Eksperymentalny test przerzutów

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowego, który jest używany do określenia potencjału przerzutowego ludzkich linii komórek rakowych.

Streszczenie

Przerzuty są główną przyczyną zgonów u pacjentów z rakiem. Aby zrozumieć mechanizm przerzutów, przeprowadzono eksperymentalny test przerzutów na myszach z niedoborem odporności. W tym artykule opisano procedury związane z tym testem, w tym przygotowanie próbki, wstrzyknięcie dożylne i hodowlę komórek z przerzutów do płuc. Krótko mówiąc, wcześniej określoną liczbę ludzkich komórek rakowych przygotowano in vitro i bezpośrednio wstrzyknięto do krążenia myszy z niedoborem odporności przez ich żyły ogonowe. Niewielka liczba komórek przeżywa turbulencje w krążeniu i rośnie jako przerzuty do narządów wewnętrznych, takich jak płuca. Wstrzyknięte myszy są poddawane sekcji po pewnym czasie. Rozmieszczenie przerzutów w tkankach określa się pod mikroskopem preparacyjnym. Liczba przerzutów w określonej tkance jest zliczana i bezpośrednio koreluje ze zdolnością przerzutową wstrzykniętych komórek nowotworowych. Powstałe przerzuty są izolowane i hodowane in vitro jako linie komórkowe, które często wykazują lepsze zdolności przerzutowe niż linia rodzicielska po ponownym wstrzyknięciu myszom z niedoborem odporności. Te wysoce przerzutowe pochodne stają się użytecznymi narzędziami do identyfikacji genów lub szlaków molekularnych, które regulują progresję przerzutów.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Hoduj komórki do ~ 70% zlewających się w ich specyficznych pożywkach z czynnikami wzrostu lub FBS (np. DMEM z 10% FBS dla komórek MC-1). Odessać pożywkę z płytki i delikatnie przemyć kilkakrotnie 1 x PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,15 g/L Na₂HPO 4,7H₂O, 0,2 g/L KH₂PO₄, pH 7,3).
2. Odessać PBS i dodać 2 ml 0,05% trypsyny w versenie (0,014 g/L czerwieni fenolowej i 0,2 g/L EDTA-Na w 1 x PBS, pH 7,2). Delikatnie kołysz płytkę, aby ułatwić odłączanie komórek od płytki. Obserwuj komórki pod mikroskopem. Zwykle odłączanie komórek zajmuje 2-5 minut.
3. Dodaj dużą objętość pożywki zawierającej FBS (lub inhibitor trypsyny sojowej), aby ugasić aktywność trypsyny i zebrać komórki w probówce Falcon o pojemności 50 ml. Policz komórki za pomocą hemekytometru. Załaduj 10 μl zawiesiny komórek na czysty hemacytometr. Liczba komórek na ml jest równa średniej # komórek w każdym z pięciu kwadratów pomnożonej przez 10⁴.
4. Odwiruj komórki z prędkością 1000 obr./min (lub ~200 xg) w wirówce stołowej przez 3 minuty.
5. Ostrożnie wyjmij pożywkę, nie naruszając osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości zrównoważonego roztworu buforowego Hanksa (HBSS), aby osiągnąć końcowe stężenie ~ 5 x 10⁶ komórek / ml.
6. Przefiltruj komórki przez sitko Falcon 70 μm, aby wykluczyć duże agregaty komórek. Umieść końcówkę pipety bezpośrednio na filtrze nad oznaczoną probówką hodowlaną Falcon o pojemności 5 ml. Szybko wyrzuć zawiesinę przez filtr do probówki hodowlanej.
7. Ponownie policz komórki za pomocą hemacytometru i rozcieńcz je do końcowego stężenia 2,5 x 10⁶/ml. Utrzymuj komórki na lodzie.
8. Określ żywotność komórek. Wymieszaj niektóre komórki z błękitem trypanowym i zmierz procent martwych (niebieskich) komórek w stosunku do wszystkich komórek za pomocą hemacytometru. Żywotność komórek powinna wynosić ≥ 90% przed wstrzyknięciem.

