Strefa podkomorowa en-face: barwienie całego preparatu i przepływ ependymalny

Podsumowanie

Ściany komór bocznych zawierają największy region zarodkowy w dorosłym mózgu ssaków. Tradycyjnie badania nad neurogenezą w tym obszarze opierały się na klasycznych technikach sekcjonowania do analizy histologicznej. Przedstawiamy tutaj alternatywne podejście — technikę preparatów całych (wholemount), która zapewnia kompleksowy widok en-face tego regionu zarodkowego.

Streszczenie

Ściany komór bocznych zawierają największy region zarodkowy w dorosłym mózgu ssaków. Strefa podkomorowa (SVZ) w tych ścianach jest szeroko badanym systemem modelowym służącym do zrozumienia zachowania neuralnych komórek macierzystych oraz regulacji neurogenezy u osobników dorosłych. Tradycyjnie badania te opierały się na klasycznych technikach sekcjonowania w analizie histologicznej. Przedstawiamy tutaj alternatywne podejście – technikę preparatów całych (wholemount), która zapewnia kompleksowy widok en-face tego regionu zarodkowego. W porównaniu z przekrojami, preparaty całe zachowują pełną cytoarchitekturę i zależności komórkowe w obrębie SVZ. Podejście to wykazało niedawno, że dorosłe neuralne komórki macierzyste, czyli komórki typu B1, są częścią mieszanego neuroepithelium wraz z zróżnicowanymi komórkami ependymalnymi wyścielającymi komory boczne. Ponadto metoda ta była wykorzystywana do badania polaryzacji planarnej komórek ependymalnych oraz generowanego przez nie przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego w komorze. W obliczu niedawnych dowodów wskazujących, że dorosłe neuralne komórki macierzyste stanowią heterogenną populację o specyfice regionalnej, technika preparatów całych będzie prawdopodobnie niezbędnym narzędziem do zrozumienia organizacji i parcelacji tej niszy komórek macierzystych.

Protokół

I. Przygotowanie szklanych mikropipet wypełnionych fluorescencyjnymi mikrokulkami do testu przepływu komórek ependymalnych (kroki te można pominąć, jeśli przygotowywane są preparaty całych organów wyłącznie w celu barwienia).

1. Zamocuj szklaną kapilarę Wiretrol 5 µl w wyciągarce do mikropipet i dostosuj ustawienia grzałki oraz elektrozaworu tak, aby uzyskać pipetę z gładkim, płytkim zwężeniem.
2. Podłącz źródło dodatniego ciśnienia powietrza do końca wyciągniętej mikropipety i delikatnie opuść czubek pipety na metalową kratkę pod kątem 45°, aby stworzyć ściętą końcówkę. Dodatnie ciśnienie powietrza pomaga usunąć odłamki szkła z wnętrza pipety. Oczyść koniec ściętej końcówki za pomocą chusteczki zwilżonej etanolem.
3. Obejrzyj czubek pipety pod mikroskopem z mikromierzem. Końcówka powinna mieć gładkie ścięcie o wewnętrznej średnicy otworu wynoszącej ok. 10 µm. Można stosować mniejsze średnice, ale często prowadzi to do zapchania pipety fluorescencyjnymi kuleczkami.
4. Napełnij pipetę od tyłu olejem mineralnym do połowy, a następnie wsuń w tył pipety tłok nasączony smarem. Przesuń menisk oleju mineralnego do czubka pipety, ręcznie wpychając tłok.
5. Zamocuj mikropipetę i tłok w mikromanipulatorze, a następnie przykręć uchwyt do pipet mikromanipulatora do małego stałego ramienia z regulowaną wysokością.
6. Napełnij pipetę od przodu roztworem fluorescencyjnych mikrokuleczek, składającym się z 50% roztworu stokowego mikrokuleczek fluorescencyjnych, 45% wody i 5% glicerolu. Glicerol jest dodawany w celu zwiększenia gęstości roztworu, aby po naniesieniu na preparat całego organu (wholemount) mikrokuleczki opadły na jego powierzchnię.
7. Umieść mikromanipulator w bezpiecznym miejscu, aby uniknąć przypadkowego złamania igły, i przystąp do sekcji preparatu całego organu.

