Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem własnoręcznie wykonanego urządzenia do cytocentryfugacji

Podsumowanie

Immunocytochemiczne barwienie w zawiesinie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) pod kątem markerów powierzchniowych komórek (SSEA-3/SSEA-4) zostało przeprowadzone z wykorzystaniem własnego urządzenia do cytocentryfugacji w celu stworzenia monowarstwy komórek do obserwacji i kwantyfikacji.

Streszczenie

Ludzkie pluripotencyjne komórki macierzyste (hPSCs), obejmujące ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) oraz ludzkie indukowane pluripotencyjne komórki macierzyste (hiPSCs), stanowią obiecujące źródła komórkowe ze względu na ich nieograniczone zdolności do samoodnawiania oraz potencjał do różnicowania się w wiele typów komórek. Stan pluripotencji hPSCs jest zazwyczaj oceniany za pomocą takich technik jak qPCR, immunocytochemia oraz innychin vitroiin vivostrategie różnicowania na wiele typów komórek. Wśród nich opracowano techniki immunocytochemiczne do rutynowej charakterystyki stanu niedróżnicowanego hPSC w oparciu o analizę kandydatów na wewnątrzkomórkowe i powierzchniowe biomarkery komórkowe. Biorąc pod uwagę fakt, że hPSC rosną w postaci kolonii, pojawiają się problemy z rutynowym ilościowym określaniem ekspresji tych markerów na poziomie pojedynczych komórek. Analizy przepływowe służą do rozwiązania tego problemu, lecz wymagają liczby komórek i zastosowania odczynników, które zazwyczaj nie sprzyjają rutynowej ocenie kontroli jakości kultur hPSC. Zatem opracowanie praktycznych i powtarzalnych metod tworzenia monowarstw komórkowych z zachowaną integralnością do oceny markerów niesie ze sobą wiele korzyści w badaniach nad komórkami macierzystymi. Przynosi to znaczące korzyści w analizie immunocytochemicznej, ponieważ poszczególne komórki z monowarstwy można łatwo obserwować i ilościowo oceniać pod kątem ekspresji specyficznych markerów. W tym celu skonstruowano i zoptymalizowano własny aparat do cytospiningu z przeznaczeniem do barwień immunocytochemicznych. Na potrzeby niniejszego protokołu przeanalizowano ekspresję dwóch markerów powierzchniowych (SSEA3/SSEA4) w wariancie linii komórek macierzystych BG01.

Protokół

Część 1: Immunocytochemiczne barwienie w zawiesinie

1. Komórki zbiera się, tworząc zawiesinę pojedynczych komórek.
2. Następnie komórki przenosi się do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5-2 mL i wiruje przy 200g przez 4 minuty.
3. Komórki przemywa się poprzez odessanie supernatantu, ponowne zawieszenie w 1 mL PBS-- (bez Mg²⁺ i Ca²⁺) i ponowne wirowanie przy 200g przez 4 minuty. Czynność tę należy powtórzyć dwukrotnie.
4. Po przemyciu komórki utrwala się, zawieszając je w 1 mL 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
5. Komórki przemywa się ponownie dwukrotnie 1 mL PBS--.
6. Po przemyciu komórki blokuje się, zawieszając je w 1 mL roztworu blokującego (6% surowicy/94% PBS--). Próbki inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
7. Następnie probówki wiruje się przy 200g przez 4 minuty i odsysa roztwór blokujący. Komórki zawiesza się w 1 mL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (przygotowanego w roztworze blokującym przy zalecanym rozcieńczeniu). Komórki można inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w 4°C przez noc przed przejściem do następnego kroku.
8. Następnie komórki przemywa się dwukrotnie 1 mL roztworu blokującego.
9. Po tym czasie komórki zawiesza się w 1 mL roztworu przeciwciała drugorzędowego (przygotowanego w roztworze blokującym przy zalecanym rozcieńczeniu) i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
10. Po 1 godzinie komórki należy ponownie przemyć dwukrotnie 1 mL roztworu blokującego.
11. Po przemyciu roztworem blokującym komórki przemywa się ponownie 1 mL PBS--.
12. Po kolejnych przemyciach komórki zawiesza się w 1 mL barwnika jądrowego DAPI (rozcieńczenie DAPI w PBS-- 1:10 000) i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
13. Po 5 minutach probówki wiruje się przy 200g przez 4 minuty. Odsysa się roztwór barwnika jądrowego DAPI i zawiesza komórki w 1 mL PBS--.

