Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Streszczenie

TheDrosophilaMózg i układ wzrokowy są powszechnie wykorzystywanymi układami modelowymi do badania rozwoju, funkcji i degeneracji neuronów. W niniejszej pracy przedstawiamy trzy preparaty mózgu i układu wzrokowego, które obejmują zakres od kompleksu tarczy oka i mózgu w rozwijających się poczwarkach, po oddzielną dyssekcję oka i mózgu u dorosłych much. Wszystkie protokoły zostały zoptymalizowane pod kątem hodowli żywych preparatów. Przedstawiamy jednak również warunki dla immunohistochemii tkanek utrwalonych, tam gdzie jest to możliwe. Na koniec prezentujemy warunki obrazowania na żywo dla tych preparatów z wykorzystaniem konwencjonalnego i rezonansowego obrazowania konfokalnego 4D w komorze perfuzyjnej. Wspólnie protokoły te stanowią podstawę do obrazowania na żywo w różnych skalach czasowych – od funkcjonalnych testów wewnątrzkomórkowych w skali minut, po procesy rozwojowe lub degeneracyjne w skali wielu godzin.

Protokół

1. Wstęp

W tym filmie zademonstrujemy, jak przygotować mózgi i siatkówki Drosophila do obrazowania żywych tkanek oraz immunohistochemii, ze szczególnym uwzględnieniem komórek fotoreceptorów. Najpierw pokażemy, jak przygotować się do wypreparowania mózgu. Następnie zaprezentujemy dwie podstawowe metody preparacji powszechnie stosowane w immunohistochemii, które stanowią bazę dla przygotowań do obrazowania na żywo. Są to preparacje mózgu i oka dorosłego osobnika. Kolejno zademonstrujemy preparacje stosowane do obrazowania na żywo dorosłego oraz rozwijającego się mózgu, kładąc nacisk na ich wykorzystanie w obrazowaniu żywych fotoreceptorów. Na koniec opiszemy sposób obrazowania żywych tkanek i przedstawimy przykłady obrazowania na żywo z wykorzystaniem rezonansowej mikroskopii konfokalnej.

2. Przygotowanie do sekcji

1. Aby przeprowadzić prawidłową dyssekcję, niezbędne są ostre pęsety. Używając bloku do ostrzenia lub papieru ściernego o bardzo drobnej ziarnistości (>1500), delikatnie przesuwaj pęsetę w przód i w tył po każdej z krawędzi, aż końcówki złączą się w ostrym punkcie. My stosujemy standardny kamień do ostrzenia. Nie będziemy tutaj omawiać techniki ostrzenia, jednak należy pamiętać, że ostre pęsety są niezbędne do dyssekcji na żywo. Ostrzymy pęsety przed każdą dyssekcją.
2. W przypadku dyssekcji mózgu osobników dorosłych, umieść muchy na podkładce z CO₂, aby je znieczulić, a następnie wyselekcjonuj pożądany genotyp. W przypadku dyssekcji poczwarki, po prostu sięgnij do fiolki i ostrożnie wyjmij poczwarkę pęsetą, uważając, aby nie uszkodzić jej łupiny.
3. Zwilż chusteczkę Kimwipe wodą. Będzie ona służyć podczas dyssekcji do usuwania zanieczyszczeń z pęsety. Umieść szalkę do dyssekcji na stole stereomikroskopu i napełnij ją roztworem HL3 ¹. Wszystkie dyssekcje będą przeprowadzane w HL3, aby zapewnić, że tkanka pozostanie żywa i zdrowa podczas całej procedury. Stosujemy również szalkę do dyssekcji z dnem pokrytym Sylgardem, aby chronić pęsety podczas pracy.
4. Teraz przygotuj roztwór utrwalający, jeśli planujesz przeprowadzić immunohistochemię. Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 500μL wlej 180μL HL3. Dodaj 20μL 37% formaldehydu, aby otrzymać roztwór formaldehydu o stężeniu 3,7%.
5. Na koniec, kluczowe dla udanej dyssekcji jest prawidłowe ułożenie dłoni. Dzięki właściwemu uchwytowi pęseta będzie stabilna, co umożliwi kontrolowane i precyzyjne ruchy. Najpierw oprzyj pęsetę o bok kciuka. Następnie skieruj palec wskazujący pionowo w dół tak, aby jego opuszek spoczywał na górze pęsety. Teraz oprzyj bok pęsety o bok palca środkowego i przesuń dłoń do szalki do dyssekcji. Dotykaj szalki kciukiem i palcem środkowym. Opierając kciuk i palec środkowy o szalkę, oprzyj nadgarstek o stół mikroskopu. W ten sposób uzyskasz trzy punkty stabilnego podparcia o powierzchnie podczas dyssekcji, co pozwala na wykonywanie bardzo subtelnych manipulacji pęsetą. Technika ta może początkowo wydawać się nieco nienaturalna, ale dzięki praktyce szybko opanujesz sztukę dyssekcji mózgu.