II. Disekcja i utrwalanie całego preparatu

1. Aby przygotować się do preparatyki całego organu (wholemount), podgrzać odpowiednią ilość pożywki Leibovitz L-15 do 37°C. Będzie potrzebne około 10 ml na każde zwierzę przeznaczone do sekcji. Należy również przygotować wszystkie materiały niezbędne do sekcji i fiksacji pod stereomikroskopem: nożyczki, duże pęsety ząbkowane, cienkie pęsety gładkie, mikrosurgicalny nóż kłuty Sharpoint 22,5°, naczynie sekcyjne, ręcznik papierowy, worek na odpady biologiczne oraz płytkę 24-dołkową umieszczoną na lodzie, wypełnioną 4% paraformaldehydem (PFA) z dodatkiem lub bez dodatku 0,1% Triton X-100. Triton X-10 stosuje się w celu obniżenia napięcia powierzchniowego roztworu PFA, co zmniejsza ryzyko uszkodzeń powierzchni preparatu podczas zanurzania go w tym roztworze.
2. Nalać 5-10 ml podgrzanej pożywki do naczynia sekcyjnego umieszczonego pod fluorescencyjnym stereomikroskopem. Naczynia sekcyjne przygotowuje się poprzez wlanie elastycznego polimeru, zwanego Sylgard 184, do plastikowego naczynia o średnicy 6 cm i pozostawienie roztworu polimeru do utwardzenia przez 1 tydzień w próżni, a następnie dokładne wypłukanie naczyń dużymi objętościami wody przed użyciem. Zazwyczaj pozostawiamy naczynia do moczenia w wodzie w beczkerze o pojemności 1 L przez 1 tydzień.
3. Zwierzę uśmierca się poprzez zwichnięcie szyjowe, a następnie odcina głowę.
   Uwaga: Jeśli jest to pożądane, krew można usunąć z naczyń krwionośnych, perfundując zwierzę solą fizjologiczną przed wyjęciem mózgu. Jest to szczególnie istotne w przypadku wykonywania chromogennego barwienia immunohistorycznego z użyciem diaminobenzydyny (DAB).
4. Wykonuje się cięcie w linii środkowej, od tyłu do przodu, wzdłuż skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.
5. W czaszce wykonuje się serię 4 cięć w celu otwarcia czaszki: jedno cięcie obejmuje obie oczodoły przed opuszkami węchowymi, dwa kolejne cięcia znajdują się poniżej móżdżku i oddzielają sklepienie czaszki od podstawy czaszki, a ostatnie cięcie biegnie od tyłu do przodu wzdłuż szwu pośrodkowego.
6. Łuski czaszki są delikatnie odchylane, a mózg zostaje wyjęty i umieszczony w naczyniu sekcyjnym.
7. Pozostała część sekcji jest wykonywana pod stereomikroskopem. Najpierw odcina się opuszki węchowe od mózgu. Jeśli chcesz dodatkowo zbadać opuszki węchowe, wystarczy utrwalić je poprzez zanurzenie w 4% PFA przez noc, a następnie można je przygotować do krojenia i barwienia.
8. Podzielić mózg wzdłuż szczeliny między półkulami.
9. Następnie wykonuje się cięcie w płaszczyźnie czołowej w najbardziej tylnej części szczeliny między półkulami, co pozwala na uwidocznienie tylnej części hipokampa w przekroju poprzecznym.
10. Hipokamp, który w tej pozycji tworzy przyśrodniałą ścianę komory bocznej, musi zostać uwolniony z przykrywającej go kory, która tworzy grzbietowo-boczną ścianę komory. Najpierw nóż wprowadza się do małej przestrzeni komorowej między korą a hipokampem w części grzbietowej i wykonuje cięcie w korze w miejscu, gdzie zawija się ona brzusznie, oddalając się od linii środkowej, aby połączyć się z hipokampem. Po wykonaniu tego cięcia korę można powoli oddzielać od hipokampa, odsłaniając komorę boczną, przesuwając się od strony grzbietowej do brzusznej. Manewr ten jest ułatwiony przez odcięcie klina kory w narożniku, w którym hipokamp został uwolniony. Po dotarciu do najbardziej brzusznej części komory bocznej w tej pozycji, można zauważyć lub wyczuć miejsce, w którym kora ponownie zawija się, tym razem kierując się przyśrodkowo, aby połączyć się z hipokampem. W tym miejscu należy wykonać kolejne cięcie, aby całkowicie uwolnić hipokamp (przyśrodnią ścianę komory bocznej) od kory (bocznej ściany komory bocznej).
11. Wtedy łatwo będzie odciągnąć hipokamp od kory, w kierunku przyśrodkowym i przednim, aby szeroko otworzyć komorę boczną.
12. Kontynuować delikatne odciąganie hipokampa do przodu, wykonując krótkie ruchy pęsetą i nożem, aby rozsunąć ściany przyśrodnią i boczną.
13. Gdy opór przy tym odciąganiu zacznie rosnąć, konieczne są dodatkowe cięcia. Najpierw, aby zwiększyć widoczność komory bocznej, a w szczególności ściany bocznej i strefy podkomorowej (SVZ), należy odciąć korę. Korę oddziela się precyzyjnie, wizualizując granicę między ciałem modszałowym a strefą wentrykularną (VZ)/strefą podkomorową (SVZ). Należy po prostu ciąć wzdłuż tej granicy, pozostając po stronie ciała modszałowego, aby uniknąć uszkodzenia SVZ.
14. Aby kontynuować odsuwanie ściany przyśrodniej od bocznej, konieczne są dwa kolejne cięcia: jedno w części grzbietowej, gdzie ściana boczna, przyśrodnia i kora zbiegają się, oraz jedno w części brzusznej, gdzie zbiegają się ściana boczna, przyśrodnia i wzgórze. Po wykonaniu tych cięć dalsze delikatne odciąganie ściany przyśrodniej pozwala na otwarcie najbardziej przedniego odcinka komory bocznej.
15. Odpowiednie oświetlenie jest niezbędne przez cały proces, a zwłaszcza w następnym kroku, w którym ściany przyśrodnia i boczna są rozdzielane w części przedniej. W tej przedniej pozycji komory bocznej ściana przyśrodnia zawija się z powrotem i jest ciągiem ze ścianą boczną. Należy ustawić oświetlenie tak, aby cienie rzucane między obiema ścianami ujawniły ten punkt załamania, który wygląda jak dolina między ścianami. Należy przeciąć dokładnie w tej dolinie, aby rozdzielić obie ściany.
16. Na koniec całkowicie odsłonić ścianę boczną, usuwając wszelką nadwieszoną korę w części grzbietowej oraz wzgórze w części brzusznej.
17. Jeśli przygotowuje się preparaty całego organu do immunobarwienia, ostrożnie przenieść preparat stroną komory do góry z naczynia sekcyjnego do płytki 24-dołkowej wypełnionej 4% PFA z dodatkiem lub bez dodatku 0,1% Triton-X10 w celu fiksacji przez noc w temperaturze 4°C. W przypadku antygenów wrażliwych na fiksację, preparaty mogą być utrwalane przez krótszy czas. Następnie przejść do sekcji 4 dotyczącej immunobarwienia preparatów całego organu.
18. Jeśli przygotowuje się preparaty całego organu do analizy przepływu ependymalnego, przenieść preparat do czystego naczynia sekcyjnego wypełnionego świeżą pożywką Leibovitz o temperaturze 37°C i przejść do następnej sekcji.

