Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Podsumowanie

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Streszczenie

Zarodkowe komórki nabłonkowe stanowią idealny model do badania morfogenezy, podczas której wielokomórkowe tkanki przechodzą zmiany geometrii, takie jak zmiany powierzchni komórki i wysokości komórki, a komórki przechodzą mitozę i migrują. Co więcej, komórki nabłonkowe mogą również regulować ruchy morfogenetyczne w sąsiednich tkankach¹Tradycyjna metoda badania komórek i tkanek nabłonkowych obejmuje fiksację chemiczną oraz metody histologiczne w celu określenia morfologii komórek lub lokalizacji konkretnych białek będących przedmiotem zainteresowania. Podejścia te pozostają użyteczne i dostarczają „migawek” kształtów komórek oraz architektury tkanek, jednak wiele kwestii dotyczących tego, w jaki sposób komórki nabywają specyficzne kształty, jak różne białka przemieszczają się lub lokalizują w konkretnych pozycjach oraz jakimi drogami komórki zmierzają ku swojemu ostatecznemu zróżnicowanemu przeznaczeniu, wciąż wymaga wyjaśnienia. Obrazowanie żywych komórek o wysokiej rozdzielczości uzupełnia metody tradycyjne i pozwala na bardziej bezpośrednie badanie dynamicznych procesów komórkowych zaangażowanych w tworzenie, utrzymanie i morfogenezę wielokomórkowych płatów nabłonkowych. W niniejszym materiale prezentujemy metody eksperymentalne, poczynając od izolacji tkanek czapki zwierzęcej zXenopus laeviszarodki do obrazowania konfokalnego komórek nabłonkowych oraz proste podejścia pomiarowe, które razem mogą wzbogacić badania molekularne i komórkowe morfogenezy nabłonka.

Protokół

Przed rozpoczęciem

1. Zsyntetyzować mRNA z czapeczką z linearyzowanego matrycowego DNA kodującego białko z tagiem fluorescencyjnym i oczyścić mRNA standardowymi metodami (AmpliCap Transcription kit; Epicentre Biotechnologies, Madison WI). mRNA należy rozdzielić na alikwoty do jednorazowego użycia w probówkach wirówkowych 0,2 ml i przechowywać w temperaturze -80°C.
2. Standardowe metody pozyskiwania jaj, zapłodnienia in vitro oraz usuwania otoczki jaj zostały opisane wcześniej². Procedura pozyskiwania jaj od samicy żaby Xenopus laevis została zaprezentowana wcześniej³. Zapłodnić jaja in vitro niezwłocznie po ich pobraniu od samic żab, wykorzystując jądra wcześniej wyizolowane od samca żaby. Usunąć galaretowatą otoczkę z jaj 20 minut po zapłodnieniu i natychmiast wstrzyknąć mRNA, białko, DNA lub dekstran, aby umożliwić wystarczającą dyfuzję wstrzykniętych reagentów. Iniekcje wykonane więcej niż 1 godzinę po zapłodnieniu często nie dyfundują z miejsca wstrzyknięcia.
3. Mikroiniekcję oocytów zaprezentowano wcześniej⁴ z użyciem injektora sterowanego zaworem ciśnieniowym (PLI-100, Harvard Apparatus). Zastosować podobną metodę w celu wstrzyknięcia mRNA do półkuli zwierzęcej embrionów żaby w stadium od 1 do 4 komórek. Przenieść zapłodnione embriony do 3% Ficoll (Sigma, St. Louis MO) w 1x MBS (MBS-Ficoll) i wykonać mikroiniekcję pożądanej objętości (2 do 4 nl) mRNA z czapeczką kodującego GFP kierowane do błony (mem-GFP) lub F-aktyny (moe-GFP). Aby uzyskać równomierny rozkład, wstrzyknąć mRNA w 4 równomiernie rozmieszczonych miejscach w biegunie zwierzęcym. Embriony mogą pozostawać w MBS-Ficoll przez kilka godzin, ale muszą zostać przeniesione do 1/3 x MBS przed rozpoczęciem gastrulacji.

