Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonka u Xenopus laevis

Summary

Nabłonek embrionalny Xenopus to idealny system modelowy do badania zachowań komórek, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonka. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez obrazowanie konfokalne żywych komórek. Tutaj pokazujemy metody izolowania tkanek żab i wizualizacji żywych komórek nabłonka i ich cytoszkieletu za pomocą mikroskopii konfokalnej żywych komórek.

Abstract

Embrionalne komórki nabłonkowe służą jako idealny model do badania morfogenezy, w której tkanki wielokomórkowe podlegają zmianom w swojej geometrii, takim jak zmiany powierzchni i wysokości komórki, oraz gdzie komórki przechodzą mitozę i migrują. Ponadto komórki nabłonkowe mogą również regulować ruchy morfogenetyczne w sąsiednich tkankach¹. Tradycyjna metoda badania komórek i tkanek nabłonkowych obejmuje utrwalanie chemiczne i metody histologiczne w celu określenia morfologii komórek lub lokalizacji poszczególnych białek będących przedmiotem zainteresowania. Podejścia te są nadal użyteczne i dostarczają "migawek" kształtów komórek i architektury tkanek, jednak wiele pozostaje do zrozumienia na temat tego, jak komórki nabierają określonych kształtów, jak różne białka poruszają się lub lokalizują w określonych pozycjach oraz jakie ścieżki podążają komórki w kierunku ich ostatecznego zróżnicowanego losu. Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości uzupełnia tradycyjne metody, a także umożliwia bardziej bezpośrednie badanie dynamicznych procesów komórkowych zaangażowanych w tworzenie, utrzymanie i morfogenezę wielokomórkowych arkuszy nabłonka. W tym miejscu demonstrujemy metody eksperymentalne, od izolacji tkanek zwierzęcych czapeczek z zarodków Xenopus laevis po obrazowanie konfokalne komórek nabłonka i proste podejścia pomiarowe, które razem mogą wzbogacić molekularne i komórkowe badania morfogenezy nabłonka.

Protocol

Zanim zaczniesz

1. Zsyntetyzuj zaczaplowane mRNA ze zlinearyzowanej matrycy DNA kodującej fluorescencyjnie znakowane białko i oczyść mRNA standardowymi metodami (zestaw do transkrypcji AmpliCap; Epicentre Biotechnologies, Madison WI). mRNA należy podać do jednorazowego użycia w probówkach wirówkowych o pojemności 0,2 ml i przechowywać w temperaturze -80°C.
2. Standardowe metody pozyskiwania komórek jajowych, zapłodnienia in vitro i usuwania okrywy jajowej zostały opisane wcześniej². Procedura pozyskiwania jaj od samicy żaby Xenopus laevis została zademonstrowana wcześniej³. Jaja należy zapłodnić in vitro natychmiast po ich uzyskaniu od samic żab przy użyciu jąder wcześniej wyizolowanych od samca żaby. Usuń galaretki z jaj 20 minut po zapłodnieniu i natychmiast wstrzyknij mRNA, białko, DNA lub dekstran, aby umożliwić wystarczającą dyfuzję mikrowstrzykiwanych odczynników. Wstrzyknięcia wykonane później niż 1 godzinę po zapłodnieniu często nie rozprowadzają się z miejsca wstrzyknięcia.
3. Mikroiniekcja komórek jajowych została zademonstrowana wcześniej⁴ przy użyciu iniektora sterowanego zaworem ciśnieniowym (PLI-100, Harvard Apparatus). Postępuj zgodnie z podobną metodą wstrzykiwania mRNA do półkuli zwierzęcej zarodków żab na etapie od 1 do 4 komórek. Przenieś zapłodnione zarodki do 3% Ficoll (Sigma, St. Louis MO) w 1x MBS (MBS-Ficoll) i mikrowstrzyknij z pożądaną objętością (2 do 4 nl) zamkniętego mRNA kodującego GFP ukierunkowane na błonę (mem-GFP) lub F-aktynę (moe-GFP). Aby uzyskać równomierną dystrybucję, wstrzyknij mRNA w 4 równomiernie rozmieszczone miejsca w biegunie zwierzęcia. Zarodki mogą pozostawać w MBS-Ficoll przez kilka godzin, ale muszą zostać przeniesione do 1/3 x MBS przed rozpoczęciem gastrulacji.