III. Analiza przepływu ependymalnego z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrokulek

1. Unieruchom preparat całego organu na czystej szalce do sekcji za pomocą dwóch szpilek entomologicznych – jednej w wzgórzu i jednej w przednio-grzbietnym narożniku preparatu.
2. Umieść podstawę ramienia statywowego z mikromanipulatorem obok stereomikroskopu. Upewnij się, że wysokość regulowanego ramienia jest maksymalnie podniesiona, aby zapobiec złamaniu igły o szalkę do sekcji.
3. Ostrożnie zanurz końcówkę igły w medium w probówce typu Eppendorf, aby usunąć mikrokulki znajdujące się na zewnętrznej stronie końcówki igły. Jeśli nie zostaną one usunięte, mogą zostać przypadkowo naniesione na powierzchnię preparatu podczas pozycjonowania igły, co obniży ogólną jakość nagrania.
4. Ustaw końcówkę igły nad powierzchnią grzbietną ściany bocznej i opuść ramię, aby wprowadzić końcówkę igły do medium. Igłę należy opuszczać do momentu, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią ściany bocznej.
5. Po ustawieniu igły w odpowiedniej pozycji dostosuj powiększenie i ostrość stereomikroskopu, aby objąć pożądane pole widzenia. Jeśli planujesz nagrywanie przepływu ependymalnego, rozpocznij akwizycję obrazów w tym momencie.
6. Wtryśnij ~5 nl roztworu mikrokulek na powierzchnię preparatu. Gdy początkowa dawka kulek zostanie usunięta z powierzchni przez przepływ ependymalny, można przeprowadzić kolejne cykle wtryskiwania kulek.