Wymagane materiały (pozycje oznaczone * są przedstawione na rys. 1):

1. Stereomikroskop do sekcji z oświetleniem światłowodowym. Zalecany, choć opcjonalny, jest chłodzony stół sekcyjny.
2. Narzędzia do manipulacji włosami (nóż i pętla do włosów)*.
3. Pęsety (Dumont #5 ze stali nierdzewnej; Fine Science Tools, Foster City, CA)*.
4. Modyfikowana sól Bartha jako pożywka do hodowli embrionów (MBS; 88 mM NaCl, 2.4 mM NaHCO₃, 1 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.41 mM (CaNO₃)₂, 0.82 mM MgSO₄, 10 mM HEPES (H3375, Sigma-Aldrich, St. Louis MO)).
5. Pożywka Danilchika dla eksplantów Amy (DFA; 53 mM NaCl₂, 5 mM Na₂CO₃, 4.5 mM gluconian potasu, 32 mM gluconian sodu, 1mM CaCl₂, 1mM MgSO₄). Do DFA należy dodać 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA; A7906, Sigma-Aldrich). Pożywka DFA musi zostać przefiltrowana sterylnie, ale może być rozdzielona na aliquoty w stożkowych probówkach 50 ml i przechowywana w temperaturze -20°C. Aby zapobiec wzrostowi bakterii lub grzybów, do świeżo rozmrożonego DFA należy dodać antybiotyki i środki przeciwgrzybicze (0,8% w pożywce; A5955, Sigma-Aldrich).
6. Szalki Petriego o średnicy 60 lub 100 mm*.
7. Duże szkiełka nakrywowe, 45 na 50 mm (12-544-F, #1.5; Fisher Scientific, Hampton, NH)*.
8. Małe szkiełka nakrywowe, 24 na 40 mm (12-544C, #1.5; Fisher Scientific).
9. Smar silikonowy (High Vacuum, Dow Chemical) umieszczony w strzykawce typu „pistolet do uszczelniacza”*.
10. Dedykowane komory akrylowe lub nylonowe podkładki (Small Parts Inc.; Miramar, FL)*. Dedykowane komory mogą zostać wyfrezowane w warsztacie z bloku akrylowego o wymiarach 25 na 50 na 5 mm, aby uzyskać wewnętrzną komorę o wymiarach 1,2 cm na 2,8 cm. Objętość robocza tej komory wynosi 1,68 ml. Opcjonalne podkładki nylonowe mogą być dobierane w różnych rozmiarach; preferowane są rozmiary kompatybilne z okrągłymi szkiełkami nakrywowymi o średnicy 18 mm.
11. Rylec diamentowy*.

Część 1: Wycinanie eksplantów zwierzęcego czepka

1. Hodować zarodki do pożądanego stadium⁵ w 1/3 x MBS. Tempo rozwoju można kontrolować, utrzymując temperaturę hodowli między 15 a 21°C, aby eksperymenty można było przeprowadzić w dogodnej porze dnia. Można stosować temperaturę pokojową, lecz zarodki będą rozwijać się szybciej.
2. Przenieść zarodki do DFA.
3. Usunąć błony witelinowe za pomocą pęsety.
4. Pod stereomikroskopem sekcyjnym wyciąć eksplanty z czapy zwierzęcej, używając noży i pętli z włosia⁶. Pętli z włosia należy użyć do podtrzymania lub unieruchomienia zarodka w odpowiedniej pozycji, a noża z włosia do wykonania małego nacięcia w biegunie zwierzęcym zarodka. Należy wykonywać powtarzalne, krótkie cięcia nożem z włosia, aby wykonać nacięcie 360°, umożliwiające usunięcie ektodermy czapy zwierzęcej z zarodka. Wraz z praktyką można wykonywać gładkie cięcia, które minimalizują uszkodzenia eksplantu lub lizę komórek na marginesie (Rys. 2A).
5. Powtórzyć krok 4, aby wyciąć od 3 do 4 eksplantów czapy zwierzęcej, a następnie przejść do Części 2. Wycinanie eksplantów musi być szybkie, ponieważ mają one tendencję do szybkiego zwijania się w kulkę. Chłodzony stół sekcyjny może spowolnić ten proces lub alternatywnie można przygotować mniejszą liczbę eksplantów.

