Artykuł metodologiczny

Szybka homogeniczna detekcja w testach biologicznych z wykorzystaniem systemu biosensingu z modulacją magnetyczną

DOI:

10.3791/1935

⸱

13 czerwca 2010

 ,  ,  , 
1Department of Physical Electronics, Faculty of Engineering, Tel Aviv University, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis, 3Department of Biological Sciences, University of Illinois, 4Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System biosensingu z modulacją magnetyczną jest wykorzystywany do szybkiego, czułego i prostego wykrywania analiz biologicznych, takich jak cząsteczki DNA i białka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
System biosensoryczny z modulacją magnetyczną (MMB) [1,2] umożliwia szybką i jednorodną detekcję celów biologicznych w niskich stężeniach bez konieczności przeprowadzania etapów płukania lub separacji. W przypadku obecności celu IL-8, test oparty na metodzie „kanapkowej” łączy kulki magnetyczne z przeciwciałem wychwytującym IL-8 z białkiem fluorescencyjnym sprzężonym ze streptawidyną za pośrednictwem celu IL-8 i biotynilowanego przeciwciała IL-8. Kulki magnetyczne są wprowadzane w ruch oscylacyjny poprzez przyłożenie gradientu zmiennego pola magnetycznego za pomocą dwóch biegunów elektromagnetycznych. Białka fluorescencyjne przyczepione do kulek magnetycznych ulegają kondensacji w obszarze detekcji, a ich ruch wewnątrz i na zewnątrz ortogonalnej wiązki lasera generuje okresowy sygnał fluorescencyjny, który jest demodulowany przy użyciu detekcji synchronicznej. System biosensoryczny z modulacją magnetyczną był wcześniej wykorzystywany do detekcji sekwencji kodujących komplementarne DNA (cDNA) białka niestrukturalnego 3 (NS3) wirusa Ibaraki [2]. Techniki zaprezentowane w niniejszej pracy w zakresie zewnętrznej manipulacji i kondensacji cząstek mogą znaleźć zastosowanie w innych obszarach, np. w dostarczaniu leków sprzężonych magnetycznie.in vivolub zwiększenia kontrastu dlain-vivozastosowania obrazowania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza poziomu IL-8:

  1. Mieszanina reakcyjna zawierała następujące cztery komponenty w końcowej objętości 100 μl buforu do analizy w ich odpowiednich stężeniach: 10 μl kulek magnetycznych z przeciwciałem wychwytującym w końcowym stężeniu 100 beads/μl, 2 μl biotynilowanego przeciwciała anty-IL-8 w końcowym stężeniu 1 nano-gram/μl, 1 μl fluorescencyjnego białka streptawidyny w końcowym stężeniu 20 nano-gram/μl oraz 1 μl celu IL-8 w stężeniu 0,48 pico-gram/μl. Komponenty są dodawane pojedynczo do buforu do analizy, a następnie mieszane przez 30 minut.
  2. Reakcję kontrolną przygotowuje się w ten sam sposób, z pominięciem celu IL-8.
  3. Następnie reakcje są przenoszone do kuwet, bez żadnego etapu separacji lub przemywania, i analizowane za pomocą systemu MMB.

System MMB:

  1. Umieść kuwetę w pozycji pomiędzy dwoma biegunami elektromagnetycznymi.
  2. Uruchom prąd modulujący i odczekaj 30 sekund, aby umożliwić agregację i kondensację kulek.
  3. Zmierz sygnał z wzmacniacza lock-in za pomocą oscyloskopu.

Reprezentatywne wyniki:

Inspekcja wizualna zagregowanych kulek wykazała wyraźną różnicę między reakcją z udziałem celu a reakcją bez udziału celu. We wszystkich reakcjach z celem kulki tworzyły pojedynczy, gęsty agregat, który przemieszczał się w wiązkę lasera i poza nią w sposób jednolity. Jednak we wszystkich reakcjach bez celu kulki były w mniejszym stopniu zagregowane, a ich ruch był mniej jednolity (patrz Rysunek 1).

figure-protocol-1
Rycina 1: inspekcja wizualna kanapkowej immunoproby (a) bez docelowej IL-8 (b) z docelową IL-8.

Zegar modulacji bieguna (żółty) oraz sygnał wyjściowy PMT (magenta) podczas detekcji 0,48 pico-gram celu IL-8 przedstawiono na Rysunku 1(a). Częstotliwość modulacji dla każdego bieguna wynosi 2 Hz. Jednakże, zgodnie z teoretycznymi oczekiwaniami, gdy kuleczki przechodzą przez wiązkę laserową, PMT wykrywa światło fluorescencyjne i pojawia się piku napięcia wyjściowego PMT. W związku z tym częstotliwość demodulacji wynosi 4 Hz. Gdy sygnał PMT i podwojony zegar modulacji (przy 4 Hz) są podawane do wzmacniacza lock-in, czuły detektor fazy wykrywa synchronizację, co skutkuje wysokim napięciem (patrz Rysunek 2).

figure-protocol-2
Rysunek 2: (a) zegar modulacji (żółty) i sygnał PMT (magenta) podczas detekcji 0,48 pg celu IL-8. (b) Uzyskane napięcie wzmacniacza lock-in przy dwóch różnych skanowaniach.

Wzmacniacz lock-in nie wykrył żadnego sygnału podczas testowania próbki kontrolnej. Ten fakt, wraz z wizualną różnicą w agregacji, sugeruje, że system MMB potrafi wyraźnie zidentyfikować obecność celu IL-8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podsumowując, wykazaliśmy, że system MMB może być wykorzystany do wykrywania obecności docelowej cytokiny IL-8 w niskich stężeniach (granicą wykrywalności w testach cytokin Bio-Plex Precision Pro jest 0,5 pg [3,4]). Możliwości systemu nie ograniczają się do IL-8 i mogą być wykorzystane do wykrywania innych białek. Zaletami systemu MMB są zdolność do szybkiego wykrywania celu bez konieczności przeprowadzania jakichkolwiek etapów separacji lub przemywania. Dzięki temu proces detekcji zostaje ułatwiony, co pozwala na zastos...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsza praca była częściowo finansowana ze środków funduszu Ishaya Horowitz Fund.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw Bio-Plex Pro do oznaczania ludzkiej cytokiny IL-8Bio-Rad171-B5008M
Rekombinowany ludzki antygen IL-8Thermo Fisher Scientific, Inc.R202625
Biotynilowane monoklonalne przeciwciało mysie anty-ludzkie IL-8 G265-8BD Biosciences554718
Streptawidyna sprzężona z białkiem fluorescencyjnymBio-RadStreptavidin PE

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". , Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. , Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kuleczki magnetycznedetekcja IL 8bia ka fluorescencyjnezmienne pole magnetycznewzmacniacz synchronicznydetekcja synchronicznawzbudzenie laserowe

Powiązane artykuły