Wymagane materiały (elementy oznaczone * są pokazane na rys. 1):

1. Stereoskop preparacyjny z oświetleniem światłowodowym. Etap rozwarstwiania z chłodzeniem jest zalecany, ale opcjonalny.
2. Narzędzia do włosów (nóż do włosów i pętelka do włosów)*.
3. Kleszcze (Dumont #5 ze stali nierdzewnej; Fine Science Tools, Foster City, Kalifornia)*.
4. Zmodyfikowane pożywki do hodowli zarodków Barth's Saline (MBS; 88 mM NaCl, 2,4 mM NaHCO₃, 1 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,41 mM (CaNO₃)₂, 0,82 mM MgSO₄, 10 mM HEPES (H3375, Sigma-Aldrich, St. Louis MO)).
5. Pożywki eksplantatywne Danilchika dla Amy (DFA; 53 mM NaCl₂, 5 mM Na₂CO₃, 4,5 mM glukonian potasu, 32 mM glukonian sodu, 1mM CaCl₂, 1mM_MgSO4). Włączyć 0,1% albuminy surowicy bydlęcej z DFA (BSA; A7906, Sigma-Aldrich). DFA musi być sterylnie przefiltrowany, ale może być podawany w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i przechowywany w temperaturze -20°C. Antybiotyki i leki przeciwgrzybicze (0,8 % w pożywce; A5955, Sigma-Aldrich) należy dodać do świeżo rozmrożonego DFA w celu zahamowania rozwoju bakterii lub grzybów.
6. Szalki Petriego 60 lub 100 mm*.
7. Duża szklana osłona, 45 na 50 mm (12-544-F, #1.5; Fisher Scientific, Hampton, NH)*.
8. Mała szklana osłona, 24 na 40 mm (12-544C, #1.5; Fisher Naukowy).
9. Smar silikonowy (High Vacuum, Dow Chemical) załadowany do strzykawki "pistolet do uszczelniania"*.
10. Niestandardowe komory akrylowe lub podkładki nylonowe (Small Parts Inc.; Miramar, Floryda)*. Komory niestandardowe można frezować w warsztacie mechanicznym z bloku akrylowego o wymiarach 25 na 50 na 5 mm, aby uzyskać komorę wewnętrzną o wymiarach 1,2 cm na 2,8 cm. Komora ta ma objętość roboczą 1,68 ml. Opcjonalne podkładki nylonowe mogą być wybrane w różnych rozmiarach; Preferujemy rozmiary kompatybilne z okrągłymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 18 mm.
11. Diamentowy ołówek*.

Część 1: Wycięcie eksplantatów z czapek zwierzęcych

1. Hodowla zarodków do pożądanego etapu⁵ w 1/3 x MBS. Tempo rozwoju można kontrolować za pomocą temperatury hodowli od 15 do 21°C, dzięki czemu eksperymenty można przeprowadzić o dogodnej porze dnia. Można stosować temperatury pokojowe, ale zarodki będą rozwijać się szybciej.
2. Transfer zarodków do DFA.
3. Usuń błony witelinowe za pomocą kleszczy.
4. Pod mikroskopem stereoskopowym wyciąć eksplant z czapek zwierzęcych za pomocą noży do włosów i pętli^{do włosów 6}. Użyj pętli do włosów, aby podeprzeć lub przytrzymać zarodek w odpowiedniej pozycji, a noża do włosów, aby wykonać małe nacięcie w zwierzęcym biegunie zarodków. Użyj powtarzających się "ruchów" nożem do włosów, aby wykonać nacięcie 360°, aby usunąć ektodermę kapelusza zwierzęcego z zarodka. Przy nabraniu wprawy można wykonywać gładkie cięcia, które powodują minimalne uszkodzenie eksplantatu lub zlizowanych komórek na brzegu (ryc. 2A).
5. Powtórz krok 4, aby wyciąć od 3 do 4 eksplantatów kapsli zwierzęcych i przejdź do części 2. Należy być szybkim podczas krojenia eksplantatów, ponieważ mają one tendencję do szybkiego zwijania się w kulki. Schłodzony etap rozwarstwiania może spowolnić proces lub alternatywnie można wykonać mniej eksplantatów.