Część 2: Przygotowanie komór, załadowanie eksplantatów i uszczelnienie komory do długoterminowej hodowli

1. Użyć smaru silikonowego, aby przykleić lub uszczelnić komorę akrylową do dużego szkiełka nakrywki.
2. Aby zmniejszyć przyleganie eksplantów do szkła, należy pokryć wnętrze komory podłożem nieprzylegającym, inkubując komorę przez 2 do 4 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C z 1% BSA w 1/3 x MBS (BSA-MBS).
3. Przygotować małe fragmenty szkiełek nakrywkowych (ok. 2 na 8 mm) za pomocą ołówka diamentowego. Fragmenty należy wcześniej pokryć BSA-MBS.
4. Wypłukać BSA-MBS z komory i zastąpić medium DFA.
5. Wyciąć eksplanty czapki zwierzęcej (Część 1; Rys. 2A) i przenieść je do komory. Każdy eksplant należy ustawić za pomocą pętli z włosa (warstwą nabłonkową skierowaną w stronę dna komory) i delikatnie przymocować eksplant na miejscu za pomocą fragmentu szklanej nakrywki przytrzymywanej niewielkimi kropkami smaru wysokopróżniowego (Rys. 2B). Należy zachować szczególną ostrożność podczas dociskania nakrywki, ponieważ nadmierny nacisk może łatwo zmiażdżyć eksplant. W każdej komorze można umieścić wiele eksplantów, w zależności od rozmiaru użytych fragmentów małych szkiełek nakrywkowych służących do ich stabilizacji. Dzięki praktyce w opisanej tutaj komorze akrylowej można umieścić do 20 eksplantów. Napełnić komory DFA aż do poziomu otworu u góry. Użyć smaru silikonowego, aby uszczelnić górę komory szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 na 40 mm. Dodać lub usunąć DFA, aby zredukować pęcherzyki powietrza w uszczelnionej komorze, a następnie osuszyć nadmiar cieczy z komory.
6. Taka uszczelniona komora umożliwi długoterminową hodowlę i obrazowanie na żywo eksplantów czapki zwierzęcej przez dużą, dolną szklaną powierzchnię komory. Jest niezwykle ważne, aby dolna szklana powierzchnia komory pozostała wolna od zabrudzeń, smaru lub mediów w celu późniejszego obrazowania. Zaleca się przygotowanie naczyń Petriego wyścielonych ręcznikiem papierowym do przechowywania komór podczas przygotowywania ich do obrazowania.

Część 3: Konfokalna mikroskopia obrazowania na żywo w wysokiej rozdzielczości

Protokół w tej sekcji został opracowany z wykorzystaniem mikroskopu konfokalnego dostępnego w naszym laboratorium (Leica TCS SP5; Leica Microsystems, Bannockburn IL). Inne mikroskopy konfokalne mogą wymagać niewielkich modyfikacji, dlatego zalecamy użytkownikom stosowanie się do odpowiednich instrukcji obsługi poszczególnych urządzeń.