3. Mózg dorosły

1. Na podkładce z CO₂ ustaw dorosłą muchę stroną brzuszna do góry, tak aby głowa była skierowana w stronę przeciwną do dłoni. Chwyć tułowia tuż poniżej głowy. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, odnóża i proboscis wyprostują się. Obserwując preparat pod stereoskopem, chwyć wyprostowany proboscis pęsetą, aby oddzielić głowę. Odrzuć ciało i zanurz głowę w roztworze. Ponownie ustaw ostrość na zanurzoną głowę. Cała sekcja będzie przeprowadzana w roztworze. Bardzo ważne jest, aby przez cały czas trzymać głowę pęsetą. W przeciwnym razie głowa może wypłynąć na powierzchnię, co utrudnia jej odzyskanie. Jeśli podczas sekcji głowa wyjdzie z obszaru ostrości, po prostu przesuń ją z powrotem w płaszczyznę ogniskową, nie regulując mikroskopu. To pozornie proste zadanie może być na początku trudne, ale utrzymywanie głowy w ostrości stanie się łatwiejsze z czasem.
2. Rozpocznij sekcję, rozrywając najpierw tkankę łączną między proboscis a okiem. Rozrywaj oko, trzymając je mocno przynajmniej jedną pęsetą przez cały czas. Upewnij się, że końcówka pęsety znajduje się tuż pod siatkówką lub kutykulą, aby uniknąć uszkodzenia znajdującego się pod spodem mózgu. Używając pęsety, na przemian z lewej i prawej strony, odrywaj siatkówkę, kierując się ku tyłowi głowy. Odrywanie siatkówki zwiększy szansę, że lamina pozostanie przytwierdzona do płata optycznego podczas całej sekcji. Kontynuuj wokół tyłu głowy, odrywając po drodze kutykulę. Rozrywaj drugie oko i zacznij oddzielać kutykulę. Dopóki chwycisz kutykulę, masz pewność, że nie zgniatasz mózgu! Mając to na uwadze, nadal odrywaj kutykulę i siatkówkę, aż odsłonisz mózg.
3. Gdy mózg będzie widoczny, możesz przystąpić do usuwania przylegających do niego tchawicek (Rys. 1A). Kontynuuj oddzielanie tchawicek i kutykuli, aż mózg zostanie wyizolowany. W tym momencie, na potrzeby pozostałych etapów, należy przenieść ostrość na dno naczynia. Usuń pozostałe tchawice, w przeciwnym razie mózg może wypłynąć podczas nocnych przemywań przeciwciałami. W celu obrazowania zakończeń fotoreceptorów pożądane jest zachowanie laminy, ale należy usunąć siatkówkę, która zawiera ciała komórek i silnie autofluorescencyjny pigment. Aby to zrobić, ostrożnie usuń puszyste i pigmentowane szczątki komórkowe, nie uszkadzając laminy. Wymaga to większej precyzji i wprawy.
4. Dorosły mózg można utrzymać przy życiu przez wiele godzin, a nawet dni, stosując warunki, które zostaną omówione w sekcji 6. W przypadku immunohistochemii dorosły mózg jest teraz gotowy do utrwalenia w formaldehydzie.² Użyj pipety P20 ustawionej na 5μL, aby przenieść dorosły mózg do wcześniej przygotowanego roztworu utrwalającego. Kontynuuj sekcję mózgów dorosłych osobników przez 20 minut, co powinno pozwolić na uzyskanie od 4 do 10 mózgów. Pozostaw mózgi w utrwalaczu przez kolejne 40 minut, choć czas ten może się różnić w zależności od optymalnego barwienia przeciwciałem pierwotnym. Usuń roztwór formaldehydu i przemyj mózgi 3 razy przez 5 minut każdy w 400μL roztworu zawierającego PBS i 0,4% TritonX-100, zwanego dalej PBS-Triton. Po całkowitym wypłukaniu roztworu utrwalającego można dodać roztwór przeciwciała pierwotnego.