Część 2: Przygotuj komory, załaduj eksplantaty i uszczelnij komorę do długoterminowej hodowli

1. Użyj smaru silikonowego, aby przykleić lub uszczelnić akrylową komorę do dużego szkła nakrywkowego.
2. Aby zmniejszyć przyczepność eksplantatów do szkła, należy pokryć szkło w komorze nieprzywierającym podłożem, inkubując komorę przez 2 do 4 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C z 1% BSA w 1/3 x MBS (BSA-MBS).
3. Przygotuj małe fragmenty szkiełka nakrywkowego (ok. 2 na 8 mm) za pomocą ołówka diamentowego. Wstępnie pokryj fragmenty za pomocą BSA-MBS.
4. Wypłucz BSA-MBS z komory i zastąp media DFA.
5. Eksplantaty kapsli akcyzowej dla zwierząt (część 1; Rys. 2A) i przenieść do komory. Umieść każdy eksplant za pomocą pętli do włosów (z warstwą nabłonka skierowaną do dna komory) i delikatnie przymocuj eksplant na miejscu za pomocą szklanego fragmentu szkiełka nakrywkowego przytrzymywanego małymi kroplami smaru wysokopróżniowego (ryc. 2B). Zachowaj szczególną ostrożność podczas naciskania szkiełka nakrywkowego, ponieważ nadmierny nacisk może łatwo rozbić eksplantat. Do każdej komory można załadować wiele eksplantatów w zależności od wielkości małych fragmentów szkiełka nakrywkowego używanych do utrzymywania eksplantatów na miejscu. Przy odrobinie wprawy do opisanej tutaj komory akrylowej można załadować do 20 eksplantatów. Napełnij komory DFA, aż zrównają się z otworem u góry. Użyj smaru silikonowego, aby uszczelnić górną część komory za pomocą szkła osłonowego o wymiarach 24 na 40 mm. Dodaj lub usuń DFA, aby zmniejszyć pęcherzyki powietrza w szczelnej komorze i przelać się z komory.
6. Ta szczelna komora pozwoli na długoterminową hodowlę i obrazowanie na żywo eksplantatów kapeluszy zwierzęcych przez dużą, dolną szklaną powierzchnię komory. Bardzo ważne jest, aby dolna szklana powierzchnia komory była wolna od brudu, tłuszczu lub mediów do późniejszego obrazowania. Zalecamy przygotowanie szalek Petriego z ręcznikiem papierowym do przechowywania w komorach w takiej postaci, w jakiej są one przygotowywane do obrazowania.

Część 3: Mikroskopia konfokalna obrazowania na żywo w wysokiej rozdzielczości

Protokół w tej sekcji został opracowany do korzystania z mikroskopu konfokalnego dostępnego w naszym laboratorium (Leica TCS SP5; Leica Microsystems, Bannockburn IL). Różne mikroskopy konfokalne mogą wymagać niewielkiej modyfikacji i zalecamy użytkownikom postępowanie zgodnie z odpowiednimi instrukcjami obsługi.