1. Włącz system obrazowania, zainicjuj stół mikroskopu i uruchom lasery odpowiednie dla użytych fluoroforów, tj. laser argonowy dla fluoresceiny lub EGFP oraz laser HeNe 543 nm dla rodaminy lub RFP.
2. Umieść komorę z eksplantatami na stole mikroskopu. Przed ustawieniem komory wprowadź na miejsce odpowiedni obiektyw. Do wstępnego obrazowania zalecamy stosowanie obiektywu powietrznego 20x o wysokiej aperturze numerycznej (0.7 n.a.); do obrazowania o wysokiej rozdzielczości i śledzenia dużych pól komórkowych zalecamy obiektywy olejowe 40x lub 63x o n.a. 1.4. (uwaga: po nałożeniu oleju imersyjnego na obiektyw należy zachować ostrożność przy korzystaniu z obiektywu powietrznego, aby nie zanurzyć go przypadkowo w oleju). Użyj małych obciążeń, aby utrzymać komorę na miejscu.
3. Użyj oświetlenia w polu jasnym lub fluorescencyjnego i reguluj ostrość, aż zobaczysz końce apikalne komórek powierzchownych. Uważaj, aby nie „uderzyć” obiektywem w podstawę komory. Unikaj wprowadzania lub tworzenia pęcherzyków powietrza podczas korzystania z obiektywów imersyjnych olejowych. Po ustawieniu próbek w trybie pozycjonowania „grubego” (coarse), przełącz się na tryb pozycjonowania „precyzyjnego” (fine).
4. Zalecenia dotyczące strojenia mikroskopu konfokalnego do obrazowania żywych komórek:
   1. Moc lasera powinna być utrzymywana na możliwie najniższym poziomie: 1) aby zapobiec blaknięciu (bleachingowi), 2) aby zapobiec efektom fototoksycznym oraz 3) aby uniknąć przypadkowego wywołania zmiany kształtu komórek⁷. Wymagana moc lasera różni się w zależności od poziomu ekspresji i rodzaju reporterów molekularnych wyrażanych w embrionach.
   2. Do obrazowania żywych komórek stosuj format skanowania 1024 na 1024 piksele, ponieważ zapewnia on dobrą rozdzielczość obrazu. Jeśli wymagana jest bardzo wysoka częstotliwość klatek (minimum dla naszego systemu to 1.3 s), zastosuj format skanowania 512 na 512 pikseli. Zmniejszy to rozdzielczość obrazu, ale wciąż może być to wystarczające do wyodrębnienia rozsądnej ilości informacji.
   3. Dostosuj zakres spektralny filtrów emisyjnych, dichroicznych i wzbudzeń w zależności od potrzeb.
   4. Ustaw otwór pinhole konfokalu w zakresie od 1 do 1.5 jednostek Airy’ego.
   5. Wzmocnienie fotopowielacza (gain) musi być utrzymywane na minimalnym poziomie, aby zredukować szum, zapewniając jednocześnie wystarczający sygnał do identyfikacji struktur komórkowych i lokalizacji białek.
   6. Wyreguluj offset poziomu czerni, aby dostosować tło i poprawić jakość obrazów.
   7. Kroki od (1) do (6) stosuje się iteracyjnie, aby uzyskać obraz możliwie najwyższej jakości. Obrazy wysokiej jakości powinny rozdzielać strukturę lub zlokalizowane białka z intensywnością pikseli w szerokim zakresie dynamicznym. Jeśli celem są analizy ilościowe, liczba pikseli o zerowej intensywności lub nasyconych powinna być minimalna.
   8. Kroki (1), (3), (5) i (6) należy powtórzyć dla każdego dodatkowego kanału fluorescencji, aby uzyskać obraz możliwie najlepszej jakości.
   9. Podczas obrazowania dwóch lub więcej sond fluorescencyjnych ważne jest zapewnienie minimalnego przenikania spektralnego (bleed-through) z widma emisji jednego białka do widma drugiego białka. Przenikanie można sprawdzić, zmniejszając moc lasera wzbudzającego pierwsze białko i obserwując sygnał generowany na długościach fal używanych dla drugiego białka. Przenikanie spektralne można ograniczyć poprzez bardziej rygorystyczny dobór filtrów lub poprzez zmniejszenie mocy lasera używanego do wzbudzenia i zwiększenie wzmocnienia (gain) używanego do detekcji pierwszego białka.
5. Po zestrojeniu mikroskopu konfokalnego zgodnie z tymi wytycznymi możliwe powinno być przechwytywanie pojedynczych obrazów w jednej głębokości ogniskowej w trybie X-Y (Rys. 3A).
6. W przypadku chęci zarejestrowania filmów time-lapse dynamicznie zachodzącego procesu, takiego jak zmiana kształtu podczas kurczenia się komórek⁷, należy wybrać jeden z następujących alternatywnych trybów konfokalnych:
   1. X-Y-T: Tryb ten pozwala na gromadzenie serii obrazów w czasie, bez zmiany płaszczyzny Z. Używamy tego trybu do obserwacji endogennych fluktuacji w komórkach nabłonkowych. Zazwyczaj rejestrujemy jedną klatkę co 5 sekund przez 20 minut, aby obserwować zmienność endogenną lub zmiany kształtu wywołane zewnętrzną stymulacją komórek nabłonkowych. Wybór częstotliwości klatek zależy całkowicie od tego, co chcemy zaobserwować i jak dynamiczny jest dany proces.
   2. X-Y-Z: Korzystając z tego trybu, możemy zebrać pojedynczy stos serii Z przez komórki nabłonkowe. Nasze domyślne ustawienia do zbierania serii Z to kroki 0.1 μm w zakresie 5 μm. Używamy tego trybu, aby ustalić, czy zmiany cytoszkieletu zachodzą tylko w określonych pozycjach, np. na poziomie złączy przylegających, czy w całej korze komórkowej.
   3. X-Z-T (Rys. 3A'): Tryb ten jest stosowany głównie do obserwacji szybkich zmian w organizacji apikalno-bazalnej komórek w nabłonku. Tryb ten jest popularny ze względu na użyteczność w potwierdzaniu, że tryb X-Y-T jest wiarygodnym wskaźnikiem zmian w domenie apikalnej komórki i że akwizycja obrazu konfokalnego nie dryfuje wzdłuż osi Z.
   4. X-Y-Z-T: Łączy tryby X-Y-Z i X-Y-T. Tryb ten może dostarczyć szczegółowych informacji o pełnej dynamice apikalno-bazalnej nabłonka, ale akwizycja pełnych stosów obrazów jest powolna i może znacznie obniżyć żywotność komórek ze względu na fotoblaknięcie i efekty fototoksyczne.
7. Jakość obrazu można w ograniczonym stopniu poprawić, stosując jedną z czterech poniższych metod lub ich kombinację: 1) uśrednianie linii (line averaging), 2) akumulację linii (line accumulation), 3) uśrednianie klatek (frame averaging) oraz 4) akumulację klatek (frame accumulation). Te tryby uśredniania podczas akwizycji mogą poprawić jakość obrazu, ale zmniejszą żywotność komórek i wydłużą czas zbierania obrazów.
8. Po dokładnym dostrojeniu wszystkich ustawień należy zebrać i zapisać obrazy, serie Z oraz dane z serii czasowych na zewnętrznym dysku twardym, pamięci USB lub serwerze sieciowym.
9. Po zakończeniu eksperymentu, ze względów bezpieczeństwa opuść obiektyw, usuń olej z obiektywu i stołu mikroskopu za pomocą papieru do soczewek, a następnie wyłącz system konfokalny.