4. Oko dorosłego osobnika

1. Rozpocznij tę sekcję zgodnie z opisem dla mózgu dorosłego osobnika. Po zanurzeniu głowy i ponownym ustawieniu ostrości mikroskopu, zacznij od przerwania tkanki łącznej między trąbką a okiem. Nad trąbką oddziel kutykulę od oka. Następnie oddziel kutykulę od dolnej strony oka, przesuwając się w stronę tyłu głowy. Jedną pęsetą chwyć środek tyłu głowy. Drugą pęsetą chwyć oko i pociągnij. Pozwól, aby oko opadło na dno naczynia (Ryc. 1B). Lamina prawdopodobnie wciąż będzie przytwierdzona do oka i może zostać w tym momencie wykorzystana do obrazowania na żywo zakończeń całkowicie nienaruszonych komórek fotoreceptorowych. Aby kontynuować obrazowanie na żywo ciał komórek fotoreceptorowych, przejdź do sekcji 4.5. Kolejne trzy sekcje wyjaśniają immunohistochemię utrwalonego oka.
2. W przypadku immunohistochemii przenieś oko do roztworu utrwalającego, używając mikropipety P20 ustawionej na 5μL. Kontynuuj sekcję oczu dorosłych osobników przez łącznie 10 minut. Pozostaw oczy w utrwalaczu na kolejne 30 minut. Usuń roztwór utrwalający i przeprowadź płukanie zgodnie z opisem dla sekcji mózgu dorosłego osobnika.
3. Jeśli ostatecznie chcesz obrazować strukturę ommatidialną oka, lamina musi zostać teraz usunięta. Przenieś utrwalone oczy z powrotem do naczynia sekcyjnego i usuń wszelkie tchawki lub komórki tłuszczowe, które mogą być nadal przytwierdzone. Następnie, trzymając zewnętrzną stronę oka jedną pęsetą, usuń laminę drugą pęsetą. Powinna ona oddzielić się w jednym kawałku, odsłaniając znajdujące się pod nią ciała komórkowe (Ryc. 1B). Pamiętaj, aby chwytać wyłącznie laminę! W przeciwnym razie ryzykujesz oddzielenie fotoreceptorów od siatkówki.
4. Używając mikropipety P20, przenieś oczy do 400uL PBS-Triton w probówce 500uL. Delikatnie wstrząsaj nimi w temperaturze 4 stopni przez noc, aby usunąć autofluoryzacyjny czerwony pigment z fotoreceptorów. Następnego dnia można wylać roztwór płuczący i dodać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego.
5. Do obrazowania na żywo oczu dorosłych osobników używamy wyłącznie much w stadium pharate adult, czyli późnych stadiów poczwarki tuż przed wykluciem. Na tym etapie ciała komórek fotoreceptorowych oddzielają się od zakończeń w laminie podczas sekcji.
6. Poczwarki w stadium pharate adult mają wyraźnie zarysowane skrzydła, oczy i kutykulę widoczną przez łupinę poczwarki. Wybierz poczwarkę i usuń przednią część łupiny, aby odsłonić region głowy. Ostrożnie usuń cienką wewnętrzną błonę, która dodatkowo otacza rozwijającą się muchę. Chwyć pęsetą podstawę głowy i pociągnij. Usuń resztę poczwarki, utrzymując głowę zanurzoną.
7. Postępuj zgodnie z procedurą sekcji oka dla immunohistochemii. Jednak w stadium pharate adult ciała komórek fotoreceptorowych odłączą się łatwiej od laminy, co umożliwi obrazowanie ciał komórkowych wbudowanych w siatkówkę. Ponadto lamina pozostaje przytwierdzona do płata optycznego, co pozwala na obrazowanie dystalnej części laminy. Jeśli chcesz obrazować laminę proksymalną, w której widoczne są kartridże zakończeń fotoreceptorowych, wykonaj sekcję oka u dorosłej muchy, u której lamina jest mocniej przytwierdzona do oka.

