Utworzenie chronicznego modelu mysiego z infekcją bakteryjną z trwałą kolonizacją jelit przez Salmonella typhimurium przez 27 tygodni.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model myszy z przewlekłą infekcją Salmonella
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Model myszy z infekcją bakteryjną jest potężnym systemem modelowym do badania takich obszarów jak infekcje, stany zapalne, immunologia, transdukcja sygnału oraz tumorigeneza. Wielu badaczy wykorzystało zapalenie jelita grubego wywołane przezSalmonellatyphimurium do badań nad wczesną fazą stanu zapalnego i infekcji. Jednakże, niewiele jest doniesień na temat infekcji przewlekłejin vivoMyszy zSalmonellatrwała obecność w przewodzie pokarmowym pozwala nam badać długoterminowe interakcje między gospodarzem a bakteriami, transdukcję sygnałów oraz procesy nowotworzenia. Opracowaliśmy model myszy z przewlekłą infekcją bakteryjną za pomocąSalmonellakolonizacja *T. typhimurium* w jelitach myszy w ciągu 6 miesięcy. Aby korzystać z tego systemu, badacz musi nauczyć się, jak przygotować kulturę bakteryjną oraz jak podawać ją zwierzętom przez zgłębnik. Szczegółowo opisujemy metodologię przygotowania kultury bakteryjnej i podawania jej myszom drogą zgłębnika. Pokazujemy również, jak wykryćSalmonellatrwałość w przewodzie pokarmowym. Ogólnie rzecz biorąc, niniejszy protokół pomoże badaczom wykorzystującym model myszy zakażonych bakteriami w odpowiedzi na fundamentalnie ważne pytania biologiczne i mikrobiologiczne.
Protokół
Ten protokół obejmuje trzy części: hodowlę bakterii, gawagę u myszy oraz wykrywanie Salmonella.
1. Warunki wzrostu Salmonella.
- Przygotuj szalkę z bulionem Luria-Bertani (LB) dla Salmonella i inkubuj nocą w 37°C.
- Wybierz klon ze szalki LB i przenieś go do 7 ml bulionu LB w probówce 12 ml, następnie inkubuj z wstrząsaniem w 37°C przez około 5 godzin.
- Zainokuluj 50 ml bulionu LB za pomocą 0,05 ml hodowli w fazie stacjonarnej i inkubuj w 37°C bez wstrząsania przez około 18 godzin.
- Odrodź hodowlę bakteryjną nocną przez 10 minut w temperaturze pokojowej z prędkością 6000 rpm, a następnie zawieś bakterie w HBSS w stosunku 100:3 (LB: HBSS). Na przykład:
Każde 50 ml hodowli LB zostanie zawieszone w 1,5 ml HBSS. - W celu podania do zwierząt przez żołądek, dodatkowo rozcieńcz hodowlę bakteryjną w stosunku 1:10. Na przykład:
Każde 1,5 ml hodowli LB zostanie zawieszone w 15 ml HBSS.
2. Model zakażenia Salmonella*
- Przygotuj roztwór streptomycyny. Każdemu myszowi podaje się 7,5 mg streptomycyny w 100 μl HBSS. Na przykład, przygotuj łącznie 90 mg streptomycyny w 1,2 ml HBSS dla 10 myszy. Zawsze przygotuj nieco większą objętość roztworu streptomycyny.
- Odebrać wodę i pokarm 4 godziny przed podaniem doustnym przez sondę.
- Podaj myszom streptomycynę za pomocą sondy doustnej w dawce 7,5 mg streptomycyny (100 μl HBSS dla myszy kontrolnych). Chwyć mocno skórę nad barkiem myszy kciukiem i palcem środkowym, a palcem wskazującym wyprostuj głowę i szyję, aby przełyk był prosty. Wprowadź kulkowy koniec igły do karmienia wzdłuż podniebienia, skieruj ją ku prawej stronie gardła, a następnie ostrożnie przesuń w dół przez przełyk i wstrzyknij 100 μl roztworu. Nie powinno być odczuwalnego oporu.
- 20 godzin po podaniu streptomycyny ponownie odebrać wodę i pokarm przed zakażeniem myszy bakteriami.
- Podaj każdej myszy 100 μl zawiesiny w HBSS lub roztwór sterylnego HBSS (grupa kontrolna) za pomocą sondy doustnej. Procedura podawania jest taka sama jak w punkcie 2.3) podawanie streptomycyny.
*Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono z wykorzystaniem samiczych myszy C57BL/6 pozbawionych określonych patogenów (Taconic, Hudson, NY), w wieku 6–7 tygodni, zgodnie z wcześniejszym opisem1. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu w Rochester (UCAR).
3. Wykrywanie Salmonella w jelitach.
- Zbierz mysie odchody (około 100 mg).
- Przenieś próbkę odchodów do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml roztworu PBS i intensywnie wortexuj.
