Bezpośrednie ponowne uruchomienie widełek replikacyjnych zablokowanych przez czołowe zderzenie z polimerazą RNA

Podsumowanie

Los replisomu po kolizji z RNA polimerazą (RNAP) w zderzeniu czołowym pozostaje nieznany. Wykazaliśmy, że replisom zatrzymuje się w wyniku kolizji z RNAP w zderzeniu czołowym, ale wznawia elongację po usunięciu RNAP z DNA. Mfd wspomaga restart replikacji poprzez ułatwienie przemieszczenia RNAP po kolizji.

Streszczenie

In vivoBadania sugerują, że widelce replikacyjne ulegają zatrzymaniu w wyniku spotkania z kompleksami transkrypcyjnymi w kolizji czołowej. Jednakże los replisomu i polimerazy RNA (RNAP) po takiej kolizji czołowej pozostaje nieznany. W niniejszej pracy wykazujemy, żeE. colireplisom zatrzymuje się w momencie kolizji z czołowym kompleksem transkrypcyjnym, jednak zamiast ulec rozpadowi, widełki replikacyjne pozostają bardzo stabilne i ostatecznie wznawiają elongację po usunięciu RNAP z DNA. Stwierdziliśmy również, że czynnik sprzęgający transkrypcję z naprawą, Mfd, sprzyja bezpośredniemu restartowi widełek po kolizji, ułatwiając przemieszczenie RNAP. Wyniki te wykazują immanentną stabilność aparatu replikacyjnego oraz nową rolę ścieżki naprawy sprzężonej z transkrypcją w promowaniu replikacji poza blokadą stworzoną przez RNAP.

Protokół

Metodę tę zastosowano w badaniach opisanych w pracy Pomerantz and O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010).

1. Montaż zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP przeprowadzono w następujący sposób:

Końcowe stężenie 500 nM E. coli RNAP σ⁷⁰ HE zmieszano z końcowym stężeniem 5 nM biotynilowanej matrycy DNA o długości 3,6 kb zawierającej promotor T7A1 w 100 μl buforu A (20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 8 mM MgCl₂, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glicerolu) przez 10 min w temperaturze 37 °C. Następnie dodano 100 μM ApU oraz po 40 μM GTP, ATP i CTP i inkubowano przez kolejne 10 min w temperaturze 37 °C.

2. Immobilizację zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP na kulkach z streptawidyną przeprowadzono w następujący sposób:

Do powyższej reakcji dodano 200 μl kulek magnetycznych powlekanych streptawidyną (Invitrogen) na 10 min w temperaturze pokojowej.

3. Oczyszczanie unieruchomionego, zatrzymanego kompleksu elongacyjnego RNAP przeprowadzono w następujący sposób:

Kuleczki (wymienione powyżej) przemyto 5 razy 0,9 ml buforu A zawierającego 0,75 M NaCl, 200 μg/ml heparyny oraz 20 μg/ml ssDNA (nadpływ usuwano po każdym etapie płukania za pomocą separacji magnetycznej). Następnie kuleczki przemyto 2 razy 0,9 ml buforu A.

4. Formowanie widelca replikacyjnego w kierunku downstream względem RNAP w zderzeniu czołowym przeprowadzono w następujący sposób:

Kuleczki (opisane powyżej) zawieszono ponownie w 100 μl buforu 4 New England Biolabs, a następnie dodano 10 jednostek enzymu Sap I (New England Biolabs) i inkubowano przez 10 min w 37 °C. Kuleczki przemyto 3 razy 0,9 ml buforu A, a następnie zawieszono ponownie w 50 μl buforu do reakcji Quick T4 Ligation (New England Biolabs). Dodano 2 μl ligazy Quick T4 (New England Biolabs) oraz wstępnie zdenaturowane i wyżarzane rozwidlone DNA (RP10, RP22, RP25) do końcowego stężenia 6 nM i inkubowano przez 10 min w temperaturze pokojowej. Kuleczki przemyto 3 razy 0,9 ml buforu A.