Część 2: Osadzanie hPSC na preparatach wykonanych za pomocą cytocentryfugi

1. Plastikowe szkiełka przygotowuje się, wykonując w nich odpowiednią liczbę otworów za pomocą wiertarki stołowej. Średnica otworu powinna być maksymalnie o 1mm większa od największej średnicy końcówek mikropipety, których należy użyć.
2. Papier filtracyjny zostaje docięty nożyczkami do wymiarów plastikowego szkiełka.
3. Następnie w papierze filtracyjnym wykonuje się otwory. Rozmiar otworu(ów) powinien być taki, aby końcówki mikropipety pasowały do nich ściśle.
4. Następnie jedno z przygotowanych plastikowych szkiełek kładzie się na wierzchu, a szkiełko szklane umieszcza się pod dociętym papierem filtracyjnym (Rysunek 1). Warstwy zostają zabezpieczone taśmą.
5. Następnie maksymalnie 100μL (w zależności od pożądanej gęstości monowarstwy) zabarwionej zawiesiny komórkowej z Części 1 wprowadza się do górnej części końcówki(ek) mikropipety.
6. W razie potrzeby aparat z roztworem komórek można zważyć i przygotować przeciwwagę o podobnej masie.
7. Aparat do cytocentryfugacji oraz przeciwwagę umieszcza się następnie w wirówce stołowej i wiruje przy 200g przez 4 minuty.
8. Po wirowaniu aparat do cytocentryfugacji zostaje ostrożnie rozmontowany w taki sposób, aby nie usunąć komórek z szkiełka szklanego.
9. W razie potrzeby odsysa się nadmiar otaczającego PBS z powierzchni szkiełka szklanego.
10. Następnie komórki można oglądać pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby sprawdzić, czy uzyskano pożądaną monowarstwę komórek.

Część 3: Montowanie preparatów

1. Kropelkę wybranego medium montażowego nanosi się bezpośrednio na środek każdego obszaru zawierającego komórki.
2. Następnie ostrożnie opuszcza się szkiełko nakrywkowe na preparaty, starając się w miarę możliwości uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
3. Nadmiar medium montażowego usuwa się z preparatów.
4. Krawędzie szkiełek nakrywkowych uszczelnia się lakierem do paznokci.
5. Preparaty można przechowywać w ciemnym miejscu do momentu zaobserwowania i udokumentowania wyników.

Dyskusja

Na potrzeby naszego laboratorium do procedury barwienia immunocytochemicznego z wykorzystaniem aparatury do cytospinowania przeznacza się szalkę 35 mm z kulturami komórek macierzystych hodowanych na zarodkowych fibroblastach myszy (MEF). Następnie komórki są zbierane poprzez pasaż enzymatyczny, usuwając jak największą część warstwy MEF, w celu otrzymania zawiesiny pojedynczych komórek. Jeśli wymagana jest bardziej efektywna izolacja komórek macierzystych z warstwy MEF, kolonie można pobrać ręcznie, a następnie poddać tra...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka przedmiotowe z komorą Lab Tek Permanox	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Materiał do wielokrotnego użytku szkiełek plastikowych
Wstępnie oczyszczone szkiełka mikroskopowe Superfrost/Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Napiwniki z filtrem 0,1-10μL	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Kryszka mikroskopowa	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Medium montażowe
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Normalne surowica kozia	Invitrogen	10000C
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko SSEA-4	EMD Millipore	MAB4304	Przeciwciało pierwszorzędowe do barwienia SSEA-4
Szczurze przeciwciało monoklonalne przeciwko SSEA-3	EMD Millipore	MAB4303	Przeciwciało pierwszorzędowe do barwienia SSEA-3
Alexa Fluor 488 przeciwciało kozie anty-mysie IgG	Invitrogen	A11029	Przeciwciało wtórne do barwienia SSEA-4
Alexa Fluor 488 znakowane przeciwciało kozie anty-szczurze IgG	Invitrogen	A11006	Przeciwciało wtórne do barwienia SSEA-3
DAPI, dichlorowodorek	Calbiochem	268298