Przewlekły model myszy zakażony salmonellą

Podsumowanie

Ustal model myszy przewlekle zakażonej bakteryjnie z uporczywą kolonizacją Salmonella typhimurium w jelicie przez 27 tygodni.

Streszczenie

Model myszy zakażony bakteryjnie jest potężnym systemem modelowym do badania takich obszarów, jak infekcja, zapalenie, immunologia, transdukcja sygnału i nowotworzenie . Wielu badaczy wykorzystało zapalenie jelita grubego wywołane przez Salmonellę typhimurium do badań nad wczesną fazą zapalenia i infekcji. Jednak tylko nieliczne doniesienia dotyczą przewlekłej infekcji in vivo. Myszy z Salmonellą utrzymującą się w przewodzie pokarmowym pozwalają nam badać długoterminową interakcję gospodarz-bakteria, transdukcję sygnału i nowotworzenie . Ustaliliśmy przewlekły model myszy zakażony bakteryjnie z kolonizacją Salmonella typhimurium w jelicie myszy przez 6 miesięcy. Aby korzystać z tego systemu, badacz musi nauczyć się, jak przygotować kulturę bakteryjną i zgłębnikować zwierzęta. Szczegółowo opisujemy metodologię przygotowania hodowli bakteryjnej i myszy z zgłębnika. Pokazujemy również, jak wykryć utrzymywanie się Salmonelli w przewodzie pokarmowym. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pomoże naukowcom wykorzystującym model myszy zakażonej bakteryjnie odpowiedzieć na fundamentalnie ważne pytania biologiczne i mikrobiologiczne.

Protokół

Ten protokół obejmuje trzy części: hodowlę bakterii, zgłębnik myszy i wykrywanie Salmonelli.

1. Warunki wzrostu salmonelli.

1. Przygotuj talerz bulionu Salmonella Luria-Bertani (LB), inkubuj w temperaturze 37°C przez noc.
2. Pobrać klon z płytki LB i umieścić w 7 ml LB w probówce o pojemności 12 ml i wstrząsać w temperaturze 37°C przez około 5 godzin.
3. Zaszczepić 50 ml LB 0,05 ml kultury w fazie stacjonarnej i inkubować w temperaturze 37°C bez wstrząsania przez około 18 godzin.
4. Wirować przez noc kulturę bakteryjną w temperaturze pokojowej z prędkością 6000 obr./min przez 10 minut, zawiesić bakterie w HBSS w stosunku 100:3 (LB: HBSS). Na przykład:
   Każda kultura LB o pojemności 50 ml zostanie zawieszona w 1,5 ml HBSS.
5. W przypadku zgłębnika zwierzęcego należy dodatkowo rozcieńczyć kulturę bakteryjną w stosunku 1:10. Na przykład:
   Każda kultura 1,5 ml LB zostanie zawieszona w 15 ml HBSS.

2. Model zakażenia salmonellą*.

1. Przygotować roztwór streptomycyny. Każda mysz otrzyma 7,5 mg streptomycyny w 100 μl HBSS. Na przykład przygotuj łącznie 90 mg streptomycyny w 1,2 ml HBSS dla 10 myszy. Zawsze miej trochę dodatkowej objętości podczas przygotowywania roztworu streptomycyny.
2. Pobrać wodę i pokarm na 4 godziny przed doustnym leczeniem przez zgłębnik.
3. Myszy z zgłębnikiem ze streptomycyną z 7,5 mg streptomycyny (100 μl HBSS dla myszy kontrolnych). Chwyć mocno skórę nad ramieniem myszy kciukiem i środkowym palcem, rozciągnij głowę i szyję palcem wskazującym, aby wyprostować przełyk. Skieruj końcówkę kulkową igły do karmienia wzdłuż podniebienia i w kierunku prawej strony tylnej części gardła, a następnie delikatnie przejdź do przełyku i wstrzyknij 100 μl roztworu. Nie powinno być odczuwalnego żadnego oporu.
4. Po 20 godzinach od leczenia streptomycyną należy ponownie pobrać wodę i pokarm, zanim myszy zostaną zakażone bakteriami.
5. Zgłębnik każdej myszy za pomocą 100 μl zawiesiny w HBSS lub poddany jałowemu HBSS (kontrola) za pomocą zgłębnika doustnego. Procedura zgłębnika jest taka sama, jak u myszy z 2,3) zgłębnikiem ze streptomycyną.

*Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono przy użyciu samic myszy C57BL/6 (Taconic, Hudson, NY), które miały 6-7 tygodni, jak opisano wcześniej¹. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu w Rochester (UCAR).