IV. Immunobarwienie preparatów całych

1. Preparaty całych organów (wholemounts) wypreparowane do immunobarwienia utrwala się przez imersję przez noc w 4% PFA z dodatkiem lub bez dodatku 0,1% Triton-X100 w temperaturze 4°C. Stosowanie Triton-X100 jest preferowane dla antygenów tolerujących taką obróbkę, ale można z niego zrezygnować w przypadkach, gdy detergent obniża jakość barwienia.
2. Następnego dnia PFA odsysa się z płytki 24-dołkowej, a preparaty płucze się 3 razy przez 5 minut każdy w 0,1 M PBS z dodatkiem lub bez dodatku 0,1% Triton-X10. Podobnie jak wcześniej, stosowanie Triton-X10 jest preferowane, choć nie wymagane, podczas wszystkich etapów płukania w tym protokole. W całym protokole wymiana roztworów nad preparatami wymaga ostrożnego odsysania cieczy z boku dołka. Następnie dołek napełnia się roztworem za pomocą pipety transferowej pod kątem, tak aby roztwór spływał po ściance dołka, a nie bezpośrednio na preparat. Należy zadbać o to, aby strona komór właściwych preparatu była zawsze skierowana ku górze. Gwałtowne pipetowanie roztworów często powoduje odwrócenie preparatu. Zaleca się wymianę roztworów nad jednym preparatem naraz, aby zapobiec wysychaniu tkanki.
3. Po wypłukaniu PFA preparaty inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym, zawierającym 10% normalnego surowicy koziej lub osiołkowej w 0,1 M PBS z dodatkiem lub bez dodatku Triton-X10. W przypadku stosowania Triton-X10 podczas barwienia, można wybrać stężenie 2% lub 0,5% Triton-X10 w roztworze blokującym. Stosujemy 2% Triton-X100 przy barwieniu antygenów wymagających głębszej penetracji przeciwciał w głąb tkanki, np. antygenów zlokalizowanych w SVZ. Jednak przy barwieniu antygenów położonych bliżej powierzchni ściany bocznej, np. antygenów znajdujących się na powierzchni apikalnej komórek ependymalnych, stosujemy 0,5% Triton-X10. Ponadto można zrezygnować z Triton-X10 w przypadku antygenów powierzchniowych komórek lub innych antygenów, które są usuwane lub modyfikowane przez detergenty.
4. Następnie należy usunąć roztwór blokujący, dodać przeciwciała pierwotne rozcieńczone w tym samym roztworze blokującym i inkubować przez 24 lub 48 godzin w temperaturze 4°C. Wybór czasu inkubacji zależy od antygenu, podobnie jak wybór między 0,5% a 2% Triton. Dla antygenów zlokalizowanych na powierzchni preparatu wystarczy 24-godzinna inkubacja. Jednak dla antygenów położonych głębiej, np. w SVZ, lepsze wyniki zapewnia inkubacja przez 48 godzin.
   Na przykład, aby zbadać powierzchnię apikalną i ciałka podstawne komórek wyścielających ścianę komory bocznej, barwi się przeciwciałami przeciwko β-catenin, aby znakować błonę komórkową, oraz przeciwko γ-tubulin, aby znakować ciałka podstawne. Przeciwciała mysie anty-β-catenin (1:50) i królicze anty-γ-tubulin (1:10) rozcieńcza się w 0,1 M PBS zawierającym 10% normalnej surowicy koziej i 0,5% Triton-X10. Inkubować w temperaturze 4°C przez 24 godziny.
   Aby zabarwić dorosłe neuralne komórki macierzyste, czyli komórki typu B1, ścianę boczną barwi się przeciwciałem anty-GFAP. Przeciwciała mysie anty-GFAP (1:50) rozcieńcza się w 0,1 M PBS zawierającym 10% normalnej surowicy koziej i 2% Triton-X100. Inkubować w temperaturze 4°C przez 48 godzin.
5. Przeciwciała pierwotne wypłukuje się początkowo poprzez dwa szybkie płukania w PBS z dodatkiem lub bez dodatku 0,1% Triton-X100. Następnie wykonuje się 3 dodatkowe płukania, każde po 20 minut w temperaturze pokojowej.
6. Przeciwciała wtórne rozcieńcza się w tym samym roztworze blokującym, który stosowano dla przeciwciał pierwotnych, i dodaje do preparatów, inkubując przez ten sam czas co w przypadku przeciwciał pierwotnych, w temperaturze 4°C.
   Na przykład, w przypadku barwienia na β-catenin i γ-tubulin: przeciwciała kozie anty-mysie Alexa Fluor 48 (1:40, rozpoznające mysie anty-β-catenin) oraz przeciwciała kozie anty-królicze Alexa Fluor 594 (1:40, rozpoznające królicze anty-γ-tubulin) rozcieńcza się w 0,1 M PBS zawierającym 10% normalnej surowicy koziej i 0,5% Triton-X10. Inkubować w temperaturze 4°C przez 24 godziny.
   W przypadku immunobarwienia GFAP: przeciwciała kozie anty-mysie Alexa Fluor 48 (1:400, rozpoznające mysie anty-GFAP) rozcieńcza się w 0,1 M PBS zawierającym 10% normalnej surowicy koziej i 2% Triton-X10. Inkubować w temperaturze 4°C przez 48 godzin.
7. Przeciwciała wtórne wypłukuje się z preparatów, stosując te same etapy płukania, co w przypadku przeciwciał pierwotnych.
8. W razie potrzeby na tym etapie można przeprowadzić przeciwbarwienie jąder komórkowych poprzez inkubację w DAPI rozcieńczonym w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie jednokrotne wypłukanie w PBS.

