Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowania, który jest wykorzystywany do określania potencjału metastatycznego ludzkich linii komórkowych raka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test eksperymentalny przerzutowania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przerzuty są główną przyczyną zgonów u pacjentów z nowotworami. Aby zrozumieć mechanizm przerzutowania, opracowano eksperymentalny test przerzutów z wykorzystaniem myszy z niedoborem odporności. Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedury stosowane w tym teście, w tym przygotowanie próbek, wstrzyknięcia dożylne oraz hodowlę komórek pochodzących z przerzutów do płuc. W skrócie, przygotowano wcześniej określoną liczbę ludzkich komórek nowotworowychin vitroa następnie wstrzyknięte bezpośrednio do krwiobiegu myszy z niedoborem odporności poprzez żyły ogonowe. Niewielka liczba komórek przeżywa turbulencje w krwiobiegu i rozwija się jako przerzuty w narządach wewnętrznych, takich jak płuca. Po określonym czasie myszy poddano sekcji. Rozmieszczenie przerzutów w tkankach określono pod mikroskopem stereoskopowym. Policzono liczbę przerzutów w konkretnej tkance, co bezpośrednio koreluje ze zdolnością do przerzutowania wstrzykniętych komórek nowotworowych. Powstałe przerzuty wyizolowano i poddano hodowliin vitrolinie komórkowe, które po ponownym wstrzyknięciu myszom z niedoborem odporności często wykazują większe zdolności metastatyczne niż linia rodzicielska. Te wysoce metastatyczne pochodne stają się użytecznymi narzędziami do identyfikacji genów lub szlaków molekularnych regulujących progresję przerzutowania.
Protokół
1. Przygotowanie próbek
- Hodować komórki do osiągnięcia ok. 70% konfluencji w dedykowanym medium z czynnikami wzrostu lub FBS (np. DMEM z 10% FBS dla komórek MC-1). Odessać medium z płytki i delikatnie przemyć kilkukrotnie 1 x PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,15 g/L Na2HPO4.7H2O, 0,2 g/L KH2PO4, pH 7,3).
- Odessać PBS i dodać 2 mL 0,05% trypsyny w versenie (0,014 g/L czerwieni fenolowej i 0,2 g/L EDTA-Na w 1 x PBS, pH 7,2). Delikatnie kołysać płytką, aby ułatwić odrywanie się komórek od podłoża. Obserwować komórki pod mikroskopem. Odrywanie się komórek trwa zazwyczaj od 2 do 5 minut.
- Dodać odpowiednią objętość medium zawierającego FBS (lub inhibitor trypsyny z soi), aby zahamować aktywność trypsyny, a następnie zebrać komórki do probówki Falcon 50 mL. Policzyć komórki za pomocą hemacytometru. Nanieść 10 μL zawiesiny komórkowej na czysty hemacytometr. Liczba komórek na mL jest równa średniej liczbie komórek w każdym z pięciu pól pomnożonej przez 104.
- Wirować komórki z prędkością 1000 RPM (lub ok. 200 xg) w wirówce laboratoryjnej przez 3 minuty.
- Ostrożnie usunąć medium, nie naruszając osadu komórkowego. Resuspender komórki w odpowiedniej objętości zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby uzyskać końcowe stężenie ok. 5 x 106 komórek/mL.
- Przefiltrować komórki przez sitko komórkowe Falcon 70 μm w celu usunięcia dużych agregatów komórkowych. Umieścić końcówkę pipety bezpośrednio na filtrze nad oznakowaną probówką hodowlaną Falcon 5 mL. Szybko wypchnąć zawiesinę przez filtr do probówki hodowlanej.
- Ponownie policzyć komórki za pomocą hemacytometru i rozcieńczyć je do końcowego stężenia 2,5 x 106/mL. Przechowywać komórki w lodzie.
- Określić żywotność komórek. Wymieszać część komórek z błękitem trypanu i za pomocą hemacytometru zmierzyć procent martwych (niebieskich) komórek w stosunku do całkowitej liczby komórek. Żywotność komórek przed iniekcją powinna wynosić ≥ 90%.
