Wyznaczanie rodzaju tkanki przy użyciu testu przeszczepu czapy zwierzęcej (ACT) u Xenopus laevis

Podsumowanie

Kapturki zwierzęce nadekspresujące produkty genów są transplantowane do boku rozwijających się embrionów Xenopus laevis w celu ustalenia, czy tkanka jest zdeterminowana.

Streszczenie

Wiele białek pełni podwójną rolę w rozwoju zarodkowym. Białka regulujące determinację losu komórek w konkretnej tkance mogą jednocześnie wpływać na rozwój większego obszaru zarodka. Powoduje to trudności w analizie i zdefiniowaniu ich roli w danej tkance. Na przykład,nogginnadekspresja wXenopus laeviszarodki powodują ekspansję całego regionu przedniego, w tym oka^1,2Na podstawie tego wyniku nie wiadomo, czy Noggin odgrywa bezpośrednią rolę w determinacji oka, czy też poprzez wywoływanie ekspansji tkanki nerwowej Noggin pośrednio wpływa na formowanie się oka. Taki złożony fenotyp sprawia, że analiza specyficznej dla oka roli tego białka w determinacji losu komórek jest trudna. Opracowaliśmy test, który pozwala rozwiązać ten problem. Wykorzystując pluripotencjalną naturęXenopus laevisskórek zwierzęcych³opracowaliśmy test pozwalający sprawdzić zdolność produktów genów, takich jaknogginlub czynników transkrypcyjnych pola oka (EFTFs), aby przekształcić czapy w konkretne typy tkanek lub komórek poprzez przeszczepienie tej tkanki na bok embrionu⁴Podczas gdy ustaliliśmy, że traktowanie białkiem Noggin lub zestawem czynników transkrypcyjnych może determinować los komórek siatkówki w czapkach zwierzęcych, procedura ta może zostać wykorzystana do identyfikacji produktów genów zaangażowanych w specyfikację innych tkanek.

Protokół

Część I. Przygotowanie do testu ACT

1. Przygotuj cappingowane RNA do iniekcji zgodnie z zaleceniami producenta, stosując jego metodę oczyszczania fenol:chloroform (np. zestaw mMessage mMachine; Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX). Jako marker wykorzystuje się RNA kodujące białko fluorescencyjne. Przeprowadzamy transkrypcję cDNA dla żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) lub mCherry ⁵, znajdującego się w wektorze ekspresyjnym pCS2+.
2. Wyciągnij kapilary szklane borokrzemianowe w celu utworzenia zwężonych końcówek szklanych za pomocą wyciągarki do mikropipet. Używamy wyciągarki Sutter Micropipette Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), zgodnie z wcześniejszym opisem ⁶.
3. Przygotuj sterylne roztwory wymienione w Tabeli 1 z roztworu zapasowego 10 X Marc's Modified Ringer's (MMR) (10 mM MgCl₂; 20 mM KCl; 20 mM CaCl₂; 50 mM HEPES; 1 M NaCl; pH dostosowane do 7,5, autoklawowane i przechowywane w RT).
4. Wyizoluj jądra z samca żaby i przechowuj tkankę w temperaturze 4°C w sterylnym roztworze 1X MMR/gentamycyna (50 μg/mL siarczanu gentamycyny; BioWhittaker, Kat # 17-518Z). Można to zrobić do tygodnia przed rozpoczęciem eksperymentu, jednak tkanka z czasem traci swoją skuteczność.
5. Roztwór do składania jaj (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na₂HPO₄, 20 mM Trizma base, 2,62 mM NaHCO₃ oraz 2,75 mM MgSO₄; pH dostosowane do 7,6) można przygotować jako stężenie zapasowe 8X, które można przechowywać w temperaturze 4°C do dwóch tygodni. Uwaga: należy uważać na zanieczyszczenia tego roztworu, ponieważ wpłyną one na jakość jaj.
6. Przygotuj płytki do iniekcji. W tym celu rozpuść 1% agarozę w 0,4X MMR w kuchence mikrofalowej, wlej ok. 6 mL roztopionego roztworu agarozy do płytek 60 mm, ostrożnie rozwiń formę elastomerową (Rysunek 1) na powierzchni roztworu, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, i pozostaw do ostygnięcia na około 20 minut w RT. Aby określić wymaganą liczbę płytek, weź pod uwagę liczbę warunków eksperymentalnych (np. 1, YFP; 2, YFP+Noggin) oraz liczbę potrzebnych zarodków gospodarzy po transplantacji. W naszych eksperymentach przygotowujemy co najmniej 20 zarodków gospodarzy po transplantacji dla każdego warunku eksperymentalnego. W temperaturze 18-19°C zarodki pozostają w stadium 15 przez około godzinę. Jeśli wykonanie 20 transplantacji zajmuje jedną godzinę, konieczne są dwa punkty czasowe zapłodnienia, zakładając, że zarodki gospodarze przyjmą wszystkie transplantaty. W związku z tym potrzebne będą cztery płytki do iniekcji (2 warunki exp x 2 punkty czasowe zapłodnienia = 4). Płytki należy przechowywać w temperaturze 4°C do jednego tygodnia.
7. Przygotuj płytki do izolacji czapeczek, używając 1% agarozy + 0,7X MMR z formami, tak jak w przypadku płytek do iniekcji. Przygotuj taką samą liczbę płytek do izolacji czapeczek jak płytek do iniekcji, plus jedną dodatkową na każdy punkt czasowy zapłodnienia (4 + 2 punkty czasowe zapłodnienia = 6).
8. Wstrzyknij samicom 500 jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej późno w dniu poprzedzającym mikroiniekcję. Samice przechowuj przez noc w temperaturze 16-18°C.