V. Montowanie immunobarwionych preparatów całych organów na szkiełkach do mikroskopii konfokalnej

1. W celu uzyskania obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości, po przeprowadzeniu immunobarwienia preparaty całych organów (wholemounts) wymagają dalszej mikrodysekcji, aby zachować jedynie ścianę boczną komory bocznej w postaci cienkiego pasma tkanki o grubości 20-30 µm. Oddzielenie ściany bocznej od leżącego pod nią prążkowia umożliwia zamontowanie jej na szkiełku i przykrycie szkiełkiem nakrywką w sposób płaski.
2. Powróć do stereomikroskopu z immunobarwionymi preparatami oraz następującymi narzędziami i sprzętem: gładką pęsetą precyzyjną, mikrochirurgicznym nożem do nakłuwania Sharpoint 22,5°, naczyniem do dysekcji, szkiełkami przedmiotowymi i nakrywkami, 0,1 M PBS oraz medium montażowym Aquamount.
3. Przenieś preparat z płytki 24-dołkowej do naczynia do dysekcji zawierającego 0,1 M PBS, uważając, aby strona komory była skierowana do góry.
4. Najpierw całkowicie usuń korę grzbietową preparatu, prowadząc cięcie od strony tylnej do przedniej, precyzyjnie wzdłuż linii, w której ciało kaloryczne styka się ze ścianą boczną. Jest to rozpoznawalna granica między białą substancją ciała kalorycznego a różowo przebarwioną strefą podkomorową (SVZ).
5. Następnie wykonaj długie cięcie w orientacji poziomej przez brzuszną stronę preparatu. Powstała powierzchnia cięcia posłuży jako podstawa, na której można ustabilizować preparat podczas następnego etapu dysekcji.
6. Przy powierzchni grzbietowej preparatu skierowanej do góry będziesz w stanie zwizualizować grubość SVZ od strony przedniej do tylnej wzdłuż ściany bocznej. Należy zauważyć, że taki widok jest możliwy dzięki wcześniejszemu usunięciu kory, co pozwoliło odsłonić leżący pod nią prążkowie i SVZ. SVZ identyfikuje się jako cienki pas tkanki rozciągający się od powierzchni komory do prążkowia. SVZ ma jednolity różowy wygląd, podczas gdy prążkowie jest infiltrowane przez pasma białej substancji. Zauważ, że SVZ jest grubsza z przodu i stopniowo cieńsza w stronę tyłu.
7. Po zidentyfikowaniu granicy między SVZ a prążkowiem, ostrożnie rozpocznij cięcie na tej granicy w najbardziej przedniej części ściany bocznej, prowadząc nóż od strony grzbietowej do brzusznej. Aby zrobić to precyzyjnie, ustabilizuj preparat pęsetą, używając jej jak dwóch pinów. Możesz również użyć pęsety do lekkiego obrócenia preparatu, aby widzieć ostrze przesuwające się od strony grzbietowej do brzusznej przez ścianę boczną. Kluczowym elementem tej dysekcji jest uzyskanie bardzo płaskiego pasma tkanki. Oznacza to, że podczas odcinania SVZ od przedniej do tylnej części ściany bocznej, orientacja cięć musi być w każdym momencie równoległa do powierzchni komory.
8. Pamiętaj, że w częściach tylnych SVZ staje się cieńsza. Zamiast dążyć do odcięcia wyłącznie SVZ w tym miejscu, ważne jest, aby podczas przesuwania się ku tyłowi grubość wycinanej tkanki pozostawała taka sama. Zapewni to, że uzyskane pasmo tkanki, które zostanie następnie zamontowane, będzie płaskie.
9. Po całkowitym oddzieleniu ściany bocznej od leżącego pod nią prążkowia, ostrożnie usuń z tego pasma wszystkie inne otaczające tkanki, które nie są częścią ściany komory.
10. Następnie podnieś ten pasek tkanki od dołu za pomocą pęsety i umieść go w centrum szkiełka przedmiotowego. Nanieś kilka kropel Aquamount bezpośrednio na preparat i delikatnie nałóż na to wycentrowaną nakrywkę, starając się nie wprowadzić pęcherzyków powietrza na powierzchnię tkanki. Ciężar szkiełka zapewni równomierne rozprowadzenie Aquamount i spowoduje dokładne spłaszczenie powierzchni ściany bocznej. Ilość użytego Aquamount i rozmiar nakrywki zależą od wieku dysekcyjnej tkanki. W przypadku tkanek embrionalnych i wczesnopostnatalnych zalecamy 1 kroplę Aquamount i nakrywkę 2" x 30". Cięższe nakrywki mogą zniekształcić tkankę, a nadmiar Aquamount pogorszy jakość obrazowania, ponieważ lasery konfokalne będą miały mniejszą zdolność penetracji cienkiej warstwy medium znajdującej się między nakrywką a powierzchnią tkanki. W przypadku tkanek późnopostnatalnych i dorosłych stosujemy 4 krople Aquamount i nakrywkę 24" x 60".
11. Szkiełka przechowuje się następnie w pozycji płaskiej w albumie na szkiełka w temperaturze 4°C przez 1-2 dni przed obrazowaniem, aby nakrywki mogły się ustabilizować.

Reprezentatywne wyniki

Metody analizy całych preparatów (wholemount) dostarczyły kilku kluczowych informacji na temat aktywności zarodkowej dorosłej SVZ. Sieć łańcuchów migrujących młodych neuronów w SVZ zaobserwowano po raz pierwszy po immunobarwieniu całych preparatów ściany bocznej komory bocznej przeciwko polisjalilowanej cząsteczce adhezyjnej komórek neuronalnych (PSA-NCAM) ¹. Łańcuchy migrujących neuroblastów można również dostrzec po immunobarwieniu całych preparatów przeciwciałami przeciwko doublecortynie (Rysunek 1). Co niezwykłe, sieć łańcuchów wykazuje stereotypowy wzorzec, z dwoma głównymi strumieniami komórek: jednym biegnącym grzbietowo nad punktem adhezyjnym i drugim biegnącym brzusznie wokół niego. Całe preparaty SVZ zapewniają również kompleksowy wgląd w aktywność proliferacyjną prekursorów w tym regionie, co przedstawiono na barwieniu Ki67 na Rysunku 2. Co ciekawe, dwie niedawne prace sugerują bliską interakcję między dzielącymi się komórkami SVZ a lokalną siecią naczyniową ^2,3 (Rysunek 2).