Część 4: Obrazowanie na żywo mikrofilamentów F-aktyny

Jak pokazano w Części 3, białko lokalizujące się w błonie mem-GFP może być wykorzystane do fluorescencyjnego znakowania błon komórkowych. Obrazowanie żywych komponentów wewnątrzkomórkowych uzyskuje się przy użyciu innych białek. Białko takie jak moesin-GFP, zawierające domenę wiążącą F-aktynę, może być użyte do znakowania F-aktyny w żywych komórkach. Podobne strategie obrazowania żywych komórek i zbierania sekwencji time-lapse opierają się na procedurach opisanych w części 3. Obrazowanie żywej F-aktyny wymaga większych umiejętności mikroskopowych niż obrazowanie mem-GFP, ponieważ struktury te są drobniejsze i bardziej ściśle zlokalizowane niż błona. Na przykład wszelkie małe pęcherzyki powietrza w oleju imersyjnym mogą powodować artefakty aberracyjne, takie jak rozmycie lub zmienna jasność na przechwyconym obrazie. Ponadto każdy niewielki dryf w płaszczyźnie ogniskowej lub płaszczyźnie Z może spowodować, że znakowana moesin-GFP korowa F-aktyna wyjdzie poza obszar ostrości. Dlatego należy podwoić wysiłki w celu stabilizacji stolika, eksplantu i komory podczas obrazowania korowej F-aktyny oraz innych białek wewnątrzkomórkowych. Przykłady obrazów X-Y oraz X-Z-T przedstawiające znakowaną moesin-GFP F-aktynę znajdują się na rysunkach (Ryc. 3B i B').