1. Włącz system obrazowania, zainicjuj stolik mikroskopowy i włącz lasery odpowiednie dla fluoroforów, tj. laser Argon dla fluoresceiny lub EGFP oraz laser 543 HeNe dla rodaminy lub RFP.
2. Umieść komorę, w której znajdują się eksplantaty, na stoliku mikroskopu. Przed ustawieniem komory należy umieścić odpowiedni cel na miejscu. Do wstępnego obrazowania zalecamy użycie obiektywu pneumatycznego o dużej aperturze numerycznej 20x (0,7 n.a.); Zalecamy używanie obiektywów olejowych 1,4 n.d. 40x lub 63x do obrazowania w wysokiej rozdzielczości i śledzenia dużych pól komórkowych. (Uwaga: Po nałożeniu olejku immersyjnego na obiektyw należy zachować ostrożność podczas korzystania z obiektywu powietrznego, aby przypadkowo nie zanurzyć obiektywu w oleju.) Użyj małych obciążników, aby utrzymać komorę na miejscu.
3. Użyj jasnego pola lub oświetlenia fluorescencyjnego i dostosuj ostrość, aż zobaczysz wierzchołkowe końce powierzchownych komórek. Uważaj, aby nie "rozbić" celu o podstawę komory. Unikaj włączania lub wytwarzania pęcherzyków powietrza podczas korzystania z obiektywów zanurzeniowych w olejku. Po ustawieniu próbek w trybie pozycjonowania "zgrubnego" przejdź do trybu pozycjonowania "dokładnego".
4. Zalecenia dotyczące dostrajania konfokalnego do obrazowania na żywo:
   1. Moc lasera powinna być utrzymywana na jak najniższym poziomie: 1) aby zapobiec bieleniu, 2) aby zapobiec efektom fototoksycznym i 3) aby zapobiec przypadkowemu wywołaniu zmiany kształtu komórki⁷. Zapotrzebowanie na moc lasera różni się w zależności od poziomu ekspresji i rodzaju reporterów molekularnych ulegających ekspresji w zarodkach.
   2. Użyj formatu skanowania 1024 na 1024 pikseli do obrazowania na żywo, ponieważ zapewnia dobrą rozdzielczość obrazu. Jeśli potrzebujesz bardzo dużej liczby klatek na sekundę (minimalna to 1,3 s dla naszego systemu), użyj formatu skanowania 512 na 512 pikseli. Zmniejszy to rozdzielczość obrazu, ale nadal może być wystarczające do wydobycia rozsądnej ilości informacji.
   3. Dostosuj odpowiednio zakres widmowy filtrów emisyjnych, dichroicznych i wzbudzenia.
   4. Dostosuj otwór konfokalny do zakresu od 1 do 1.5 jednostki Airy.
   5. Wzmocnienie fotopowielacza musi być utrzymywane na minimalnym poziomie, aby zredukować szumy, a jednocześnie zapewnić wystarczający sygnał do identyfikacji struktur komórkowych i lokalizacji białek.
   6. Dostosuj przesunięcie poziomu czerni, aby dostosować tło w celu poprawy jakości obrazów.
   7. Kroki od (1) do (6) są stosowane iteracyjnie w celu uzyskania najlepszej możliwej jakości obrazu. Obrazy o wysokiej jakości powinny odzwierciedlać strukturę lub zlokalizowane białka o intensywności pikseli w szerokim zakresie dynamiki. Jeśli celem są analizy ilościowe, powinna istnieć minimalna liczba pikseli o zerowej intensywności lub nasyconych.
   8. Kroki (1), (3), (5) i (6) należy powtórzyć dla każdego dodatkowego kanału fluorescencji, aby uzyskać najlepszą możliwą jakość obrazu.