Podczas badania za pomocą konfokalnej mikroskopii o wysokim powiększeniu, widok en-face uzyskany z preparatów całych tkanek (wholemounts) umożliwia unikalną perspektywę powierzchni apikalnej komórek wyścielających układ komorowy. Ta perspektywa en-face ujawniła ostatnio, że komórki typu B1 SVZ, będące dorosłymi neuralnymi komórkami macierzystymi, stanowią część mieszanego neuroepithelium wraz z niedzielącymi się, zróżnicowanymi komórkami ependymnymi ⁴. Powierzchnia apikalna komórek typu B1 styka się z komorą boczną i jest otoczona dużymi powierzchniami apikalnymi komórek ependymnych w konfiguracji przypominającej koło szprychowe (Rysunek 3, strzałki wskazują powierzchnie apikalne B1). Ponadto szczegółowa analiza powierzchni apikalnej komórek ependymnych wykazała, że pozycja translacyjna i orientacja rotacyjna ich ciał podstawowych są wskaźnikami ich polarności planarnej ⁵. Ciała podstawowe komórek ependymnych są zgrupowane w obszarze na powierzchni apikalnej. Obszar ten jest przesunięty z centrum powierzchni apikalnej w kierunku „z prądem” względem przepływu CSF (polarność translacyjna); w obrębie tego obszaru każde ciało podstawowe jest obrócone wokół swojej osi długiej w taki sposób, że stopka podstawowa, element pomocniczy ciała podstawowego, skierowana jest w kierunku przepływu (polarność rotacyjna). Sąsiednie komórki ependymne mają swoje ciała podstawowe zorientowane w tym samym kierunku. Co istotne, wideomikrografie z testu przepływu ependymalnego mogą być wykorzystane do bezpośredniego porównania przepływu w konkretnym regionie ściany bocznej z orientacją ciał podstawowych komórek ependymnych w tym regionie (Rysunek 4).

Oprócz zapewnienia panoramicznego spojrzenia na największy region zarodkowy w dorosłym mózgu, obrazowanie przy większym powiększeniu w preparatach całych tkanek (wholemounts) pozwala na bardziej kompletną i szczegółową analizę poszczególnych morfologii komórkowych w SVZ. Obrazowanie konfokalne przy dużym powiększeniu immunobarwienia GFAP w preparatach całych tkanek ujawniło, że komórki typu B1, oprócz krótkiego wypustka apikalnego kontaktującego się z komorą, posiadają długi wypustek bazalny w kontakcie z naczyniami krwionośnymi (Rysunek 5) ⁴. Taka cytoarchitektura nie była wcześniej dostrzegana w przekrojach czołowych, ponieważ wypustek bazalny przebiega głównie równolegle do ściany komory. Seryjne cięcie powoduje zatem podzielenie poszczególnych komórek na małe fragmenty, co sprawia, że niemal niemożliwa jest rekonstrukcja pełnej morfologii komórki lub zrozumienie jej relacji z innymi typami komórek w SVZ. Podejście z wykorzystaniem preparatów całych tkanek ma kilka zalet w porównaniu z klasycznymi technikami sekcjonowania, zarówno w zakresie zapewnienia widoków panoramicznych przy mikroskopii o małym powiększeniu, jak i pełnej perspektywy poszczególnych komórek przy mikroskopii o dużym powiększeniu. Technika ta pozostanie istotnym uzupełnieniem przyszłych badań nad tą strefą zarodkową dorosłego mózgu.

Rysunek 1. Sieć migrujących łańcuchów neuronalnych w SVZ. Zestawione obrazy konfokalne przedstawiają rekonstrukcję preparatu całego fragmentu ściany bocznej, barwionego przeciwciałami przeciwko doublecortynie, która znakuje migrujące neuroblasty w obrębie SVZ. Wyróżnia się dwa główne strumienie migracji: jeden przebiegający grzbietowo nad punktem przylegania i drugi przebiegający brzusznie wokół punktu przylegania, oznaczonego gwiazdką (*). Strzałki wskazują kierunki przedni (a) i grzbietowy (d). Pasek skali = 1 mm.

Rysunek 2. Związek między układem naczyniowym a dzielącymi się komórkami w SVZ. Ten preparat całego fragmentu ściany bocznej poddano immunobarwieniu przeciwciałami przeciwko Ki67 w celu znakowania dzielących się komórek kolorem zielonym oraz przeciwciałami przeciwko immunoglobulinom mysim w celu znakowania naczyń krwionośnych kolorem czerwonym. Ponieważ przed barwieniem preparat nie został przepłukany solą fizjologiczną, endogenne cząsteczki IgG mysich pozostały wewnątrz naczyń krwionośnych i zostały zabarwione przez wtórne przeciwciała anty-mysie. Niedawne prace sugerują, że dzielące się prekursory SVZ (zielone) znajdują się w bliskim sąsiedztwie naczyń krwionośnych (czerwone) {Shen, 208 #6523}{Tavazoie, 208 #652}. Strzałki wskazują kierunek przedni (a) i grzbietowy (d). Pasek skali = 1 mm.

