Bezpośrednie ponowne uruchomienie widełka replikacyjnego zatrzymanego przez czołową polimerazę RNA

Podsumowanie

Nieznany jest los replikosmu po zderzeniu z czołową polimerazą RNA (RNAP). Odkryliśmy, że replikomy zatrzymuje się po zderzeniu czołowym z RNAP, ale wznawia wydłużenie po przemieszczeniu RNAP z DNA. Mfd wspomaga ponowne uruchomienie replikacji, ułatwiając przemieszczenie RNAP po zderzeniu.

Streszczenie

Badania in vivo sugerują, że widełki replikacyjne są zatrzymywane z powodu spotkań z kompleksami transkrypcyjnymi typu head-on. Jednak los polimerazy replikosomu i RNA (RNAP) po zderzeniu czołowym jest nieznany. Tutaj stwierdzamy, że replikosome E. coli zatrzymuje się po zderzeniu z czołowym kompleksem transkrypcyjnym, ale zamiast zapadać się, widełki replikacyjne pozostają bardzo stabilne i ostatecznie wznawiają wydłużanie po wyparciu RNAP z DNA. Odkryliśmy również, że czynnik sprzęgający transkrypcja-naprawa, Mfd, sprzyja bezpośredniemu restartowi widelca po zderzeniu, ułatwiając przemieszczenie RNAP. Odkrycia te wskazują na wewnętrzną stabilność aparatu replikacyjnego i nową rolę szlaku naprawczego sprzężonego z transkrypcją w promowaniu replikacji poza blok RNAP.

Protokół

Ta metoda została użyta w badaniach opisanych w Pomerantz and O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010).

1. Montaż zatrzymanego kompleksu wydłużeniowego RNAP został przeprowadzony w następujący sposób:

500 nM końcowe stężenie E. coli RNAP σ⁷⁰ HE zmieszano z 5 nM końcowym stężeniem biotynylowanej matrycy DNA o zawartości 3,6 kb zawierającej promotor T7A1 w 100 μl buforu A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl₂, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glicerolu) przez 10 minut w temperaturze 37 °C. 100 μM ApU i po 40 μM GTP, ATP i CTP dodawano na dodatkowe 10 minut w temperaturze 37 °C.

2. Unieruchomienie zatrzymanego kompleksu wydłużającego RNAP na kulkach streptawidyny zostało przeprowadzone w następujący sposób:

200 μl kulek powlekanych magnetycznie streptawidyny (Invitrogen) dodano do powyższej reakcji na 10 minut w temperaturze pokojowej.

3. Oczyszczanie unieruchomionego, zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP przeprowadzono w następujący sposób:

Koraliki (z góry) zostały przemyte 5 razy 0,9 ml buforu A zawierającego 0,75 M NaCl, 200 μg/ml heparyny i 20 μg/ml ssDNA (supernatant był usuwany po każdym etapie płukania przez separację magnetyczną.) Następnie kulki przemyto 2 razy 0,9 ml buforu A.

4. Formowanie widełek replikacyjnych w dół względem czołowego RNAP zostało przeprowadzone w następujący sposób:

Koraliki (z góry) zostały ponownie zawieszone w 100 μl buforu New England Biolabs 4 i dodano 10 jednostek Sap I (New England Biolabs) na 10 minut w temperaturze 37 °C. Kulki przemyto 3 razy 0,9 ml buforu A, a następnie ponownie zawieszono w 50 μl buforu reakcyjnego do szybkiej ligacji T4 (New England Biolabs). Dodano 2 μl ligazy Quick T4 (New England Biolabs) wraz z 6 nM końcowe stężenie wstępnie wyżarzonego rozwidlonego DNA (RP10, RP22, RP25) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Koraliki przemyto 3 razy 0,9 ml buforu A.

