dodano 4,9 pmol Pol III* (Pol III HE minus β), 15 pmol β, 2 mM ATP oraz po 60 μM dGTP i dATP, do uzyskania objętości 200 μl, i inkubowano przez kolejne 5 min w temperaturze 37 °C. Replikację zainicjowano poprzez dodanie 10 μg SSB oraz po 24 μM dATP i dTTP wraz z [α-32P]dTTP i [α-32P]dCTP (aktywność właściwa 3 000-5 000 cpm/pmol) do końcowej objętości 250 μL. Reakcje przerwano po 10 min poprzez dodanie 12 μl 500 mM EDTA.
6. Oczyszczanie i zagęszczanie radioznakowanych produktów DNA przeprowadzono w następujący sposób:
Kuleczki (opisane powyżej) poddano gotowaniu po zakończeniu reakcji w celu usunięcia DNA z kuleczek. Wszelkie pozostałości DNA przytwierdzone do kuleczek usunięto poprzez inkubację kuleczek z proteinazą K w objętości 10 ul przez 30 min w temperaturze 50 °C. Następnie kuleczki zagotowano, a nadsącz usunięto za pomocą separacji magnetycznej. Połączony nadsącz zawierający DNA oczyszczono przy użyciu zestawu Qiagen PCR Cleanup kit. Oczyszczone znakowane radioaktywnie produkty DNA poddano następnie analizie w alkalicznym żelu agarozy.
*Replikację wykonano w nieobecności zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP w zderzeniu czołowym zgodnie z powyższym opisem, z pominięciem σ70.
Reprezentatywne wyniki:
Kolizja replisomu z RNAP w orientacji czołowej zazwyczaj prowadzi do powstania dwóch produktów o długości 2,5 kb i 3,6 kb. Produkt 2,5 kb odpowiada długości DNA od widelca do zatrzymanej RNAP i wynika z zahamowania replisomu po kolizji z RNAP. Produkt 3,6 kb reprezentuje DNA o pełnej długości i wynika albo z niepełnego zajęcia promotora przez RNAP, albo z częściowego przebicia replisomu przez RNAP w orientacji czołowej. Prawidłowy lub dokładny wynik wykazuje produkcję około 50% DNA o pełnej długości. Jednak w niektórych przypadkach występuje mniejsza zajętość promotora przez RNAP, co skutkuje obserwowaniem wyższego odsetka DNA o pełnej długości, ponieważ większa populacja replisomów nie napotyka RNAP w orientacji czołowej. Replikacja w przypadku braku zatrzymanej RNAP prowadzi do powstania wyłącznie DNA o pełnej długości (3,6 kb).
Rycina 1. Replisom zostaje zablokowany przez RNAP w kolizji czołowej.
(A) Układ eksperymentalny. Kompleks zatrzymanej elongacji RNAP E. coli został złożony na biotynilowanym DNA zawierającym promotor T7A1 zgodnie z wcześniejszym opisem (9). W skrócie, kompleks zatrzymanej elongacji utworzono 20 bps w dół od promotora poprzez inkubację holoenzymu RNAP z biotynilowanym DNA przez 10 min, a następnie dodanie ApU, GTP, ATP i CTP przez kolejne 10 min. Dodano kuleczki z streptawidyną na kolejne 10 min, a następnie kuleczki przemyto pięciokrotnie 0,9 ml buforu zawierającego 0,75M NaCl, 200 mg/ml heparyny oraz 100 nM jednoniciowego DNA w celu usunięcia niestabilnych kompleksów RNAP-DNA i nadmiaru NTP. Następnie DNA poddano trawieniu enzymem SapI, przemyto i poddano ligacji do wcześniej wyżarowanego DNA o strukturze widelca. Kuleczki przemyto ponownie przed złożeniem replisomu. Promotor znajduje się 2,5 kb od widelca i jest zorientowany tak, aby kierować transkrypcję w stronę widelca. (B) Dodano DnaB, następnie złożono replisom i zainicjowano replikację w obecności (ścieżka 2) lub w przypadku braku (ścieżka 1) RNAP w kolizji czołowej.
Oświadczenia
Przemywanie kompleksu zatrzymanej elongacji związanego z kuleczkami roztworem o wysokim stężeniu soli jest kluczowe w celu usunięcia wszelkich niestabilnych lub nieswoiście związanych cząsteczek RNAP. RNAP wykazuje niezwykle wysokie powinowactwo do struktur DNA typu primer-matryca. Dlatego też konieczne jest usunięcie takich nieswoistych kompleksów RNAP-DNA, aby możliwe było przeprowadzenie replikacji z primera i matrycy. Koncentrowanie znakowanych promieniotwórczo produktów DNA przy użyciu zestawu do oczyszczania PCR firmy Qiagen jest również istotne dla uzyskania wystarczająco silnego sygnału radiacyjnego, który byłby widoczny w żelu.
Podziękowania
Jesteśmy szczególnie wdzięczni Sethowi Darstowi za udostępnienie białek RNAP i Mfd oraz wektorów ekspresyjnych. Dziękujemy również Sergiejowi Boruchovowi za udostępnienie GreB oraz Danowi Zhangowi za wsparcie techniczne. Praca ta była finansowana z grantu National Institutes of Health (M.O.D.) oraz stypendium Marie-Josee and Henry Kravis Fellowship na Uniwersytecie Rockefeller (R.T.P.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dynabeads M-270 | Invitrogen | 653.05 | |
| SapI | New England Biolabs | R0569S | |
| T4 Quick Ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Zestaw do oczyszczania PCR | Qiagen | 28104 |
Bibliografia
- Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription. DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).
- Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability. Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).
- Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription. Mol Cell. 19, 247-247 (2005).
- McGlynn, P., Lloyd, R. G. Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression. Cell. 101, 35-35 (2000).
- McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).
- Labib, K., Hodgson, B. Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time. EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).
- Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. Replication fork collapse at replication terminator sequences. Embo J. 21, 3898-3898 (2002).
- Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine. Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).
- Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase. Nature. 456, 762-762 (2008).
- Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439, 557-557 (2006).
- Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Cell. 86, 557-557 (1996).
- Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication. J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).
- Kaplan, D. L., O'Donnell, M. Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes. Mol Cell. 15, 453-453 (2004).
- Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes. Cell. 109, 757-757 (2002).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).
- Hanawalt, P. C. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Science. 266, 1957-1957 (1994).
- Selby, C. P., Sancar, A. Transcription-coupled repair and human disease. J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).
- Liu, B., Alberts, B. M. Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex. Science. 267, 1131-1131 (1995).
- George, D. L., Witkin, E. M. Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r. Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).
Przedruki i uprawnienia