Rysunek 3. Powierzchnia apikalna komórek kontaktujących się z komorą na ścianie bocznej. Obraz konfokalne o dużym powiększeniu preparatu całego organu poddanego immunobarwieniu na β-kateninę (aby znakować błony komórkowe na zielono) oraz γ-tubulinę (aby znakować ciałka podstawne na czerwono) ujawnia planarną organizację tych komórek nabłonkowych. Komórki typu B1, czyli dorosłe neuralne komórki macierzyste, posiadają niewielką powierzchnię apikalną z pojedynczym ciałkiem podstawnym, wskazanym strzałkami. Powierzchnia apikalna tych komórek jest otoczona przez duże powierzchnie apikalne komórek ependymalnych w konfiguracji przypominającej młynowe koło. Komórki ependymalne wykazują polarność planarną, co przejawia się położeniem ich wielu ciałek podstawnych na powierzchni apikalnej. Sąsiednie komórki ependymalne mają skupiska ciałek podstawnych zlokalizowane po tej samej stronie powierzchni apikalnej (w tym obszarze w dół i w lewo), co odpowiada kierunkowi przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego {Mirzadeh, 2010 #6573}. Pasek skali = 10 μm.

Rysunek 4. Test przepływu ependymalnego. Obraz kompozytowy stworzony poprzez połączenie 10 następujących po sobie klatek z filmu nagranego podczas testu przepływu ependymalnego. Fluorescencyjne mikrokulki naniesione grzbietowo i tylnie względem obszaru adhezji były przemieszczane przez rzęski komórek ependymalnych w dwóch zorientowanych strumieniach – jeden nad i jeden pod obszarem adhezji – w kierunku otworu Monro. Ten zorientowany przepływ ujawnia funkcjonalną polarność płaską komórek ependymalnych. Każda linia przepływu przedstawia pozycję pojedynczej kulki w kolejnych punktach czasowych. Pasek skali = 0,5 mm.

Rycina 5. Komórki typu B1 GFAP+ posiadają długie włókno bazalne z zakończeniami stóp na naczyniach krwionośnych. Maksymalna projekcja stosu obrazów konfokalnych o dużym powiększeniu, wykonana z preparatu całego fragmentu ściany bocznej poddanego immunobarwieniu przeciwciałami GFAP w celu znakowania astrocytów SVZ. Barwienie to znakuje dorosłe komórki macierzyste neuronów, czyli komórki typu B1, które posiadają zakończenie apikalne na powierzchni komorowej oraz, jak pokazano tutaj, długie włókno bazalne GFAP+ kończące się na naczyniach krwionośnych (strzałki). Naczynia krwionośne są tutaj zabarwione, ponieważ przeciwciało wtórne użyte do wizualizacji mysich przeciwciał anty-GFAP rozpoznaje endogenne IgG mysie w obrębie naczyń. Pasek skali = 50 μm.

Dyskusja

Większość badań nad neurogenezą w strefach komorowej i podkomorowej opierała się na klasycznych technikach sekcjonowania w celu zbadania mikroanatomii i relacji komórkowych w tych obszarach. Opisujemy tutaj alternatywną technikę, po raz pierwszy zastosowaną do analizy sieci łańcuchów migrujących neuroblastów generowanych w SVZ ¹, następnie wykorzystaną do badania regeneracji populacji progenitorów SVZ po leczeniu antymitotycznym ⁶, a ostatnio użytą do badania precyzyjnych apikalnych i bazalnych oddziaływań międzykomórkowych dorosłych komórek macierzystych SVZ ^2,3,4. Co ciekawe, technika ta ujawniła, że komórki macierzyste, czyli komórki typu B1, w dorosłej SVZ są częścią mieszanego neuroepithelium wraz z zróżnicowanymi, niedzielącymi się komórkami ependymalnymi. Obrazowanie en-face z wykorzystaniem preparatów całych organów (wholemounts) wykazało, że to mieszane neuroepithelium posiada architekturę przypominającą wiatraczek, składającą się z zakończeń apikalnych komórek typu B1 otoczonych dużymi powierzchniami apikalnymi komórek ependymalnych ⁴. Ta analiza en-face wyjaśniła nasze rozumienie linii komórek macierzystych w mózgach embrionalnych i dorosłych jako składającej się z komórek z zakończeniami apikalnymi na powierzchni komory i wypustkami bazalnymi kontaktującymi się z niszą naczyniową. Osiągnięcie tych wyników byłoby niemal niemożliwe przy użyciu klasycznych technik sekcjonowania. Preparaty całych organów ułatwiają również identyfikację komórek macierzystych poprzez ich kontaktującą z komorą wypustkę apikalną. W miarę odkrywania bardziej specyficznych markerów dla tych komórek macierzystych, technika wholemount stanie się integralną częścią identyfikacji i analizy zachowania komórek macierzystych układu nerwowego.