5. Montaż replikosmu i zainicjowanie syntezy nici wiodącej na widełkach replikacyjnych przebiegało w następujący sposób:

448 pmol DnaB (jako heksamer) inkubowano z kulkami 150 μl buforu A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl₂, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glicerolu) przez 30 s w temperaturze 23 °C. 4,9 pmol Pol III* (Pol III HE minus β), 15 pmol β, 2 mM ATP, i po 60 μM dGTP i dATP do objętości 200 μl i inkubowano przez kolejne 5 minut w temperaturze 37 °C. Replikację rozpoczęto po dodaniu 10 μg SSB i po 24 μM dATP i dTTP wraz z [^α-32P]dTTP i [^α-32P]dCTP (aktywność specyficzna, 3 000-5 000 cpm/pmol) do końcowej objętości 250 μL. Reakcje zakończono po 10 minutach po dodaniu 12 μl 500 mM EDTA.

6. Oczyszczanie i zagęszczanie znakowanych radioaktywnie produktów DNA przeprowadzono w następujący sposób:

Koraliki (z góry) zostały zagotowane po zakończeniu reakcji w celu usunięcia DNA z koralików. Wszelkie pozostałości DNA pozostałości przyczepione do kulek usunięto poprzez potraktowanie kulek proteinazą K w objętości 10 ul przez 30 minut w temperaturze 50 °C. Kulki następnie gotowano, a supernatant usuwano przez separację magnetyczną. Połączony supernatant zawierający DNA oczyszczono przy użyciu zestawu Qiagen PCR Cleanup. Oczyszczone produkty DNA znakowane radioaktywnie analizowano następnie w alkalicznym żelu agarozowym.

*Replikacja przy braku czołowego kompleksu wydłużającego RNAP została przeprowadzona jak wyżej, jednak σ⁷⁰ została pominięta.

Reprezentatywne wyniki:

Zderzenie replikosmu z czołowym RNAP zwykle skutkuje dwoma iloczynami o długości 2,5 kb i 3,6 kb. Iloczyn 2,5 kb reprezentuje długość DNA od widelca do zatrzymanego RNAP i wynika z zatrzymania replikomu po zderzeniu z RNAP. Iloczyn o wielkości 3,6 kb reprezentuje DNA o pełnej długości i wynika albo z niepełnego zajęcia promotora przez RNAP, albo z częściowego odczytu replikacyjnego czołowego RNAP. Dobry lub dokładny wynik pokazuje, że wytwarzane jest około 50% pełnowymiarowego DNA. Jednak w niektórych przypadkach występuje mniejsze  zajęcie promotora przez RNAP i obserwuje się wyższy procent pełnowymiarowego DNA, ponieważ większa populacja replikosomów nie napotyka czołowego RNAP. Replikacja przy braku zatrzymanego RNAP daje tylko pełnowymiarowe DNA (3,6 kb).

Rysunek. 1 Replikosom jest hamowany przez czołowy RNAP.
(A) Konfiguracja eksperymentalna. Kompleks zatrzymanego wydłużania E. coli RNAP został złożony na biotynylowanym DNA zawierającym promotor T7A1, jak opisano wcześniej (9). Krótko mówiąc, kompleks zatrzymanej elongacji został utworzony 20 punktów bazowych za promotorem poprzez inkubację holoenzymu RNAP z biotynylowanym DNA przez 10 minut, a następnie dodanie ApU, GTP, ATP i CTP przez kolejne 10 minut. Kulki streptawidyny dodawano na dodatkowe 10 minut, a następnie kulki przemyto pięć razy każdy 0,9 ml buforu zawierającego 0,75 M NaCl, 200 mg / ml heparyny i 100 nM jednoniciowego DNA w celu usunięcia niestabilnych kompleksów RNAP-DNA i nadmiaru NTP. DNA zostało następnie strawione za pomocą SapI, przemyte i podwiązane do wstępnie wyżarzonego, rozwidlonego DNA. Koraliki zostały ponownie umyte przed montażem repliksomemu. Promotor, który znajduje się w odległości 2,5 kb od widełka i jest zorientowany na bezpośrednią transkrypcję w kierunku widełka. (B) Dodano DnaB, a następnie złożono replikom i zainicjowano replikację w obecności (tor 2) lub braku (tor 1) czołowego RNAP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dynabeads M-270	Invitrogen	653.05
SapI	New England Biolabs	R0569S
T4 Szybka ligaza	New England Biolabs	M2200S
Zestaw do oczyszczania PCR	Qiagen	28104