5. Rozwój kompleksów tarczka oka-mózg

1. Rozwijający się krążek oka w 20% rozwoju poczwarki (P+20%) stał się w naszym laboratorium preferowanym obiektem do obrazowania na żywo, ponieważ ta pojedyncza warstwa stosunkowo dużych, rozwijających się komórek jest łatwo obserwowalna przy użyciu mikroskopii konfokalnej.³
2. Aby wybrać poczwarkę w stadium 20%, należy szukać cewek Malpighiego oraz zielonej plamki widocznej pod osłonką poczwarki i unikać poczwarek o „ciemnym ciele”⁴. Po wybraniu poczwarki P+20% należy zanurzyć ją w medium HL3 w naczyniu sekcyjnym i ostrożnie usunąć przednią część worka poczwarki, uważając, aby nie przebić cienkiej wewnętrznej błony. Chwyć wewnętrzną błonę pęsetą i rozdziel ją.
3. Uważnie przeszukaj uwolnioną zawartość, aby znaleźć rozwijający się mózg i krążki oka, które są bardzo wyraźne (Ryc. 1C). Kompleks krążek oka-mózg jest łatwo oddzielny na tym etapie metamorfozy. Odizoluj mózg na dnie naczynia sekcyjnego. Ostrożnie oddziel mózg centralny od płata optycznego. Płat optyczny/krążek oka zostanie wykorzystany do obrazowania na żywo.

6. Obrazowanie na żywo: przy mikroskopie

1. Jeśli planują Państwo obrazowanie przez krótki czas w tylko jednym lub dwóch roztworach, tkankę można obrazować na szkiełku przedmiotowym. W takim przypadku należy przygotować szkiełko, pokrywając najpierw jego powierzchnię Sylgardem zgodnie z instrukcją producenta. Na środek szkiełka należy nanieść 20μL HL3. Wypreparowaną tkankę należy przenieść na szkiełko w dodatkowych 20μL HL3. Tkanka NIGDY nie może być wystawiona na działanie powietrza. Ponadto należy unikać jakichkolwiek naprężeń lub odkształceń wynikających z obsługi pipetą lub napięcia powierzchniowego roztworu.
2. W przypadku obrazowania żywych tkanek, tkanka musi być stabilnie zamocowana przy minimalnej manipulacji i kontakcie. Pozycjonujemy mózg, używając polimeryzującego w wodzie kleju chirurgicznego GluShield aplikowanego za pomocą mikroelektrody, co jest techniką rutynowo stosowaną w preparatach embrionalnych do elektrofizjologii⁵. Należy użyć elektrody szklanej, takiej jak te wyciągane do rejestracji elektrofizjologicznej. Należy odłamać końcówkę i napełnić koniec GluShieldem, wykorzystując ujemne ciśnienie powietrza generowane ustami. Należy odłamać tylko tyle elektrody, aby klej mógł wniknąć do środka. Następnie za pomocą dodatniego ciśnienia należy nanieść niewielką ilość kleju na Sylgard pod kroplą HL3. Teraz należy szybko położyć tkankę na kleju, zachowując pożądaną orientację do obrazowania na żywo. Do obrazowania można teraz użyć obiektywu imersyjnego wodnego. Jeśli chcą Państwo dodać barwnik przenikający przez błonę, można go dodać do kąpieli w trakcie obrazowania.
3. Używamy konfokalnego mikroskopu z rezonansowym skanowaniem, który umożliwia szybkie obrazowanie przy zredukowanym fotobieleniu.⁶ Do obrazowania przez dłuższy czas lub w celu całkowitej bądź wielokrotnej wymiany roztworów, stosujemy komorę perfuzyjną (komora do obrazowania konfokalnego Harvard IC30) podłączoną do pompy perystaltycznej, która powoli perfunduje żywą tkankę roztworem hodowlanym (Rys. 2A). Ciągła wymiana cieczy oraz minimalny kontakt z GluShield ograniczają spłaszczanie tkanki, które obserwowano w dłuższych okresach czasu⁷. Należy pamiętać, że w przypadku obrazowania okresów rozwojowych, kompleks tarczka oka-mózg musi pozostać nienaruszony i powinien mieć minimalny kontakt z klejem.
4. Należy użyć szkiełka nakrywkowe pokrytego kroplą Sylgardu, który został zeskrobany, aby był cienki i płaski. Na środek nakrywki należy nanieść 20μL HL3 i przykleić żywą tkankę do Sylgardu. Należy utworzyć uszczelkę, która pozwoli pęcherzykom powietrza przechodzić przez komorę bez wystawiania żywej tkanki na działanie powietrza (Rys. 2B). Uszczelka powinna być wystarczająco gruba, aby uniknąć zmiażdżenia tkanki, ale wystarczająco cienka, aby zbliżyć tkankę do obiektywu mikroskopu konfokalnego; w naszej konfiguracji stosujemy 250μm. Należy złożyć komorę perfuzyjną, dbając o to, aby tkanka była przez cały czas całkowicie zanurzona. Perfuzję należy rozpocząć początkowo z prędkością bliską 100μL na minutę, używając pompy perystaltycznej. Prędkość ta jest dość wysoka, w zależności od grubości uszczelki definiującej wysokość komory. Do obrazowania w skali godzin może być konieczne dodanie 20-hydroksyekdyzonu i antybiotyku (ale nie środka przeciwgrzybiczego) oraz prowadzenie perfuzji z znacznie mniejszą prędkością, około 10μl na minutę. Na koniec napowietrzamy tlenem pożywkę hodowlaną dostarczaną do komory perfuzyjnej.