2. Wstrzyknięcie dożylne

1. Zmień rękawiczki. Delikatnie chwyć ogon myszy z niedoborem odporności (nago, NOD-SCID lub NSG, Jackson's Laboratory) i wciągnij go do unieruchomienia myszy, plecami opierając się o szczelinę, a ogon wystaje z małego otworu z tyłu ogranicznika.
2. Powoli wsuń pierścień do środka wzdłuż szczeliny i zablokuj go na miejscu, gdy pierścień złapie usta myszy. Mysz nie powinna być w stanie poruszać się swobodnie, ale powinna mieć normalne tempo oddychania.
3. Znajdź główne żyły ogonowe. W ogonie myszy znajdują się cztery główne naczynia krwionośne. Naczynia krwionośne po grzbietowej i brzusznej stronie ogona są tętnicami. Żyły znajdują się po bocznych stronach ogona.
4. Pobrać ponad 200 μl przygotowanych komórek do strzykawki o pojemności 1 ml. Przymocuj igłę 30 G1/2 cala i wypchnij wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą istnieć. Ostateczna objętość komórek w strzykawce powinna wynosić 200 μl (tj. łącznie 5 x 10⁵ komórek).
5. Wstrzyknij komórki do żyły ogonowej.
   1. Zacznij od dystalnego końca ogona, więc jeśli pierwsza próba się nie powiedzie, do drugiej próby można użyć bardziej proksymalnego obszaru ogona.
   2. Przetrzyj ogon 70% etanolem. Pociągnij ogon prosto. Chwyć czubek ogona kciukiem i podeprzyj punkt wstrzyknięcia palcem wskazującym.
   3. Wbić igłę do żyły i wstrzyknąć komórki. Podczas wstrzykiwania należy upewnić się, że igła i strzykawka są ustawione równolegle do żyły, w przeciwnym razie igła przebije ścianę naczynia i wstrzyknie komórki do sąsiednich tkanek ogona.
   4. Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę. Krew powinna obfitować w miejscu wstrzyknięcia, jeśli wstrzyknięcie się powiodło. Przyciśnij czysty kawałek ręcznika papierowego lub bawełnianego wacika do miejsca wstrzyknięcia, aby ułatwić krzepnięcie, i obmacuj ogon do góry, aby wepchnąć pozostałą próbkę w żyle do krążenia.
   5. Uwolnij mysz z ogranicznika i włóż ją z powrotem do klatki. Zapisz proces wstrzykiwania (np. ile prób zajęło wstrzyknięcie komórek i ile komórek zostało wstrzykniętych) w zeszycie laboratoryjnym.
   6. Określić żywotność komórek po wstrzyknięciu, zgodnie z opisem w rozdziale Przygotowanie próbki, krok 9. Ten krok daje pewność, że komórki pozostają przy życiu przez cały proces wstrzykiwania. Pod koniec eksperymentu z iniekcją żywotność komórek spadnie, ale powinna wynosić powyżej 80%.
   7. (opcjonalnie) Odkręć pozostałe komórki i raz przepłucz granulki PBS. Zamrozić granulki w temperaturze -80 oC do przyszłych analiz (np. western blot w celu potwierdzenia ekspresji genów lub knockdownów).
6. Zazwyczaj po jednym lub dwóch miesiącach myszy są poddawane sekcji, a lokalizacje przerzutów są z grubsza określone. Płuco jest głównym miejscem przerzutów, ponieważ zawiera pierwsze łożysko kapilarne, z którym komórki napotykają po wejściu do krążenia.
7. Po przepłukaniu PBS każdy płat płuca (lub inne tkanki zawierające przerzuty) obserwuje się pod mikroskopem preparacyjnym (ryc. 1). Liczbę wykrywalnych przerzutów po obu stronach płuc zlicza się, a liczbę przerzutów do płuc na wszystkich czterech płatach dodaje się do siebie jako całkowitą liczbę przerzutów do płuc. ¹ Przerzuty do płuc są łatwiejsze do wykrycia, jeśli płuca zostaną utrwalone w formalinie przez noc, ponieważ przerzuty pojawią się jako białawe plamy w przeciwieństwie do sąsiednich ciemnobrązowych tkanek płucnych.