2. Iniekcja dożylna
- Zmień rękawiczki. Delikatnie chwyć ogon myszy z niedoborem odporności (nude, NOD-SCID lub NSG, Jackson's Laboratory) i wsuń ją do restrainera dla myszy, tak aby grzbiet przylegał do szczeliny, a ogon wystawał przez mały otwór z tyłu urządzenia.
- Powoli przesuń pierścień do wewnątrz wzdłuż szczeliny i zablokuj go w miejscu, gdy pierścień obejmie pysk myszy. Mysz nie powinna móc poruszać się swobodnie, ale powinna mieć prawidłową częstotliwość oddechów.
- Zlokalizuj główne żyły ogonowe. W ogonie myszy znajdują się cztery główne naczynia krwionośne. Naczynia na stronie grzbietowej i brzusznej ogona to tętnice. Żyły znajdują się po bokach ogona.
- Naciągnij do strzykawki 1 mL ponad 200 μL przygotowanych komórek. Przymocuj igłę 30 G 1/2 cala i wypchnij wszelkie pęcherzyki powietrza. Końcowa objętość komórek w strzykawce powinna wynosić 200 μL (tj. łącznie 5 x 105 komórek).
- Wstrzyknij komórki do żyły ogonowej.
- Zacznij od dystalnego końca ogona, aby w przypadku niepowodzenia pierwszej próby móc wykorzystać bardziej proksymalny region ogona do drugiej próby.
- Przetrzyj ogon 70% etanolem. Naciągnij ogon prosto. Przytrzymaj koniec ogona kciukiem, a miejsce wstrzyknięcia podeprzyj palcem wskazującym.
- Wprowadź igłę do żyły i wstrzyknij komórki. Upewnij się, że igła i strzykawka są równolegle do żyły podczas iniekcji, w przeciwnym razie igła przebije ścianę naczynia i wstrzyknie komórki do sąsiednich tkanek ogona.
- Wyjmij igłę po wstrzyknięciu. Jeśli iniekcja przebiegła pomyślnie, z miejsca wkłucia powinna wypłynąć krew. Przyciśnij czysty kawałek ręcznika papierowego lub patyczek bawełniany do miejsca wstrzyknięcia, aby ułatwić krzepnięcie, a następnie masuj ogon w górę, aby wprowadzić resztki próbki z żyły do krwiobiegu.
- Zwolnij mysz z restrainera i przenieś ją z powrotem do klatki. Zapisz proces iniekcji (np. ile prób zajęło wstrzyknięcie komórek i jaka ilość komórek została podana) w zeszycie laboratoryjnym.
- Określ żywotność komórek po iniekcji, zgodnie z opisem w sekcji Przygotowanie próbek, krok 9. Krok ten daje pewność, że komórki pozostają żywe podczas całego procesu wstrzykiwania. Pod koniec eksperymentu iniekcyjnego żywotność komórek spadnie, ale powinna wynosić powyżej 80%.
- (opcjonalnie) Odwiruj pozostałe komórki i jednorazowo wypłucz osad w PBS. Zamroź osady w temperaturze -80 °C do przyszłych analiz (np. western blot w celu potwierdzenia ekspresji genów lub knockdownu).
- Zazwyczaj po jednym lub dwóch miesiącach myszy są sekcjowane, a lokalizacje przerzutów określane makroskopowo. Płuca są głównym miejscem przerzutów, ponieważ zawierają pierwsze łożysko kapilarne, z którym stykają się komórki po wejściu do krwiobiegu.
- Po wypłukaniu w PBS każdy płat płuca (lub inne tkanki zawierające przerzuty) jest oglądany pod mikroskopem sekcyjnym (Rycina 1). Liczba wykrywalnych przerzutów po obu stronach płuca jest zliczana, a liczby przerzutów we wszystkich czterech płatach są sumowane jako całkowita liczba przerzutów w płucach.1 Przerzuty w płucach są łatwiejsze do wykrycia, jeśli płuca zostaną utrwalone w formalinie przez noc, ponieważ przerzuty będą widoczne jako białawe plamki w kontraście do sąsiednich ciemnobrązowych tkanek płucnych.
