System biosensingu z modulacją magnetyczną jest wykorzystywany do szybkiego, czułego i prostego wykrywania analiz biologicznych, takich jak cząsteczki DNA i białka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybka homogeniczna detekcja w testach biologicznych z wykorzystaniem systemu biosensingu z modulacją magnetyczną
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
System biosensoryczny z modulacją magnetyczną (MMB) [1,2] umożliwia szybką i jednorodną detekcję celów biologicznych w niskich stężeniach bez konieczności przeprowadzania etapów płukania lub separacji. W przypadku obecności celu IL-8, test oparty na metodzie „kanapkowej” łączy kulki magnetyczne z przeciwciałem wychwytującym IL-8 z białkiem fluorescencyjnym sprzężonym ze streptawidyną za pośrednictwem celu IL-8 i biotynilowanego przeciwciała IL-8. Kulki magnetyczne są wprowadzane w ruch oscylacyjny poprzez przyłożenie gradientu zmiennego pola magnetycznego za pomocą dwóch biegunów elektromagnetycznych. Białka fluorescencyjne przyczepione do kulek magnetycznych ulegają kondensacji w obszarze detekcji, a ich ruch wewnątrz i na zewnątrz ortogonalnej wiązki lasera generuje okresowy sygnał fluorescencyjny, który jest demodulowany przy użyciu detekcji synchronicznej. System biosensoryczny z modulacją magnetyczną był wcześniej wykorzystywany do detekcji sekwencji kodujących komplementarne DNA (cDNA) białka niestrukturalnego 3 (NS3) wirusa Ibaraki [2]. Techniki zaprezentowane w niniejszej pracy w zakresie zewnętrznej manipulacji i kondensacji cząstek mogą znaleźć zastosowanie w innych obszarach, np. w dostarczaniu leków sprzężonych magnetycznie.in vivolub zwiększenia kontrastu dlain-vivozastosowania obrazowania.
Protokół
Analiza poziomu IL-8:
- Mieszanina reakcyjna zawierała następujące cztery składniki w końcowej objętości 100 μl buforu do analizy w ich odpowiednich stężeniach: 10 μl kulek magnetycznych z przeciwciałem wychwytującym w końcowym stężeniu 100 beads/μl, 2 μl biotynilowanego przeciwciała anty-IL-8 w końcowym stężeniu 1 nano-gram/μl, 1 μl fluorescencyjnego białka streptawidyny w końcowym stężeniu 20 nano-gram/μl oraz 1 μl celu IL-8 w stężeniu 0,48 pico-gram/μl. Składniki dodaje się pojedynczo do buforu do analizy, a następnie miesza przez 30 minut.
- Reakcję kontrolną przygotowuje się w ten sam sposób, z pominięciem celu IL-8.
- Następnie reakcje umieszcza się w kuwetach bez żadnego etapu separacji lub płukania i analizuje za pomocą systemu MMB.
System MMB:
- Umieść kuwetę w pozycji pomiędzy dwoma biegunami elektromagnetycznymi.
- Uruchom prąd modulujący i odczekaj 30 sekund, aby umożliwić agregację i kondensację kulek.
- Zmież sygnał z wzmacniacza synchronicznego za pomocą oscyloskopu.
Reprezentatywne wyniki:
Inspekcja wizualna zagregowanych kulek wykazała wyraźną różnicę między reakcją z obecnością celu a reakcją bez celu. We wszystkich reakcjach z celem kulki utworzyły pojedynczy, gęsty agregat, który przemieszczał się w wiązce lasera i poza nią w sposób jednolity. Natomiast we wszystkich reakcjach bez celu kulki były w mniejszym stopniu zagregowane, a ich ruch był mniej jednolity (patrz Rysunek 1).
Rycina 1: kontrola wizualna testu immunoenzymatycznego typu kanapka (a) bez docelowej IL-8 (b) z docelową IL-8.
Zegar modulacji biegunów (żółty) oraz sygnał wyjściowy PMT (magenta) podczas detekcji 0,48 pg celu IL-8 przedstawiono na Rysunku 1(a). Częstotliwość modulacji dla każdego bieguna wynosi 2 Hz. Jednak, zgodnie z teoretycznymi przewidywaniami, gdy kulek przechodzą przez wiązkę lasera, PMT wykrywa światło fluorescencyjne, co powoduje wystąpienie piku napięcia wyjściowego PMT. W związku z tym częstotliwość demodulacji wynosi 4 Hz. Po wprowadzeniu sygnału PMT oraz podwojonego zegara modulacji (o częstotliwości 4 Hz) do wzmacniacza synchronicznego, czuły detektor fazy wykrywa synchronizację, co skutkuje uzyskaniem wysokiego napięcia (patrz Rysunek 2).
Rysunek 2: (a) zegar modulacji (żółty) oraz sygnał PMT (magenta) podczas detekcji 0,48 pg celu IL-8. (b) Uzyskane napięcie wzmacniacza synchronicznego przy dwóch różnych skanowaniach.
Wzmacniacz lock-in nie wykrył żadnego sygnału podczas badania próbki kontrolnej. Fakt ten, wraz z widoczną różnicą w agregacji, sugeruje, że system MMB potrafi wyraźnie zidentyfikować obecność celu IL-8.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podsumowując, wykazaliśmy, że system MMB może być wykorzystany do wykrywania obecności docelowej cytokiny IL-8 w niskich stężeniach (granicą wykrywalności w testach cytokin Bio-Plex Precision Pro jest 0,5 pg [3,4]). Możliwości systemu nie ograniczają się do IL-8 i mogą być wykorzystane do wykrywania innych białek. Zaletami systemu MMB są zdolność do szybkiego wykrywania celu bez konieczności przeprowadzania jakichkolwiek etapów separacji lub przemywania. Dzięki temu proces detekcji zostaje ułatwiony, co pozwala na zastos...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Niniejsza praca była częściowo finansowana ze środków funduszu Ishaya Horowitz Fund.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw Bio-Plex Pro do oznaczania ludzkiej cytokiny IL-8 | Bio-Rad | 171-B5008M | |
| Rekombinowany ludzki antygen IL-8 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | R202625 | |
| Biotynilowane monoklonalne przeciwciało mysie anty-ludzkie IL-8 G265-8 | BD Biosciences | 554718 | |
| Streptawidyna sprzężona z białkiem fluorescencyjnym | Bio-Rad | Streptavidin PE |
Bibliografia
- Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
- Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
- Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". , Bio-Plex Pro. Forthcoming.
- Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. , Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