Preparaty całych tkanek (wholemounts) ścian komór bocznych zapewniają również idealną perspektywę do badania polarności planarnej komórek ependymalnych. Komórki ependymalne to wielorzęskowe komórki wyścielające komory, których funkcją jest koordynowane przemieszczanie płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Dzięki technice wholemount cały nabłonek ependymalny jest wyeksponowany en-face, co pozwala na jego kompleksowe barwienie i badanie od granic przednich do tylnych oraz od grzbietowych do brzusznych. Co więcej, testy przepływu ependymalnego przeprowadzone na świeżo wypreparowanych, żywych preparatach wholemount wyraźnie wykazują polarny planarny przepływ generowany przez rzęski ependymalne. Niedawne prace z wykorzystaniem podejścia wholemount ujawniły komórkowe determinanty tej planarnej polarności ependymalnej ⁵. Co ciekawe, badania wholemount sugerują również, że generowany przez komórki ependymalne przepływ CSF tworzy gradienty chemorepellentów, które kierują migracją młodych neuronów w strefie podkomorowej (SVZ) ⁷. Podejścia wholemount, które początkowo pozwoliły zidentyfikować sieć migrujących łańcuchów neuronalnych, w dalszym ciągu dostarczają wiedzy na temat mechanizmów regulujących migrację łańcuchową.

Analiza VZ i SVZ za pomocą obrazowania preparatów całych (wholemount imaging) wprowadza nowe podejście do przyszłych badań oraz sposób na doprecyzowanie rozumienia wyników dotychczasowych analiz. Na przykład niedawne badanie sugerowało, że komórkami macierzystymi neuronów w dorosłym SVZ są komórki CD133+/CD24- stykające się z komorą ⁸. Na podstawie barwień immunohistochemicznych w przekrojach, autorzy ci stwierdzili, że komórki te stanowią subpopulację wielorzęskowych komórek ependymalnych. Jednak w naszym badaniu z wykorzystaniem podejścia wholemount, które zapewnia bardziej kompleksowy wgląd w cały nabłonek ependymalny, stwierdziliśmy, że wszystkie komórki ependymalne wykazują ekspresję CD24, a jedynymi komórkami stykającymi się z komorą, które były CD133+/CD24-, był podzbiór komórek typu B1 ⁴. Co więcej, technika wholemount rokuje użyteczność w przyszłych badaniach nad niedawno opisaną mozaikową organizacją komórek macierzystych neuronów w dorosłym mózgu ⁹. Kilka badań wykazało, że komórki macierzyste neuronów w dorosłym mózgu nie są populacją jednorodną, lecz są specyficzne regionalnie i zazwyczaj wytwarzają jedynie konkretne podtypy interneuronów opuszki węchowej. W badaniach tych zasugerowano, że różne subpopulacje komórek macierzystych neuronów można rozróżnić albo na podstawie ekspresji specyficznych czynników transkrypcyjnych ^{10,11,12,13,14}, a w inny sposób na podstawie ich regionalizacji wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej i przednio-tylnej ściany bocznej ^9,15,16. W miarę identyfikacji kolejnych markerów molekularnych regionalnie specyficznych subpopulacji dorosłych komórek macierzystych neuronów, obrazowanie wholemount powinno zapewnić kompleksowy wgląd w podział tych różnych domen progenitorowych wzdłuż ściany komory.

Przedstawione tutaj techniki sekcji całego preparatu oraz obrazowania mogą być również wykorzystane do analizy ścian komór w zarodku. Sekcję bocznej ściany zarodkowej przeprowadza się krok po kroku w ten sam sposób. Występują jedynie niewielkie różnice w poziomie trudności; komory zarodkowe są względnie większe, co ułatwia sekcję, jednak tkanka jest bardziej miękka, co utrudnia manipulację. W szczególności, podobną ekspozycję komory bocznej można zastosować u zarodków, aby wypreparować ścianę korową komory w celu badania neurogenezy korowej. Niedawne dowody sugerują, że asymetryczne dziedziczenie centrosomów utrzymuje glej promienisty na powierzchni komorowej podczas neurogenezy korowej ¹⁷. Obrazowanie en-face powierzchni apikalnych gleju promieniściego może dostarczyć informacji o tym, w jaki sposób centrosomy w tych dzielących się komórkach są dziedziczone asymetrycznie.

Jak w przypadku większości technik, zwłaszcza tych wymagających precyzji manualnej, opanowanie metody wymaga praktyki. Istnieje jednak kilka elementów sekcji, które są kluczowe dla uzyskania lepszych wyników: 1) oświetlenie – regulacja oświetlenia próbki w celu stworzenia cieni zapewnia nieoceniony kontrast podczas sekcji tkanek, które w przeciwnym razie są stosunkowo jednorodne, 2) używanie pęsety jak dwóch szpilek entomologicznych – w tej technice pęsety nigdy nie służą do ściskania lub podnoszenia tkanki, lecz są wykorzystywane jako ruchome szpilki, które można stale repositionować w celu stabilizacji tkanki podczas cięcia, 3) równowaga między delikatną retrakcją a cięciem – nóż powinien służyć nie tylko do przecinania, ale także do delikatnej retrakcji w celu rozdzielenia ścian przyśrodkowej i bocznej, pamiętając, że większość tej sekcji jest w rzeczywistości wykonywana poprzez delikatną retrakcję, a cięcia są jedynie przerywane.