Część 5: Analiza obrazu

Obrazy oraz sekwencje time-lapse uzyskane podczas sesji konfokalnej na żywych komórkach można analizować w celu zweryfikowania hipotez dotyczących zmian kształtu lub wzorców lokalizacji białek. Analiza jakościowa często opiera się na obserwacji gołym okiem, jednak można ją rozszerzyć lub zautomatyzować za pomocą technik analizy obrazu w celu wyekstrahowania danych ilościowych. Dane obrazowe z systemów konfokalnych Leica mogą być zapisywane w otwartym formacie, takim jak pliki obrazów .TIF, lub w autorskim formacie .LIF, który zachowuje szczegółowe informacje o parametrach mikroskopu podczas akwizycji. Pliki .TIF oraz .LIF mogą być bezpośrednio importowane do bezpłatnego programu do analizy obrazu Image J (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2009) przy użyciu wtyczki Bio-Formats (Kevin Eliceiri, LOCI, University of Wisconsin, Madison, WI). W następnej sekcji przedstawiamy dwa przykłady ilustrujące, w jaki sposób użytkownicy mogą rozpocząć ilościową analizę danych z obrazowania konfokalnego.

1. Otwórz dowolny plik .TIF lub .LIF (Ryc. 4 A i A') za pomocą FILE > OPEN
2. Przykład 1: Pomiar pola powierzchni komórki nabłonkowej (Ryc. 4B do B''').
   1. Wybierz AREA w ANALYZE > SET MEASUREMENTS.
   2. Wybierz narzędzie do zaznaczania wielokątów (polygon-selection tool) z paska narzędzi Image J i obrysuj komórkę.
   3. Otwórz ROI Manager z ANALYZE > TOOLS > ROI MANAGER i dodaj obrys, naciskając [control-t], co jest skrótem dodawania każdego nowego obszaru zainteresowania („region of interest” lub ROI) do ROI Managera. Ważne jest dodanie tego zaznaczenia i zapisanie zestawu ROI, ponieważ umożliwia to powrót w późniejszym czasie i wykonanie pomiarów innych parametrów. Zapisane zestawy ROI (kliknij „SAVE”) można ponownie wczytać do dalszej analizy.
   4. Krok (c) można powtórzyć dla dowolnej liczby komórek na obrazie i dodawać ROI do ROI Managera. Po zarejestrowaniu wystarczającej liczby ROI kliknij „MEASURE” w ROI Managerze. W oknie RESULTS można teraz zobaczyć wartości AREAS przypisane do poszczególnych ROI. Wymiary obrazu mają odpowiadające im wartości w parametrach pomiarowych.
3. Przykład 2: Pomiar intensywności błony komórkowej (Ryc. 4C do C''').
   1. Wybierz narzędzie „Straight line” z paska narzędzi Image J i narysuj na obrazie linię prostopadłą do analizowanej błony komórkowej, która ją przecina. To zaznaczenie linii prostej jest kolejnym typem ROI i może zostać dodane do ROI Managera w opisany wyżej sposób.
   2. Wykreśl względne intensywności w jednostkach arbitralnych, wybierając ANALYZE > PLOT PROFILE. Zapisz wynik jako obraz oraz jako listę wartości, klikając odpowiednio SAVE oraz LIST > FILE > SAVE AS w oknie PLOT.
4. Za pomocą Image J można przeprowadzić różnorodne pomiary ilościowe, w zależności od zainteresowań badacza i testowanych hipotez. Do graficznego przedstawienia danych można wykorzystać program Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Seattle, WA) lub Sigma Plot (Systat Software Inc., San Jose, CA). Dodatkowe przykłady analizy obrazów zostały przedstawione wcześniej⁷.