7. Reprezentatywne wyniki:

Na koniec naszego protokołu wideo przedstawiamy przykład obrazowania na żywo w rozwijających się komórkach fotoreceptorów z wykorzystaniem preparacji opisanej w Sekcji 5. Preparacja ta wykorzystuje transgenezę Drosophila do specyficznej dla danych komórek ekspresji reporterów fluorescencyjnych. W pokazanym przykładzie dwa reportery fluorescencyjne są ekspresowane pod kontrolą specyficznego dla fotoreceptorów sterownika GMR-Gal4⁸: myrRFP znakowany błonowo oraz marker endosomalny 2xFYVE-GFP⁹. Dwukanałowe zestawy danych 3D o obszarze obrazowania 70x70x17.5μm i rozmiarze woksela 137x137x700nm (512x512x26) pozyskiwano co 1 min. Film przedstawia wybraną płaszczyznę w czasie w tym 4D zbiorze danych, co ujawnia dynamikę wewnątrzkomórkowego transportu endosomalnego oraz zdarzenia fuzji pęcherzyków. Reprezentatywne obrazy dla utrwalonych preparatów tkanki oka i lamina znajdują się na Ryc. 3.

Dyskusja

Sondy fluorescencyjne użyte do obrazowania

W niniejszym opracowaniu opisujemy zalety i ograniczenia preparacji systemu wzrokowego Drosophila dla wybranych sond fluorescencyjnych z trzech klas: (1) sond dodawanych egzogennie do preparatu z żywej tkanki; (2) białek fluorescencyjnych kodowanych genetycznie, stosowanych zarówno w obrazowaniu żywych, jak i utrwalonych tkanek; (3) barwników fluorescencyjnych dodawanych do utrwalonej tkanki w celu przeprowadzenia immunohistochemii.

1. Sondy egzogenne:

Lysotracker Green DND-26 lub Red DND-99 (Invitrogen, Inc.) Są to dostępne komercyjnie fluorescencyjne związki przenikające przez błony, które gromadzą się w silnie zakwaszonych przedziałach komórkowych, przede wszystkim w lizosomach, późnych endosomach i autofagosomach. Lysotracker w stężeniach nanomolowych (zazwyczaj stosujemy 50 nM) w pełni przenika przez tarczkę oka L3 i P+20% w czasie krótszym niż jedna minuta. Ponieważ Lysotracker stale się gromadzi i wykazuje efekt alkalizujący, obrazowanie przeprowadzamy w czasie krótszym niż 5 minut. W przeciwieństwie do tarczek oka, Lysotracker nie przenika do mózgu bez przerwania ciągłości tkanki. Jednak ostrożne przerwanie zewnętrznej błony pozwala na przenikanie na głębokość kilku średnic komórek w płacie wzrokowym.

Lysosensor DND-189 (Invitrogen, Inc.) W przeciwieństwie do Lysotrackera, Lysosensor nie gromadzi się w zakwaszonych przedziałach, lecz wykazuje zwiększoną fluorescencję przy niskim pH. Lysosensor posiada właściwości penetracyjne bardzo podobne do Lysotrackera. Stosujemy Lysosensor w stężeniu 1μM.