5. Montaż replisomu i inicjację syntezy nici wiodącej w widelcu replikacyjnym przeprowadzono w następujący sposób:

448 pmol DnaB (w formie heksamerycznej) inkubowano z kuleczkami w 150 μl buforu A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl₂, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glicerolu) przez 30 s w temperaturze 23 °C. Następnie dodano 4,9 pmol Pol III* (Pol III HE bez β), 15 pmol β, 2 mM ATP oraz po 60 μM dGTP i dATP do objętości 200 μl i inkubowano przez kolejne 5 min w temperaturze 37 °C. Replikację zainicjowano poprzez dodanie 10 μg SSB oraz po 24 μM dATP i dTTP wraz z [α-³²P]dTTP i [α-³²P]dCTP (aktywność właściwa 3 000-5 000 cpm/pmol) do końcowej objętości 250 μL. Reakcje przerwano po 10 min poprzez dodanie 12 μl 500 mM EDTA.

6. Oczyszczanie i zagęszczanie produktów znakowanego radioaktywnie DNA przeprowadzono w następujący sposób:

Kuleczki (opisane powyżej) przegotowano po zakończeniu reakcji w celu usunięcia DNA z kuleczek. Wszelkie resztkowe DNA pozostające w połączeniu z kuleczkami usunięto, traktując kuleczki proteinazą K w objętości 10 ul przez 30 min w 50 °C. Następnie kuleczki przegotowano, a nadfiltr usunięto za pomocą separacji magnetycznej. Połączony nadfiltr zawierający DNA oczyszczono przy użyciu zestawu Qiagen PCR Cleanup. Oczyszczone, znakowane promieniotwórczo produkty DNA poddano następnie analizie w alkalicznym żelu agarozowym.

*Replikację w obecności kompleksu elongacyjnego z zatrzymaną polimerazą RNA (RNAP) w konfiguracji head-on przeprowadzono zgodnie z powyższym opisem, z pominięciem σ⁷⁰.

Reprezentatywne wyniki:

Kolizja replisomu z RNAP w orientacji czołowej zazwyczaj prowadzi do powstania dwóch produktów o długości 2,5 kb i 3,6 kb. Produkt 2,5 kb odpowiada długości DNA od widelca do zatrzymanej RNAP i wynika z zatrzymania replisomu w momencie kolizji z RNAP. Produkt 3,6 kb reprezentuje pełnowymiarowy DNA i powstaje w wyniku niepełnego obsadzenia promotora przez RNAP lub częściowego przejścia replisomu przez RNAP w orientacji czołowej. Poprawny lub dokładny wynik wykazuje, że powstaje około 50% pełnowymiarowego DNA. Jednak w niektórych przypadkach występuje mniejszy stopień obsadzenia promotora przez RNAP i obserwuje się wyższy procent pełnowymiarowego DNA, ponieważ większa populacja replisomów nie napotyka RNAP w orientacji czołowej. Replikacja w przypadku braku zatrzymanej RNAP prowadzi do powstania wyłącznie pełnowymiarowego DNA (3,6 kb).

Rysunek 1. Replisom zostaje zablokowany przez RNAP w orientacji czołowej.
(A) Układ eksperymentalny. Kompleks zatrzymanej elongacji RNAP z E. coli został zmontowany na biotynilowanym DNA zawierającym promotor T7A1, zgodnie z wcześniejszym opisem (9). W skrócie, kompleks zatrzymanej elongacji utworzono 20 bp w dół od promotora poprzez inkubację holoenzymu RNAP z biotynilowanym DNA przez 10 min, a następnie dodanie ApU, GTP, ATP i CTP przez kolejne 10 min. Dodano kulki z streptawidyną na dodatkowe 10 min, po czym kulki przemyto pięciokrotnie 0,9 ml buforu zawierającego 0,75M NaCl, 200 mg/ml heparyny i 100 nM jednoniciowego DNA, aby usunąć niestabilne kompleksy RNAP-DNA oraz nadmiar NTP. Następnie DNA trawiono enzymem SapI, przemyto i ligowano z uprzednio wygrzanym DNA w formie widelca. Kulki ponownie przemyto przed montażem replisomu. Promotor znajduje się 2,5 kb od widelca i jest zorientowany tak, aby kierować transkrypcję w stronę widelca. (B) Dodano DnaB, następnie zmontowano replisom i zainicjowano replikację albo w obecności (ścieżka 2), albo w przypadku braku (ścieżka 1) RNAP w orientacji czołowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dynabeads M-270	Invitrogen	653.05
SapI	New England Biolabs	R0569S
T4 Quick Ligase	New England Biolabs	M2200S
Zestaw do oczyszczania produktów PCR	Qiagen	28104