   9. Podczas obrazowania za pomocą dwóch lub fluorescencyjnych sond ważne jest, aby upewnić się, że występuje minimalne przenikanie widma z jednego białka do widm emisyjnych drugiego białka. Przebijanie można przetestować, zmniejszając moc lasera wzbudzającego pierwsze białko i obserwując sygnał wytwarzany w długościach fal używanych przez drugie białko. Przebijanie spektralne może być zmniejszone przy bardziej restrykcyjnym doborze filtrów lub poprzez zmniejszenie mocy lasera używanej do wzbudzenia i zwiększenie wzmocnienia wykorzystywanego do wykrywania pierwszego białka.
5. Przy ustawieniu konfokalnym zgodnie z tymi wytycznymi powinno być możliwe uchwycenie pojedynczych obrazów z jedną głębokością ogniskowej w trybie X-Y (rys. 3A).
6. Jeśli ktoś jest zainteresowany kolekcjonowaniem filmów poklatkowych przedstawiających dynamicznie zachodzący proces, taki jak zmiana kształtu podczas skurczu komórki⁷, musi wybrać jeden z następujących alternatywnych trybów konfokalnych:
   1. X-Y-T: Ten tryb pozwala na zbieranie serii obrazów w czasie, bez zmiany płaszczyzny Z. Używamy tego trybu do obserwacji endogennych fluktuacji w komórkach nabłonka. Zwykle pozyskujemy jedną klatkę co 5 sekund przez 20 minut, aby zaobserwować endogenną zmienność lub zmiany kształtu wywołane zewnętrzną stymulacją komórek nabłonka. Wybór liczby klatek na sekundę jest całkowicie zależny od tego, co ktoś chce obserwować i jak dynamiczny jest ten proces.
   2. X-Y-Z: Korzystając z tego trybu, możemy zebrać pojedynczy stos serii Z przez komórki nabłonkowe. Nasze domyślne ustawienia zbierania danych z serii Z to kroki co 0,1 μm w zakresie 5 μm. Używamy tego trybu, aby określić, czy zmiany cytoszkieletu zachodzą tylko w określonych pozycjach, na przykład na poziomie połączeń przylegających, czy wszędzie w korze komórkowej.
   3. X-Z-T (ryc. 3A'): Ten tryb jest używany głównie do obserwacji szybkich zmian w wierzchołkowo-podstawowej organizacji komórki w nabłonku. Ten tryb jest popularny ze względu na jego użyteczność w potwierdzaniu, że tryb X-Y-T jest niezawodnym reporterem zmian w domenie komórki wierzchołkowej i że akwizycja obrazu konfokalnego nie dryfuje wzdłuż osi Z.
   4. X-Y-Z-T: Łączy tryby X-Y-Z i X-Y-T. Ten tryb może dostarczyć bogatych szczegółów na temat pełnej dynamiki wierzchołkowo-podstawnej nabłonka, ale powoli uzyskuje pełne stosy obrazów i może poważnie zmniejszyć żywotność komórek z powodu fotowybielania i efektów fototoksycznych.
7. Jakość obrazu można poprawić w ograniczonym stopniu, stosując jedno lub kombinację czterech następujących podejść: 1) uśrednianie linii, 2) akumulacja linii, 3) uśrednianie klatek i 4) akumulacja klatek. Te tryby uśredniania akwizycji obrazu mogą poprawić jakość obrazu, ale zmniejszą żywotność komórek i będą wymagały więcej czasu na zebranie obrazów.
8. Po dokładnym dostosowaniu wszystkich ustawień zbieraj i zapisuj obrazy, dane serii Z i szeregów czasowych na zewnętrznym dysku twardym, pamięci USB lub serwerze podłączonym do sieci.
9. Po zakończeniu eksperymentu opuść obiektyw dla bezpieczeństwa, oczyść olej z obiektywu i stolika mikroskopu papierem do soczewek i wyłącz system konfokalny.

