Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu samodzielnie wykonanego aparatu cytospinowego

Podsumowanie

Barwienie zawiesinowe immunocytochemiczne ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) dla markerów powierzchni komórki (SSEA-3/SSEA-4) zostało osiągnięte dzięki użyciu samodzielnie wykonanego aparatu cytospinowego do stworzenia monowarstwy komórek do obserwacji i kwantyfikacji.

Streszczenie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC), które obejmują ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), są ekscytującym źródłem komórek ze względu na ich nieograniczone możliwości samoodnawiania i potencjał do różnicowania się w wiele typów komórek. Stan pluripotencjalny hPSC jest zwykle oceniany za pomocą technik takich jak qPCR, immunocytochemia oraz inne strategie różnicowania in vitro i in vivo na wiele typów komórek. Wśród nich opracowano techniki immunocytochemiczne do rutynowej charakterystyki niezróżnicowanego stanu hPSC w oparciu o analizę potencjalnych biomarkerów wewnątrzkomórkowych i powierzchniowych komórek. Biorąc pod uwagę fakt, że hPSC rosną jako kolonie, pojawiają się problemy z rutynowym określaniem ilościowym ekspresji tych markerów na poziomie poszczególnych komórek. Analizy cytometrii przepływowej służą rozwiązaniu tego problemu, ale wymagają numerowania komórek i stosowania odczynników, które zwykle nie sprzyjają rutynowej ocenie jakości kultur hPSC. W związku z tym opracowanie praktycznych i powtarzalnych metod tworzenia jednowarstwowych próbek komórek o zachowanej integralności do oceny markerów ma wiele zalet w badaniach nad komórkami macierzystymi. Jest to bardzo korzystne dla analizy immunocytochemicznej, ponieważ poszczególne komórki z monowarstwy można łatwo obserwować i określać ilościowo pod kątem ekspresji określonych markerów. W tym celu skonstruowano samodzielnie wykonany aparat cytospinowy, który zoptymalizowano pod kątem barwienia immunocytochemicznego. Na potrzeby tego protokołu przeanalizowano ekspresję dwóch markerów powierzchniowych komórek (SSEA3/SSEA4) w linii komórek macierzystych wariantu BG01.

Protokół

Część 1: Barwienie immunocytochemiczne zawiesiny

1. Komórki są zbierane do pojedynczej zawiesiny komórkowej.
2. Komórki są następnie przenoszone do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5-2 ml i odwirowywane przy 200 g przez 4 minuty.
3. Komórki przepłukuje się przez odsysanie supernatantu, ponownie zawiesza w 1 ml PBS (bez Mg^{2 +} i Ca^{2 +}), a następnie ponownie odwirowuje w 200 g przez 4 minuty. Należy to zrobić dwukrotnie.
4. Po umyciu komórki są następnie utrwalane poprzez ponowne zawieszenie ich w 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej na 10 minut.
5. Komórki przemuje się ponownie dwukrotnie 1 ml PBS
--.
6. Po umyciu zablokuj komórki, ponownie zawieszając je w 1 ml roztworu blokowego (6% surowicy/94% PBS--). Inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
7. Następnie odwirować probówki o wadze 200 g przez 4 minuty i odessać roztwór blokowy. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (wykonanego z roztworem blokowym w zalecanym rozcieńczeniu). Komórki można inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4°C przez noc przed przejściem do następnego etapu.
8. Komórki są następnie dwukrotnie przemywane 1 ml roztworu blokowego.
9. Następnie ponownie zawiesić komórki w 1 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych (sporządzonego z roztworu blokowego w zalecanym rozcieńczeniu) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
10. Po 1 godzinie komórki należy ponownie dwukrotnie przemyć 1 ml roztworu blokowego.
11. Po umyciu roztworem blokowym ponownie przemyj komórki 1 ml PBS
--.
12. Po różnych płukaniach ponownie zawiesić komórki w 1 ml barwienia jądrowego DAPI (rozcieńczenie DAPI w PBS 1:10 000) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
13. Po 5 minutach odwiruj probówki o masie 200 g przez 4 minuty. Odessać roztwór barwienia jądrowego DAPI i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS
--.