3. Wykrycie Salmonelli w jelicie.

1. Zbierz kał myszy (około 100 mg).
2. Przenieś próbkę kału do 1,5 mikroprobówki wirówkowej z 1 ml PBS i energicznie wiruj.
3. Wirować przez 10 minut przy 800 obr./min. Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrofuge.
4. Wirowanie przy 6000 obr./min przez 5 min. Supernatant jest odrzucany i dodawany do granulek dodaje się 200 μl PBS i wiruje.
5. Przetrzyj 200 μl PBS jednorazowym rozsiewaczem komórek na płytce BBL CHROMagar, aby wykryć Salmonellę. Gatunki Salmonelli wydają się fioletowe (różowe do fioletowych, patrz ryc.1). Jeśli 200 μl daje zbyt wiele kolonii na płytce, użyj 100 μl lub 50 μl na smugę.

4. Reprezentatywne wyniki.

Gdy protokół zostanie wykonany poprawnie, kolonizacja Salmonella typhimurium może zostać wykryta w jelicie myszy w ciągu 6 miesięcy. Salmonellę można było wykryć na podstawie posiewu kału w ciągu 6 miesięcy (ryc. 1). Typowym wyjściem tego modelu jest utrata masy ciała i śmierć w ciągu 4 tygodni po zakażeniu. W zależności od szczepów Salmonelli używanych do infekcji, niektóre myszy mogą nie przeżyć dłużej niż 6 miesięcy.

Rysunek 1. Salmonella jelitowa w gatunkach Salmonelli ma kolor fioletowy (od różowego do fioletowego), ze względu na różnice metaboliczne w obecności wybranych chromogenów. Inne bakterie są albo hamowane, albo wytwarzają niebiesko-zielone lub bezbarwne kolonie.

Rysunek 2. Proporcje przeżywalności myszy zakażonych zmutowanym szczepem Salmonelli PhoP^c, PhoP^c AvrA- i PhoP^c AvrA-/AvrA+, PhoP^c AvrA przez 4 tygodnie (28 dni).

Tabela 1. Masa ciała myszy zakażonych Salmonellą przez 4 tygodnie.

  0 1 tydzień 2 tygodnie 3 tygodnie 4 tydzień kontrola godz. 16.78 ± 1.05 16,91 ± 1,28 18.26 ± 1.23 19.31 ± 1.26 20,26 ± 1,15 PhoP^c 16.89 ± 1.03 17,14 ± 1,19 17,43 ± 1,63* 18,68 ± 1,78 20.05 ± 1.11 PhoP^cAvrA- 16,91 ± 1,12 16,96 ± 1,39 17.06 ± 2.14** 18,71 ± 2,18 20,15 ± 1,56 PhoP^c AvrA-/AvrA+ 16,94 ± 0,96 17.17 ± 1.02 17,63 ± 1,42* 18.44 ± 2.03 20.09 ± 1.17

*w porównaniu z grupą kontrolną p<0,05
** w porównaniu z grupą kontrolną p<0,01

Tabela 2. Szczepy Salmonelli użyte w tym badaniu.

nazwa opis Odniesienie lub źródło Salmonella 14028s Typ dziki S. typhimurium Kontroler ATCC (Kontroler T PhoP^c Niepatogenny mutant regulatora kompleksu Miller i wsp., 1990 PhoP^c AvrA- Mutacja AvrA Collier-Hyams i wsp., 2002 PhoP^cAvrA-/AvrA+ PhoP^cAvrA- z kodowaniem plazmidu z complemented AvrA Collier-Hyams i wsp., 2002

Dyskusja

Aby korzystać z tego systemu, konieczne jest, aby badacz nauczył się, jak zwierzbnąć zwierzęta. Szczegółowo opisujemy metodologię przygotowania kultury bakteryjnej i pobrania zgłębników myszy. Pokazujemy również, jak monitorować utrzymywanie się Salmonelli w przewodzie pokarmowym (GI). Krytyczne kroki w tym protokole, w tym:

1. Wstępne leczenie streptomycyną: Wstępne leczenie streptomycyną może pozbyć się części komensalnej flory jelitowej i sprawić, że myszy będą podatne na zakażenie Salmonellą <...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HBSS	Sigma-Aldrich	ABCD1234
Rosół Luria-Bertani	BD Biosciences	244610
Igła do karmienia	Popper & Synowie, Inc.	7920
Streptomycyna	MP Biomedicals	100556
BBL CHROMagar Salmonella	BD Biosciences	214983
Jednorazowe rozsiewacze komórek	Biologix Research Company	65-1010