Rycina 1. Wymagane materiały. A) Narzędzia niezbędne do mikrochirurgii i montażu komory hodowlanej. Szalka Petriego (a), duże szkiełko nakrywkowe (b), narzędzia do włosów (c), rysik diamentowy (d), pęseta (e), „pistolet do uszczelniania” z smarem silikonowym (f), podkładka nylonowa (g) oraz wykonana na zamówienie akrylowa komora hodowlana (h). B) Zbliżenie noża do włosów oraz C) pętli do włosów.

Rysunek 2. Wycięcie eksplantów czapki zwierzęcej. A) Schemat manipulacji mikrochirurgicznej stosowanej do usunięcia eksplantu czapki zwierzęcej (d, grzbietowa; v, brzuszna; ah, półkula zwierzęca; vh, półkula roślinna). B) Schemat eksplantu (e) umieszczonego pod fragmentem szkiełka nakrywkowego utrzymywanym w miejscu przez smar silikonowy (s), z powierzchnią apikalną przylegającą do szkła (g) powleczonego BSA. Eksplant jest ustawiony tak, aby warstwa nabłonkowa znajdowała się najbliżej obiektywu mikroskopu (m). C) Eksplant czapki zwierzęcej (czerwona strzałka) hodowany w DFA, umieszczony w komorze akrylowej (niebieska strzałka) na dużym szkiełku nakrywkowym (czarna strzałka) i utrzymywany w miejscu przez fragment szkiełka nakrywkowego oraz smar silikonowy.

Rycina 3. Komórki nabłonka obserwowane za pomocą mikroskopu konfokalnego. A) Widok X-Y oraz widok X-Z (A') warstwy nabłonka znakowanej GFP lokalizującym się w błonie (mem-GFP). B) Widok X-Y oraz widok X-Z (B') apikalnej kory komórkowej z F-aktyną znakowaną moezyną-GFP.

Rysunek 4. Analiza obrazów przy użyciu programu Image J. A) Oryginalny obraz warstwy komórek z GFP zlokalizowanym w błonie. Widok o wysokiej rozdzielczości (A') wstawki z (A) pokazuje dwa „obszary zainteresowania” (ROI). Żółta obrys wskazuje granicę pojedynczej komórki wybranej za pomocą narzędzia wielokąta (patrz panel B), a zielona linia wskazuje przebieg profilu intensywności przez granicę między komórkami, wybraną za pomocą narzędzia linii prostej (patrz panel C). B') Metoda wyboru opcji pomiaru i wybrania parametru „Area” (B''). Po wybraniu ROI można go zapisać w menedżerze ROI (B'''). C') Metoda wyboru opcji pomiaru dla narzędzia profilu. C'') Po wybraniu narzędzia linii prostej lub linii segmentowej, profil intensywności wzdłuż ścieżki można wykreślić za pomocą komendy „Plot profile”. Listę wartości intensywności można również zapisać w formie arkusza kalkulacyjnego.

Dyskusja

Przedstawiliśmy protokoły eksperymentalne regularnie stosowane w naszym laboratorium do obrazowania dynamicznie zmieniającego się cytoszkieletu w apikalnej korze komórkowej oraz oscylujących błon komórkowych komórek nabłonkowych w embrionach Xenopus. Protokoły te należy traktować jako punkt wyjścia do obrazowania na żywo kształtów komórek nabłonkowych; optymalizacja tej procedury jest niezbędna, a niektóre ustawienia będą się różnić w zależności od rodzaju posiadanego systemu mikroskopowego oraz rodzaju białek, ...