3. Hodowla komórek z przerzutów do płuc
- Przerzuty do płuc izoluje się z wstrzykniętych myszy. Każdy z nich należy hodować oddzielnie.
- Każdy przerzut rozdrabnia się za pomocą końcówki nakrętki igły (sterylnej) na sitku komórkowym o oczkach 70 μm.
- Sitko komórkowe płucze się kilkoma mL pożywki, a komórki, które przeszły przez filtr, zbiera się do naczynia hodowlanego.
- Komórki inkubuje się w temperaturze 37 °C przez co najmniej cztery dni, nie zakłócając ich wzrostu.
- Krew lub szczątki tkankowe z naczynia wypłukuje się za pomocą PBS.
- Dodaje się świeżą pożywkę. Na początku na płytkach rosną zarówno komórki nowotworowe, jak i fibroblasty, jednak z czasem fibroblasty obumierają i zostają zastąpione przez komórki nowotworowe. Jeśli komórki nowotworowe posiadają geny oporności na leki, dokonuje się selekcji komórek przy użyciu odpowiednich antybiotyków.
- Czystość uzyskanych komórek ocenia się za pomocą immunobarwienia z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko białkom specyficznym dla ludzi. Stosujemy przeciwciało anty-ludzka wimentyna (NCL-VIM-V9, Novocastra). Uzyskane przez nas komórki zawierają zazwyczaj ponad 99% komórek ludzkich, nawet w przypadku braku selekcji lekowej. Nowo wyizolowane komórki można ponownie wstrzyknąć myszom z niedoborem odporności, aby przetestować ich zdolności przerzutowe, zgodnie z powyższym opisem.
4. Reprezentatywne wyniki
- Pod koniec tego testu wysoce metastatyczna linia komórek nowotworowych zazwyczaj daje początek wielu przerzutom do płuc (Rycina 1),1 podczas gdy linia komórek nowotworowych o niskim potencjale metastatycznym wygeneruje bardzo mało przerzutów do płuc.
- Komórki otrzymane za pomocą tej metody zazwyczaj dają początek większej liczbie przerzutów niż linia rodzicielska, gdy są ponownie badane przy użyciu tego testu.1-3
Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy płuc myszy po wstrzyknięciach do żyły ogonowej komórek nowotworowych. 5 x 105 komórek przerzutowej ludzkiej linii komórkowej czerniaka, komórki SM,4 wstrzyknięto do żyły ogonowej myszy z niedoborem odporności. Po dwóch miesiącach wyizolowano płuca, w których stwierdzono obecność przerzutów rozproszonych w prawidłowej tkance płucnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przerzuty są główną przyczyną zgonów u pacjentów z nowotworami. Proces ten obejmuje cztery główne etapy: odłączenie się komórek nowotworowych od ich pierwotnego miejsca występowania, ich przedostanie się do krwiobiegu (intrawazacja), opuszczenie krwiobiegu (ekstrawazacja) oraz przetrwanie i wzrost w odległym narządzie. Przerzutowanie u ludzi jest uważane za proces powolny i często objawia się po latach latencji. Aby badać jego progresję w odpowiednim czasie, u myszy z niedoborem odporności opracowano powyższy, stosunkowo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Niniejszy protokół został początkowo przetestowany i zoptymalizowany w laboratorium dr. Richarda Hynesa (MIT). Finansowanie zapewniono z grantu NYSTEM IDEA AWARD (dla L.X.) oraz Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (dla L.X.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Czerwień fenolowa | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Błękit trypanu | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsyna 2,5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| Probetka Falcon 50 ml | VWR international | 89039-656 | |
| Probówki do mikrocentryfugi | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Sito do komórek Falcon 70μm | BD Biosciences | 352350 | |
| Probówka hodowlana Falcon 5 ml | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometr | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| Strzykawka 1 ml | BD Biosciences | 329650 | |
| Igła 30 ½ G | BD Biosciences | 305106 | |
| Restryktor dla myszy | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Nożyczki chirurgiczne | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pinceta | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Mikroskop sekcyjny | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Wirówka naktławowa | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
Bibliografia
- Xu, L. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases. Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