- Wirowanie przez 10 minut przy 800 rpm. Przenieś supernatant do czystej rurki mikrowirówki.
- Wirowanie przy 6000 rpm przez 5 minut. Odrzuć supernatant i dodaj 200 μL roztworu PBS do osadu, następnie wortexuj.
- Przenieś 200 μl roztworu PBS na płytę BBL CHROMagar za pomocą jednorazowego rozsmarowacza komórek w celu wykrycia Salmonella. Gatunki Salmonella wyglądają na malinowo-fioletowe (od odcienia różowego do fioletowego, patrz ryc. 1). Jeśli 200 μl daje zbyt wiele kolonii na płycie, użyj 100 μl lub 50 μl do rozsmarowania.
4. Przykładowe wyniki.
Gdy protokół zostanie wykonany poprawnie, kolonizację przez Salmonella typhimurium można wykryć w jelitach myszy przez ponad 6 miesięcy. Salmonella może być wykrywana metodą posiewu kału przez ponad 6 miesięcy (Fig.1). Typowym przebiegiem tego modelu są utrata masy ciała i śmierć w ciągu 4 tygodni po zakażeniu. W zależności od szczepów Salmonella użytych do zakażenia, niektóre myszy mogą nie przeżyć ponad 6 miesięcy.
Rycina 1. Prątki Salmonella w jelicie z gatunku Salmonella mają kolor szarofioletowy (od różowego do fioletowego) z powodu różnic metabolicznych w obecności wybranych chromogenów. Inne bakterie są albo hamowane, albo tworzą kolonie niebiesko-zielone lub bezbarwne.
Rycina 2. Proporcje przeżycia myszy zainfekowanych mutantycznym szczepem Salmonella PhoPc, PhoPc AvrA-, PhoPc AvrA-/AvrA+ oraz PhoPc AvrA przez 4 tygodnie (28 dni).
Tabela 1. Masa ciała myszy zakażonych Salmonella przez 4 tygodnie.
| 0 | 1 tydzień | 2 tygodnie | 3 tygodnie | 4 tydzień | |
| kontrola | 16,78 ± 1,05 | 16,91 ± 1,28 | 18,26 ± 1,23 | 19,31 ± 1,26 | 20,26 ± 1,15 |
| PhoPc | 16,89 ± 1,03 | 17,14 ± 1,19 | 17,43 ± 1,63* | 18,68 ± 1,78 | 20,05 ± 1,11 |
| PhoPcAvrA- | 16,91 ± 1,12 | 16,96 ± 1,39 | 17,06 ± 2,14** | 18,71 ± 2,18 | 20,15 ± 1,56 |
| PhoPc AvrA-/AvrA+ | 16,94 ± 0,96 | 17,17 ± 1,02 | 17,63 ± 1,42* | 18,44 ± 2,03 | 20,09 ± 1,17 |
*w porównaniu do grupy kontrolnej, p<0,05
** w porównaniu do grupy kontrolnej, p<0,01
Tabela 2. Salmonella wykorzystane w tym badaniu.
| Nazwa | Opis | Źródło lub referencja |
| Salmonella 14028s | Dziki typ S. typhimurium | ATCC |
| PhoPc | Mutant regulatora złożonego niemalujący | Miller et al., 1990 |
| PhoPc AvrA- | Mutacja AvrA- | Collier-Hyams et al., 2002 |
| PhoPcAvrA-/AvrA+ | PhoPcAvrA- z uzupełniającym plazmidem kodującym AvrA | Collier-Hyams et al., 2002 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby korzystać z tego systemu, badacz musi nauczyć się techniki gavage u zwierząt. Szczegółowo opisujemy metodologię przygotowania hodowli bakteryjnej oraz podawania jej myszom drogą gavage. Pokazujemy również, jak monitorować obecność Salmonella w przewodzie pokarmowym (GI). Krytyczne kroki w tym protokole obejmują:
- Obróbka wstępna streptomycyną: Obróbka wstępna streptomycyną pozwala na usunięcie części komensalnej flory jelitowej i zwiększenie podatności myszy na zakażenie Salmonella
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana grantem NIDDK KO1 DK075386 oraz grantem American Cancer Society RSG-09-075-01-MBC przyznanym Jun Sun.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Pożywka Luria-Bertani | BD Biosciences | 244610 | |
| Igła do podawania pokarmu | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycyna | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Jednorazowe rozprowadzacze do komórek | Biologix Research Company | 65-1010 |
Bibliografia
- Duan, Y. beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation. Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).
- Barthel, M. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
- Miller, S. I., Mekalanos, J. J. Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).
- Valdez, Y. Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection. Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).
- Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice. PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).
- Dangl, J. L. Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host. Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).
- Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).
- Townsend, P., Morton, D. B. Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom. ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane endpoints for infectious disease animal models. ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).
- Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination. Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).
- Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
- Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. Development of a murine model of chronic Salmonella infection. Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).
- Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo. PLoS ONE. , Forthcoming (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