Część 4: Obrazowanie na żywo mikrofilamentów F-aktyny

Jak wykazano w części 3, białko lokalizujące błonę mem-GFP może być używane do fluorescencyjnego znakowania błon komórkowych. Obrazowanie na żywo składników subkomórkowych uzyskuje się przy użyciu innych białek. Białko takie jak mezyna-GFP, które zawiera domenę wiążącą F-aktynę, można wykorzystać do znakowania F-aktyny w żywych komórkach. Podobne strategie obrazowania żywych komórek i zbierania sekwencji poklatkowych są zgodne z procedurami opisanymi w części 3. Obrazowanie na żywo F-aktyny wymaga więcej umiejętności mikroskopowych niż obrazowanie mem-GFP, ponieważ struktury są drobniejsze i ściślej zlokalizowane niż błona. Na przykład wszelkie małe pęcherzyki w olejku immersyjnym mogą powodować artefakty aberracji, takie jak rozmycie lub zmienna jasność na uchwyconym obrazie. Co więcej, każdy niewielki dryft w płaszczyźnie ogniskowej lub Z może spowodować przesunięcie się korowej aktyny F znakowanej moesiną-GFP. W związku z tym należy podwoić wysiłki, aby ustabilizować scenę, eksplantat i komorę podczas obrazowania korowej F-aktyny i innych białek subkomórkowych. Obrazy X-Y i X-Z-T przedstawiające F-aktynę znakowaną moesiną-GFP są pokazane jako przykłady (ryc. 3B i B').

Część 5: Analiza obrazu

Obrazy i sekwencje poklatkowe uzyskane z sesji konfokalnej na żywych komórkach mogą być analizowane w celu przetestowania hipotez dotyczących zmian kształtu lub wzorców lokalizacji białek. Gołe oko jest często najlepszym narzędziem do analizy jakościowej, ale może być rozszerzone lub zautomatyzowane za pomocą technik analizy obrazu w celu wydobycia danych ilościowych. Dane obrazowe z systemów konfokalnych Leica można zapisywać w otwartym formacie, takim jak . Pliki obrazów w formacie TIF lub zastrzeżone pliki . Format LIF, który zachowuje szczegółowe informacje o stanie mikroskopu podczas akwizycji. Obie. TIF oraz . Pliki LIF mogą być bezpośrednio importowane przez ogólnodostępny program do analizy obrazów Image J (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2009) za pomocą wtyczki Bio-Formats (Kevin Eliceiri, LOCI, University of Wisconsin, Madison, WI). W poniższej sekcji przedstawiamy dwa przykłady, aby zilustrować, w jaki sposób użytkownicy mogą rozpocząć analizę ilościową danych obrazu konfokalnego.

1. Otwórz dowolny plik . TIF lub . LIF (rys.4 A i A') za pomocą FILE > OPEN
2. Przykład 1: Zmierz powierzchnię komórki nabłonka (ryc. 4B do B''').
   1. Wybierz OBSZAR w ANALIZUJ > USTAW POMIARY.
   2. Wybierz narzędzie do zaznaczania wielokątów z paska narzędzi Obraz J i obrysuj komórkę.
   3. Otwórz Menedżera ROI z ANALYZE > TOOLS > ROI MANAGER i dodaj do niego kontur, naciskając [control-t], który jest skrótem do dodawania dowolnego nowego "obszaru zainteresowania" lub ROI do Menedżera ROI. Ważne jest, aby dodać ten wybór i zapisać ustawiony zwrot z inwestycji, ponieważ możesz wrócić w późniejszym czasie i dokonać dowolnych innych pomiarów parametrów. Zestawy zapisanych ROI (kliknij "ZAPISZ") można później ponownie wczytać w celu dalszej analizy.
   4. Można powtórzyć krok (c) z dowolną liczbą komórek na obrazie i dodać ROI do ROI Managera. Po zarejestrowaniu wystarczającej liczby zwrotów z inwestycji kliknij "ZMIERZ" w Menedżerze ROI. W oknie WYNIKI można teraz zobaczyć OBSZARY w stosunku do ROI. Wymiary obrazu mają odpowiadające im wartości w parametrach pomiaru.
3. Przykład 2: Zmierz intensywność błony komórkowej (rys. 4C do C''').
   1. Wybierz narzędzie "Linia prosta" z paska narzędzi Obraz J i narysuj linię na obrazie, która jest prostopadła do błony komórkowej i przecina błonę. Ten wybór w linii prostej to inny rodzaj zwrotu z inwestycji i można go dodać do Menedżera ROI, jak powyżej.
   2. Wykreśl względne intensywności w dowolnych jednostkach za pomocą ANALIZUJ > PROFILU WYKRESU. Zapisz to jako obraz i jako listę wartości, klikając odpowiednio ZAPISZ i WYŚWIETL > PLIK > ZAPISZ JAKO w oknie DRUKUJ.
4. Za pomocą Image J można dokonywać różnych pomiarów ilościowych w zależności od zainteresowań badaczy i tego, jakie hipotezy są testowane. Do wykresu danych można użyć programu Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Seattle, WA) lub Sigma Plot (Systat Software Inc., San Jose, CA). Dodatkowe przykłady z zakresu analizy obrazu zostały przedstawione wcześniej⁷.