3. Hodowla komórek z przerzutów do płuc

1. Przerzuty do płuc są izolowane od myszy, którym wstrzyknięto implanty. Każdy z nich powinien być hodowany osobno.
2. Każdy przerzut jest mielony na końcu nasadki igły (sterylnej) na sitku do komórek o wielkości 70 μm.
3. Przepłucz sitko komórkowe kilkoma ml pożywki i zebranymi komórkami, które przechodzą przez filtr w naczyniu hodowlanym.
4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez co najmniej cztery dni bez zakłóceń.
5. Zmyj krew lub resztki tkanek na naczyniu za pomocą PBS.
6. Dodaj świeże podłoże. Na początku na płytkach rosną zarówno komórki rakowe, jak i komórki fibroblastów, ale stopniowo komórki fibroblastów wymierają i są zastępowane komórkami rakowymi. Jeśli komórki rakowe są nosicielami genów oporności na leki, należy wybrać komórki z odpowiednimi antybiotykami.
7. Czystość pobranych komórek ocenia się za pomocą barwienia immunologicznego przy użyciu przeciwciał przeciwko białkom specyficznym dla człowieka. Używamy przeciwciała przeciwko ludzkiej wimentynie (NCL-VIM-V9, Novocastra). Uzyskane przez nas komórki zawierają zazwyczaj ponad 99% komórek ludzkich, nawet przy braku selekcji leków. Nowo uzyskane komórki można ponownie wstrzyknąć myszom z niedoborem odporności w celu przetestowania ich zdolności przerzutowych, jak opisano powyżej.

4. Reprezentatywne wyniki

1. Pod koniec tego testu wysoce przerzutowa linia komórek rakowych zazwyczaj powoduje wiele przerzutów do płuc (ryc. 1), podczas gdy bardzo niewiele przerzutów do płuc będzie pochodzić ze słabo przerzutowej linii komórek rakowych.
2. Komórki uzyskane tą metodą zwykle powodują więcej przerzutów niż linia rodzicielska, gdy są ponownie badane przy użyciu tego testu. ^1-3

Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy płuc myszy po wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej. 5 x 10⁵ z przerzutowej linii komórkowej ludzkiego czerniaka, komórek ^SM,4 wstrzyknięto do żyły ogonowej myszy z niedoborem odporności. Dwa miesiące później płuca zostały odizolowane i stwierdzono przerzuty rozproszone w normalnej tkance płucnej.

Dyskusja

Przerzuty są główną przyczyną zgonów u pacjentów z rakiem. Obejmuje ona cztery główne etapy: oderwanie komórek nowotworowych od ich pierwotnych loci, ich wejście do krążenia (wynaczynienie), ich wyjście z krążenia (wynaczynienie) oraz przeżycie i wzrost w odległym narządzie. Przerzuty u ludzi są uważane za proces powolny i często objawiają się po latach utajenia. Aby zbadać jego postęp w odpowiednim czasie, powyższy stosunkowo szybki test eksperymentalny został opracowany na myszach z niedoborem odporności. ⁴...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	10313-021
FBS	Hyclone	SH30088.03
HBSS	Invitrogen	14175-095
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
KCl	Mallinckrodt Baker Inc.	6838-04
Na2 HPO4.7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	7896-04
KH2PO4	Mallinckrodt Baker Inc.	7100-12
Czerwień fenolowa	Sigma-Aldrich	P3532
EDTA-Na	EMD Millipore	4010
Błękit trypanowy	Invitrogen	15250-061
Trypsyna 2,5%	Invitrogen	15090-046
Etanol	Ultrapure	200-CSGP
50 ml Falcon Tube	VWR international	89039-656
Probówki do mikrowirówek	Axygen Scientific	MCT-175-C
Falcon 70μ m Sitko do komórek	BD Biosciences	352350
5ml Probówka do hodowli sokoła	VWR international	60818-576
Hemacytometr	Hausser Scientific	15170-208
Strzykawka 1 ml	BD Biosciences	329650
30 ½ igła pomiarowa	BD Biosciences	305106
Ogranicznik myszy	Plas Labs Inc.	551-BSRR
Nożyczki chirurgiczne	Fisher Scientific	08-940
Kleszcze	Fisher Scientific	08-902
Mikroskop preparacyjny	Instrumenty Nikon SMZ1500
Wirówka stołowa	Thermo Fisher Scientific, Inc.