Część 2: Włączenie hPSC do preparatów generowanych przez aparat cytospinowy

1. Zjeżdżalnie plastikowe przygotowuje się, wykonując w nich żądaną ilość otworów za pomocą wiertarki. Średnica musi być co najwyżej o 1 mm większa niż najszersza średnica końcówki (końcówek) do mikropipet, która ma być użyta.
2. Bibułę filtracyjną przycina się nożyczkami do parametrów szkiełka z tworzywa sztucznego.
3. Następnie wykonuje się otwory w bibule filtracyjnej. Rozmiar otworu (otworów) powinien być na tyle duży, aby końcówka (końcówki) mikropipety ściśle przez nie pasowały.
4. Następnie jeden z przygotowanych szkiełek z tworzywa sztucznego umieszcza się na górze, a na dole pociętej bibuły filtracyjnej umieszcza się szkiełko szklane (rysunek 1). Warstwy są zabezpieczone taśmą.
5. Maksymalnie 100 μl (w zależności od pożądanej gęstości monowarstwy) wybarwionej zawiesiny komórek z części 1 umieszcza się następnie w górnej części końcówki (końcówek) mikropipety.
6. W razie potrzeby można zważyć aparaturę z roztworem komórkowym i utworzyć przeciwwagę o podobnej wadze.
7. Aparat cytospinowy i puszkę z przeciwwagą umieszcza się następnie w wirówce stacjonarnej i odwirowuje w stężeniu 200 g przez 4 minuty.
8. Po odwirowaniu aparat cytospinowy jest starannie demontowany w taki sposób, aby nie wysunąć komórek ze szkiełka podstawowego.
9. W razie potrzeby nadmiar otaczający PBS - po stronie szkła jest zasysany.
10. Komórki można następnie oglądać za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby sprawdzić, czy uzyskano pożądaną monowarstwę komórkową.

Część 3: Montaż prowadnic

1. Kropla żądanego nośnika montażowego jest umieszczana bezpośrednio w środku każdego obszaru zawierającego komórki.
2. Następnie szkiełko nakrywkowe jest delikatnie opuszczane na szkiełka, starając się uniknąć pęcherzyków powietrza, jeśli to możliwe.
3. Nadmiar nośników montażowych jest następnie usuwany z prowadnic.
4. Następnie boki szkiełek nakrywkowych uszczelnia się lakierem do paznokci.
5. Preparaty można przechowywać w ciemnym miejscu do czasu zaobserwowania i udokumentowania wyników.

Dyskusja

Na potrzeby naszego laboratorium do procedury barwienia immunocytochemicznego do stosowania w aparacie cytospinowym przeznaczono 35-milimetrową szalkę z kulturami komórek macierzystych wyhodowanymi na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF). Komórki są następnie zbierane za pomocą pasażu enzymatycznego, usuwając jak najwięcej warstwy MEF do zawiesiny jednokomórkowej. Jeśli pożądana jest bardziej skuteczna izolacja komórek macierzystych z warstwy MEF, kolonie mogą być zbierane ręcznie, a następnie trawione do postaci zaw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lab Tek Zjeżdżalnia komorowa Permanox	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Materiał na ponownie wykorzystane szkiełka z tworzywa sztucznego Superfrost
/Plus Szkiełka mikroskopowe Wstępnie oczyszczone	Fisher Scientific	12-550-15
0,1-10μ L Końcówki filtrów	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Szklana osłona mikroskopu	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Podłoże montażowe
DPBS	GIBCO, firmy Life Technologies	14190
Normalna surowica kozia	Invitrogen	10000C
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-SSEA-4	EMD Millipore	MAB4304	Przeciwciało pierwszorzędowe do barwienia SSEA-4 Szczurze
przeciwciało monoklonalne anty-SSEA-3	EMD Millipore	MAB4303	Przeciwciało pierwszorzędowe do barwienia SSEA-3
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11029	Przeciwciało drugorzędowe do barwienia SSEA-4
Alexa Fluor 488 znakowane kozią przeciwciałem anty-szczurzym IgG	Invitrogen	A11006	Przeciwciało drugorzędowe do barwienia
SSEA-3DAPI, Dichlorowodorek	Calbiochem	268298