Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowania, który jest wykorzystywany do określania potencjału metastatycznego ludzkich linii komórkowych raka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test eksperymentalny przerzutowania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przerzuty są główną przyczyną zgonów u pacjentów z nowotworami. Aby zrozumieć mechanizm przerzutowania, opracowano eksperymentalny test przerzutów z wykorzystaniem myszy z niedoborem odporności. Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedury stosowane w tym teście, w tym przygotowanie próbek, wstrzyknięcia dożylne oraz hodowlę komórek pochodzących z przerzutów do płuc. W skrócie, przygotowano wcześniej określoną liczbę ludzkich komórek nowotworowychin vitroa następnie wstrzyknięte bezpośrednio do krwiobiegu myszy z niedoborem odporności poprzez żyły ogonowe. Niewielka liczba komórek przeżywa turbulencje w krwiobiegu i rozwija się jako przerzuty w narządach wewnętrznych, takich jak płuca. Po określonym czasie myszy poddano sekcji. Rozmieszczenie przerzutów w tkankach określono pod mikroskopem stereoskopowym. Policzono liczbę przerzutów w konkretnej tkance, co bezpośrednio koreluje ze zdolnością do przerzutowania wstrzykniętych komórek nowotworowych. Powstałe przerzuty wyizolowano i poddano hodowliin vitrolinie komórkowe, które po ponownym wstrzyknięciu myszom z niedoborem odporności często wykazują większe zdolności metastatyczne niż linia rodzicielska. Te wysoce metastatyczne pochodne stają się użytecznymi narzędziami do identyfikacji genów lub szlaków molekularnych regulujących progresję przerzutowania.
Protokół
1. Przygotowanie próbek
- Hodować komórki do osiągnięcia ok. 70% konfluencji w dedykowanym medium z czynnikami wzrostu lub FBS (np. DMEM z 10% FBS dla komórek MC-1). Odessać medium z płytki i delikatnie przemyć kilkukrotnie 1 x PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,15 g/L Na2HPO4.7H2O, 0,2 g/L KH2PO4, pH 7,3).
- Odessać PBS i dodać 2 mL 0,05% trypsyny w versenie (0,014 g/L czerwieni fenolowej i 0,2 g/L EDTA-Na w 1 x PBS, pH 7,2). Delikatnie kołysać płytką, aby ułatwić odrywanie się komórek od podłoża. Obserwować komórki pod mikroskopem. Odrywanie się komórek trwa zazwyczaj od 2 do 5 minut.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przerzuty są główną przyczyną zgonów u pacjentów z nowotworami. Proces ten obejmuje cztery główne etapy: odłączenie się komórek nowotworowych od ich pierwotnego miejsca występowania, ich przedostanie się do krwiobiegu (intrawazacja), opuszczenie krwiobiegu (ekstrawazacja) oraz przetrwanie i wzrost w odległym narządzie. Przerzutowanie u ludzi jest uważane za proces powolny i często objawia się po latach latencji. Aby badać jego progresję w odpowiednim czasie, u myszy z niedoborem odporności opracowano powyższy, stosunkowo.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Niniejszy protokół został początkowo przetestowany i zoptymalizowany w laboratorium dr. Richarda Hynesa (MIT). Finansowanie zapewniono z grantu NYSTEM IDEA AWARD (dla L.X.) oraz Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (dla L.X.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Czerwień fenolowa | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Błękit trypanu | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsyna 2,5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| Probetka Falcon 50 ml | VWR international | 89039-656 | |
| Probówki do mikrocentryfugi | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Sito do komórek Falcon 70μm | BD Biosciences | 352350 | |
| Probówka hodowlana Falcon 5 ml | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometr | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| Strzykawka 1 ml | BD Biosciences | 329650 | |
| Igła 30 ½ G | BD Biosciences | 305106 | |
| Restryktor dla myszy | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Nożyczki chirurgiczne | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pinceta | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Mikroskop sekcyjny | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Wirówka naktławowa | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
Bibliografia
- Xu, L. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases. Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis r....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