2. Sondy kodowane genetycznie:

W przypadku wielu eksperymentów z obrazowaniem na żywo ekspresujemy geny znakowane różnymi cząsteczkami fluorescencyjnymi, takimi jak GFP, TagRFP¹⁰ lub czułym na pH pHluorin¹¹, pod kontrolą binarnego systemu ekspresji Gal4/UAS¹². Linie Gal4 wykazujące ekspresję w rozwijających się fotoreceptorach obejmują GMR-Gal4 (wszystkie fotoreceptory)⁸ oraz mDelta0.5-Gal4 (rozwijające się R4 i R7)¹³. Istnieje kilka linii sterujących Gal4 specyficznych dla poszczególnych podtypów, które wykorzystują różne promotory rodopsyny¹⁴. Szczególnie użytecznymi sondami fluorescencyjnymi w obrazowaniu na żywo są białka fotokonwertowalne. Z powodzeniem zastosowaliśmy Dendra2, monomerowe białko fotokonwertowalne z zielonego na czerwony¹⁵. Należy zauważyć, że Dendra2 została zaprojektowana do fotokonwersji przy użyciu linii lasera argonowego o długości fali 488nm. Jednakże, przy użyciu naszej aparatury nie byliśmy w stanie przeprowadzić konwersji za pomocą widzialnego niebieskiego światła, zarówno w konwencjonalnym, jak i rezonansowym trybie skanowania konfokalnego. W przeciwieństwie do tego, konwersja za pomocą lasera UV 405nm jest efektywna.

3. Immunohistochemia:

W przypadku utrwalonego oka dorosłego osobnika do wizualizacji struktury rhabdomerycznej często wybieramy rodaminową falloidynę (Invitrogen, Inc.) lub przeciwciało anty-Chaoptin (przeciwciało specyficzne dla fotoreceptorów¹⁶) (Ryc. 1A). Dobrą metodą analizy struktury wkładów lamina jest połączenie przeciwciał anty-chaoptin¹⁶, markera glejowego anty-ebony¹⁷ oraz anty-sec6¹⁸ (Ryc. 1B). Jak pokazano na Ryc. 3, ta kombinacja przeciwciał pozwala rozróżnić główne wypustki presynaptyczne (chaoptin) i postsynaptyczne (sec6), a także gleję nabłonkową (ebony) w lamina¹⁹.

Montaż komory perfuzyjnej

Do obrazowania na żywo wykorzystujemy komorę perfuzyjną, która umożliwia powolną wymianę roztworów bez zakłócania preparatu tkankowego. Demonstracja montażu komory perfuzyjnej została zawarta w filmie oraz przedstawiona schematycznie na Rysunku 2. Montaż komory perfuzyjnej zilustrowano na Rys. 2A. Należy rozpocząć od położenia uszczelki na próbce, a następnie kontynuować montaż zgodnie z instrukcją. Celem uszczelki jest stworzenie przestrzeni między podstawą komory a pokrywą – przestrzeni, w której tkanka zostaje uszczelniona i przez którą będzie przepływał roztwór. Przestrzeń wewnątrz uszczelki musi obejmować wlot (tutaj wprowadzany jest roztwór), preparat tkankowy oraz wylot, przez który roztwór opuszcza komorę. Kluczowe są dwie cechy uszczelki: po pierwsze, musi być ona wystarczająco gruba dla mózgu, a jednocześnie na tyle cienka, aby umożliwić obrazowanie za pomocą soczewki o wysokiej rozdzielczości. Idealna grubość uszczelki zależy od parametrów specyficznych dla danej konfiguracji. Po drugie, wcięcie w uszczelce tworzy komorę, która pozwala pęcherzykowi powietrza przejść bez kontaktu z próbką (Rys 2B).

