Artykuł metodologiczny

Przygotowywanie cienkich przekrojów z preparatów slice do immunohistochemii

DOI:

10.3791/194

28 kwietnia 2007

W tym artykule

Podsumowanie

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda umożliwia powtarzalne wykonywanie seryjnych cięć w kriosztacie z małych, trudnych w obsłudze fragmentów tkanek, takich jak biopsjaty i skrawki mózgu. Wykorzystujemy prosty aluminiowy blok mrożący, aby ułatwić manipulację tkanką, oraz standardowy kriosztat do rutynowego przygotowywania seryjnych przekrojów o grubości 5-10 micron z fragmentów mózgu o grubości 400 micron.

Streszczenie

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Wiele badań w dziedzinie neuronauki, jak i w innych dyscyplinach, wiąże się z analizą niewielkich, lecz makroskopowych fragmentów lub przekrojów tkanek, które zostały utrwalone, pobrane na świeżo lub wycięte, lecz utrzymane przy życiu, jak ma to miejsce w preparatach skrawków tkanki mózgowej. Późniejsze badania mikroskopowe tego materiału mogą być problematyczne ze względu na trudności w manipulowaniu próbkami tkanki. Przedstawiona tutaj metoda pozwala na uzyskanie cienkich cięć tkanki za pomocą kriotomu, o grubości wynoszącej od 0,2 do 5,0 mm. Standardowo wykonujemy seryjne cięcia koronalne o grubości 5–10 mikronów z plastrów mózgu o grubości 400 mikronów, wyciętych za pomocą wibratomu. Plastry te są zazwyczaj najpierw wykorzystywane w eksperymentach elektrofizjologicznych, a następnie wymagają analizy mikroskopowej cytoarchitektoniki regionu, z którego uzyskano zapisy. Skonstruowaliśmy proste urządzenie, które umożliwia kontrolowane i powtarzalne przygotowanie oraz pozycjonowanie skrawka tkanki. Urządzenie to składa się z cylindra o długości 5 cm i średnicy 1,2 cm, który służy jako podłoże do zamrażania skrawka. Pierścień ciasno nasuwa się na cylinder, tworząc ścianki wokół skrawka, co pozwala na zanurzenie tkanki w środku do zamrażania (np. OCT). Następnie próbka jest szybko zamrażana za pomocą kruszonego suchego lodu, a powstały dysk można łatwo ustawić do cięcia w kriotomie. Cienkie skrawki można zamontować na powlekłych szkiełkach przedmiotowych poprzez rozmrażanie, co umożliwia przeprowadzenie dalszych badań, takich jak różne metody barwienia, hybrydyzacja in situ lub immunohistochemia, co zostało tutaj zademonstrowane.

Protokół

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Przygotować formę z taśmy dla platformy OCT.
  2. Wypełnić formę związkiem OCT. Zamrozić w kriostacie lub przy użyciu kruszonego suchego lodu.
  3. Usunąć taśmę z wokół zamrożonej platformy OCT.
  4. Wyrównać oznaczenia na uchwycie mrożącym i stole montażowym kriostatu, a następnie zablokować w uchwycie.
  5. Przeciąć platformę OCT aż do uzyskania płaskiej powierzchni.
  6. Wyjąć wyrównaną platformę OCT i umieścić ją na stole mrożącym kriostatu.
  7. Umieścić próbkę tkanki (wcześniej krio konserwowaną w 30% glicerolu lub sacharozie w PBS) w OCT.
  8. Przygotować kolumnę mrożącą z zewnętrznym pierścieniem wystającym około 5 mm ponad górną krawędź kolumny, tworząc wgłębienie dla OCT.
  9. Ostrożnie umieścić próbkę tkanki w centrum powierzchni kolumny mrożącej i powoli dodawać OCT, aż wgłębienie zostanie wypełnione.
  10. Otoczyć kolumnę mrożącą kruszonym suchym lodem. Tkanka i OCT powinny całkowicie zamarznąć w ciągu 20-60 sekund.
  11. W miarę wzrostu temperatury preparatu, zewnętrzny pierścień można usunąć, podczas gdy próbka pozostaje zamrożona.
  12. Zsunąć próbkę z kolumny mrożącej bokiem i umieścić w kriostacie.
  13. Nanieść kroplę OCT na powierzchnię platformy OCT i umieścić preparat (tkanką do dołu), wywierając silny nacisk. Preparat szybko zamarznie na platformie OCT.
  14. Zabezpieczyć uchwyt na stole montażowym kriostatu z wyrównanymi oznaczeniami.
  15. Przeciąć warstwę OCT znajdującą się nad preparatem tkankowym.
  16. Przenieść cienkie przekroje metodą thaw-mount na szkiełka przedmiotowe i przechowywać w stanie zamrożonym lub w temperaturze pokojowej.
  17. Reakcje immunochemiczne można przeprowadzać dla tkanek zamontowanych na szkiełkach przedmiotowych.
  18. Odczyn zostaje naniesiony na szkiełko, można go delikatnie mieszać, a w przypadku substancji światłoczułych – przykryć.
  19. Kolejne etapy reakcji wykonuje się łatwo poprzez odwrócenie szkiełka nad pojemnikiem na odpady, osuszenie krawędzi szkiełka i naniesienie kolejnego odczynnika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół dostarcza badaczom zwięzłego i łatwego do naśladowania opisu sposobu uzyskiwania cienkich przekrojów kriostatowych z małych, trudnych do manipulacji fragmentów tkanek, takich jak biopsje i plastry mózgu, do dalszych badań, m.in. za pomocą różnych metod barwienia, hybrydyzacji in situ lub immunohistochemii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
O. C. T.Ted Pella, Inc.27050
Roztwór glicerolu30% roztwór glicerolu w PBS w/v
Roztwór sacharozy30% roztwór sacharozy w PBS w/v

Bibliografia

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
  2. Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kriosekcjonowanieprzygotowanie skrawk w tkankizatapianie w OCTskrawki m zgu wykonywane w wibratomiebarwienie immunohistochemicznest monta owy kriostatuurz dzenie do mro enia w kolumniemro enie suchym lodemmontowanie na szkie kach przedmiotowych

Powiązane artykuły