Część II. Mikroiniekcja RNA do zarodków Xenopus laevis

A. Przygotowanie do mikroiniekcji

1. Wyjąć indukowane hormonalnie samice i umieścić je w oddzielnych zbiornikach zawierających 1X roztwór do składania jaj (ELS). Uwaga: nie używamy jaj, które znajdowały się w ELS dłużej niż dwie godziny, ponieważ ich jakość spada. Dlatego około godziny przed zapłodnieniem in vitro usuwamy wszystkie jaja ze zbiornika, aby zbierać tylko świeżo złożone jaja.
2. Przygotować igłę do mikroiniekcji, odcinając końcówkę tak, aby uzyskać średnicę 25-35 μm. Umieścić igłę w pikoinkektorze i skalibrować go tak, aby dozował 10 nL na jedną iniekcję.
3. Ustawić inkubator na 14°C.
4. Gdy samice będą składać jaja przez około godzinę, zebrać jaja ze zbiornika za pomocą pipety transferowej i umieścić je w szalkach Petriego o średnicy 60 mm. Usunąć z jaj jak najwięcej ELS i zastąpić go 1X MMR. Jaja można zapłodnić natychmiast lub pozostawić w 1X MMR do godziny. W przypadku testu transplantacyjnego najlepiej zapłodnić dwie szalki, wypełnione w 80% pojedynczą warstwą jaj, w maksymalnie trzech oddzielnych partiach około godziny 11:00, 12:00 i 13:00. Po iniekcji zostaną one umieszczone w temperaturze 14°C, aby rozwinęły się do etapów wymaganych do izolacji czapeczki (stadium 8.5-9) i transplantacji (stadium 15; patrz Część I, pkt 6 powyżej).
5. Aby sprawdzić jakość jąder, przeprowadzamy zapłodnienie wczesnym rankiem (~8:00), co pozwala nam na pobranie jąder od innego samca, jeśli plemniki z pierwszego nie są żywotne. Uwaga: homogenizujemy ~0,25 jaja w 1 mL 1X MMR i dodajemy około 5 do 7 kropli na płytkę z oocytami.
6. Zapłodnić jaja in vitro za pomocą homogenizowanych jąder, a godzinę później usunąć otoczkę galaretową z jaj, używając roztworu do usuwania galaretki (164μl 1M DTT + 10mL 1M Tris, pH 8.8 do objętości 50 mL autoklawowanej wody nanopure). Odczekać, aż osiągną stadium dwukomórkowe, aby rozpocząć sortowanie, co zajmuje około 2 godzin w 18°C lub 1,5 godziny w temperaturze pokojowej (22°C).
7. Za pomocą pipety transferowej wyselekcjonować embriony o jednolitym zabarwieniu i równomiernym podziale, jak pokazano na lewej czapeczce zwierzęcej na Rycini 3, do dołka naczynia do iniekcji wypełnionego 0,4X MMR + 6% Ficoll.