Obrazowanie pod mikroskopem

Do komory perfuzyjnej wykorzystujemy obiektyw imersyjny glicerynowy 63x (apertura 1,3), a bezpośrednio w medium hodowlanym na szkiełku – obiektyw imersyjny wodny 63x. Obiektywy glicerynowe zapewniają większą odległość roboczą niż obiektywy olejowe. Stosujemy rezonansowy konfokalny mikroskop skanujący, który skanuje z znacznie większą prędkością niż skaner konwencjonalny (odpowiednio 8000 Hz w porównaniu do 1400 Hz). Skanowanie rezonansowe umożliwia trójwymiarowe rejestracje w czasie przy wyższych częstotliwościach odświeżania klatek. Ponadto szybsze prędkości skanowania znacząco redukują fototoksyczność laserową⁶, co jest kluczowe przy wielokrotnych skanowaniach żywych tkanek. Należy osiągnąć równowagę między intensywnością lasera a napięciem PMT (wzmocnieniem), aby zmaksymalizować sygnał przy jednoczesnej minimalizacji szumu i fotobleachingu. Ważnym dodatkowym aspektem jest to, że stopień oddziaływania lasera na dany obszar jest określony przez rozdzielczość i powiększenie (zoom). Na przykład wybrany obszar jest skanowany z taką samą rozdzielczością przy ustawieniach 256x256, zoom 2x, jak i przy 512x512, zoom 1x, jednak maksymalna możliwa prędkość obrazowania na żywo jest 4-krotnie większa przy 256x256, zoom 2x. Aby zarejestrować aktywność szybko przemieszczających się przedziałów wewnątrzkomórkowych, z powodzeniem stosowaliśmy następujące ustawienia: 5 klatek na stos z (z-stack) przy częstotliwości jednego stosu z na 10 sekund, z prędkością skanowania 8000 Hz i dwukrotnym uśrednianiem linii (2x line averaging). Podczas długich sesji obrazowania trwających wiele godzin często zmniejszamy częstotliwość klatek do jednej na kilka minut i wybieramy większe obszary, ponieważ preparat jest bardziej podatny na przesunięcia.

Drosophila Anatomia układu wzrokowego

Rysunek 3 przedstawia anatomię oka dorosłej muchy Drosophila (Rys. 3A), mózgu dorosłego osobnika (Rys. 3B) oraz kompleksu tarczy oka i mózgu poczwarki w stadium 20% -25% (Rys. 3C). Rysunek 3A ilustruje oko dorosłego osobnika z przytwierdzoną laminą i komórkami tłuszczowymi oraz bez nich. Podczas sekcji oka dorosłego osobnika laminę, która znajduje się w centrum oka, osadzoną w zagłębieniu utworzonym przez ciała komórek fotoreceptorów (po lewej), należy usunąć w taki sposób, aby nie naruszyć znajdujących się pod nią ciał komórkowych (po prawej). W przypadku sekcji mózgu dorosłego osobnika powinno być możliwe rozróżnienie ciał komórek fotoreceptorów, laminy, płata optycznego, mózgu centralnego oraz tchawki (Rys. 3B). Do przeprowadzenia tej sekcji konieczne jest usunięcie fotoreceptorów i tchawki, przy jednoczesnym pozostawieniu laminy przytwierdzonej do płata optycznego. Aby ułatwić identyfikację kompleksu tarczy oka i mózgu poczwarki w stadium 20-25%, na Rysunku 3C przedstawiono obraz z żywego organizmu.

Rycina 1. (A) mózg osobnika dorosłego. (B) oko osobnika dorosłego. (C) kompleks tarczy oka/mózgu w stadium poczwarki (20%-25%).

Rysunek 2. (A) Montaż komory perfuzyjnej oraz (B) rozmieszczenie uszczelki względem próbki.

Rycina 3. (A) Barwienie rhabdomerów u osobników dorosłych z użyciem przeciwciał anty-chaoptin. (B) Barwienie lamina u osobników dorosłych z użyciem przeciwciał anty-chaoptin (zielone, fotoreceptory), anty-ebony (czerwone, glej) oraz sec6 (niebieskie, interneurony).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sylgard 184	Dow Corning	103251252
GluShield	GluStitch, Inc.	GB055QO
20-hydroksyekdyzon	Sigma-Aldrich	H5142-10mg	5 mg/ml w EtOH
Specjalistyczny sprzęt: Stereomikroskop do sekcji: Leica Mz12.5 z kamerą cyfrową Konfokalny mikroskop z tandemowym skanerem Leica TCS SP5 do konwencjonalnego i rezonansowego obrazowania żywych tkanek mikroskopia obrazująca, w tym lasery niebieski (488 nm), zielony (561 nm), pomarańczowy (594 nm) i dalekiej czerwieni (633 nm), a także specjalistyczne obiektywy 63x/1,4 w glicerynie oraz 63x/1,3 w wodzie. Komora do obrazowania konfokalnego RC-30 oraz pompa perystaltyczna model 720 firmy Harvard Instruments Sutter Pipette puller P-97 Oprogramowanie: Amira 5.2, Visage Imaging