B. Mikroiniekcja

1. Naciągnij Parafilm na pokrywę szalki Petriego o średnicy 60 mm. Nanieś pipetą 2 μl pierwszej próbki RNA na Parafilm i wciągnij ją za pomocą PLI-100, aby napełnić igłę do iniekcji. Przed rozpoczęciem iniekcji upewnij się, że igła nadal dozuje 10 nL próbki.
2. W jednej szalce wykonaj iniekcję 20-30 embrionów w stadium dwóch komórek (do obu blastomerów) z 500 pg RNA YFP, a w drugiej szalce iniekcję genu zainteresowania (np. 20 pg RNA Noggin) wraz z RNA YFP 7.
3. Umieść 100-200 nieiniekcyjnych embrionów na każdy punkt czasowy w kolejnej szalce do iniekcji z roztworem Ficoll. Przenosić je do inkubatora i z niego w tym samym czasie co embriony iniekcyjne. Będą one służyć jako biorcy w Części IV.
4. Po iniekcji inkubuj wszystkie embriony w temperaturze 14°C przez noc. Powtórz procedurę dla wszystkich punktów czasowych.

Część III. Izolacja czapeczek zwierzęcych z wstrzykniętych embrionów

1. Przybyć wcześnie rano w celu określenia stadium rozwoju embrionów. Najwcześniejszy punkt czasowy powinien odpowiadać stadium 9. Usunąć embriony, które nie przeżyły. Postępować zgodnie z poniższymi krokami, pracując z każdym punktem czasowym w partiach.
2. Odlać roztwór Ficollu z każdej płytki i ponownie dodać roztwór 0.7X MMR/gentamycyna. Do naczynia do izolacji czapeczek dodać obfitą ilość roztworu 0.7X MMR/gentamycyna. Wyjąć embriony z dołków naczynia do iniekcji za pomocą pipety transferowej i umieścić je w świeżo przygotowanym naczyniu do izolacji czapeczek.
3. Wyizolować czapeczki zwierzęce w roztworze 0.7X MMR + gentamycyna, zachowując 2 lub 3 nienaruszone embriony do określenia stadium rozwoju. Można użyć narzędzia Gastromaster z żółtą końcówką zagiętą do 400 μm lub pary ostrych pęset nr 5.
4. Umieścić czapeczki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 14°C do następnego dnia. Embriony gospodarza należy wyjąć z inkubatora w tym samym czasie co czapeczki, aby utrzymać je w tym samym stadium rozwoju co tkanka donora.

Część IV. Transplantacja kapsułek na bok ciała

1. Wyjmij czapy i embriony z pierwszego punktu czasowego z inkubatora 14°C i określ stadium rozwoju embrionów. Wyselekcjonuj jednorodne czapy wykazujące pozytywną fluorescencję żółtą lub czerwoną, w zależności od wstrzykniętego znacznika (Rycina 2).
2. Policz liczbę czap i przenieś dwukrotną liczbę embrionów w stadium 12-13 do świeżo przygotowanej szalki do iniekcji z roztworem 0.7X MMR/gentamycyną. Za pomocą ostrych pęsety #5 usuń błonę witelinową z każdego z nich. Przenieś je na płytkę z czapami, zachowując ostrożność. Bez błon witelinowych embriony mogą szybko ulec dysocjacji na powierzchni wody.
3. Używając gastromastera (żółta końcówka, wygięty drut 200-250μm, najwyższe ustawienie) lub pęsety #5, usuń kwadrat o boku 200 μm z boku embrionu w stadium 14-15 (Rycina 3). Następnie przetnij czapę na pół (za pomocą gastromastera lub pęsety #5) i umieść tkankę w otworze wykonanym w embrionie biorcy. Obróć embrion o ściankę dołka, aby umożliwić gojenie. Wykonaj tę czynność dla jak największej liczby embrionów, dopóki znajdują się one w stadium 15. Powtórz procedurę dla wszystkich punktów czasowych.
4. Embrion zazwyczaj goi się w ciągu 30 minut. Usuń martwe komórki (białe), wykonując delikatny ruch zamiatania pęsetą #5. Inkubuj je w temperaturze 18°C przez noc.
5. Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym wyselekcjonuj embriony z oznakowaną fluorescencyjnie, przeszczepioną tkanką. Umieść je ponownie w temperaturze 18°C i hoduj do stadium 42-43.
6. Zanurz zwierzęta w roztworze trikainy w celu znieczulenia. Na tym etapie można wykonać zdjęcia pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Po zakończeniu utrwal, wykonaj przekroje i przeprowadź immunostening lub hybrydyzację in situ z użyciem markerów dla badanej tkanki.

Rysunek 1. Projekt elementu z pleksiglasu do odlewania formy elastomerowej używanej do wytwarzania naczyń do utrzymywania embrionów. W kawałku pleksiglasu o wymiarach 50 x 50 mm i grubości 25 mm wyfrezowano kwadrat z zaokrąglonymi rogami o wymiarach 38 x 38 mm (głębokość ok. 5 mm). W plastiku wywiercono okrągłe, równomiernie rozmieszczone otwory (średnica 1,5 mm) o głębokości 1 mm. Aby wykonać formę elastomerową do naczyń do mikroiniekcji, wlano elastomer Sylgard do pleksiglasu i pozostawiono go do utwardzenia zgodnie z instrukcjami producenta. Ta forma elastomerowa jest wykorzystywana do produkcji płytek do iniekcji i izolacji zakrętki.

Rycina 2. Sortowanie czapeczek zwierzęcych przed transplantacją jest istotne, ponieważ ekspresja może być zróżnicowana.Czapeczka zwierzęca po lewej wykazuje równomierną ekspresję mCherry w całej tkance, natomiast eksplant po prawej wykazuje ekspresję punktową i zostanie odrzucony.

Rycina 3. U kijanki gospodarza rozwinęła się struktura przypominająca oko na boku ciała z przeszczepionych komórek czapki zwierzęcej. Obraz fluorescencyjny został nałożony na obraz w świetle przechodzącym.

Dyskusja

W tym filmie zaprezentowaliśmy naszą wersję klasycznych technik stosowanych przez biologów badających Xenopus, które zmodyfikowaliśmy w celu stworzenia testu przeszczepu czepek zwierzęcy. W temperaturze pokojowej zarodki Xenopus rozwijają się bardzo szybko między stadiami 9 a 15. Przechowywanie ich w temperaturze 14°C spowalnia rozwój zarodka, co pozwala na wykonanie znacznie większej liczby przeszczepów w jednym eksperymencie. Jeśli konieczne jest doprowadzenie zarodków do późniejszych stadiów (>42/...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw mMessage mMachine SP6	Applied Biosystems	AM1340
Borokrzemowe kapilary (1.0mm OD x 0.5mm ID)	FHC, Inc.	27-30-1
Wytciągacz mikropipet Sutter	Sutter Instrument Co.	P-97
Siarczan gentamycyny [50 mg/ml]	Fisher Scientific	BW17-528Z
Zestaw Sylgard/elastomer 1.1lb	Fisher Scientific	NC9644388
Polistyrenowa szalka Petri 60 x 15 mm	USA Scientific, Inc.	8609-0160
Ludzka gonadotropina kosmórkowa	Intervet Inc.	22219
Systemy mikroiniekcyjne Pico-Injector	Harvard Apparatus	650003
Inkubator Torrey Pines Scientific ECHOtherm	Fisher Scientific	11-680-21
Pipeta transferowa	Krackeler Scientific, Inc.	6290-20635A
Pinceta Dumostar #5	Fisher Scientific	11295-10