Rysunek 1. Wymagane materiały. A) Narzędzia potrzebne do mikrochirurgii i montażu komory hodowlanej. szalka Petriego (a), duże szkiełko nakrywkowe (b), narzędzia do włosów (c), ołówek diamentowy (d), kleszcze (e), smar silikonowy "pistolet do uszczelniania" (f), nylonowa podkładka (g) i niestandardowa akrylowa komora hodowlana (h). B) Zbliżenie noża do włosów i C) pętla do włosów.

Rysunek 2. Wycięcie eksplantatów kapeluszy zwierzęcych. A) Schemat manipulacji mikrochirurgicznej stosowanej do usunięcia eksplantatu kapelusza zwierzęcego (d, grzbietowy; v, brzuszny; ah, półkula zwierzęca; vh, półkula roślinna). B) Schemat eksplantatu (e) umieszczonego pod fragmentem szkiełka nakrywkowego przytrzymywanym przez smar silikonowy (s) z powierzchnią wierzchołkową przyłożoną do szkła powlekanego BSA (g). Eksplant jest umieszczony tak, aby warstwa nabłonka znajdowała się najbliżej obiektywu mikroskopu (m). C) Eksplant kapelusza zwierzęcego (czerwona strzałka) jest hodowany w DFA i umieszczany w komorze akrylowej (niebieska strzałka) na dużym szklanym szkiełku nakrywkowym (strzałka) i utrzymywany na miejscu przez fragment szkiełka nakrywkowego i smar silikonowy.

Rysunek 3. Komórki nabłonkowe obserwowane za pomocą mikroskopu konfokalnego. A) Widok X-Y i widok X-Z (A') arkusza nabłonkowego oznaczonego etykietą GFP (mem-GFP). B) Widok X-Y i widok X-Z (B') kory wierzchołkowej komórki F-aktyny znakowanej moesyną-GFP.

Rysunek 4. Analiza obrazu za pomocą Image J. A) Oryginalny obraz błony lokalizującej arkusz komórek oznaczony GFP. Widok w wysokiej rozdzielczości (A') wstawki ramki w (A) pokazuje dwa "regiony zainteresowania" lub ROI. Żółty kontur wskazuje granicę pojedynczej komórki zaznaczonej za pomocą narzędzia wielokąta (patrz panel B), a zielona linia wskazuje ścieżkę profilu intensywności przez granicę komórka-komórka zaznaczoną za pomocą narzędzia linii prostej (patrz panel C). B') Metoda, aby wybrać opcje pomiaru i wybrać "Obszar" (B''). Po wybraniu ROI można go zapisać w Managerze ROI (B'''). C') Metoda wyboru opcji pomiaru dla przyjętego profilu. C'') Po wybraniu narzędzia linii prostej lub linii segmentowej, profil intensywności wzdłuż ścieżki można wykreślić za pomocą polecenia "Profil wykresu". Listę wartości intensywności można również zapisać w formie czytelnej dla arkusza kalkulacyjnego.

Discussion

Przedstawiliśmy protokoły eksperymentalne stosowane regularnie w naszym laboratorium do obrazowania dynamicznie zmieniającego się cytoszkieletu w wierzchołkowej korze komórkowej oraz oscylujących błon komórkowych komórek nabłonkowych w zarodkach Xenopus . Należy wykorzystać te protokoły jako punkt wyjścia do obrazowania na żywo kształtów komórek nabłonkowych; Optymalizacja tego protokołu jest niezbędna, a niektóre ustawienia będą się zmieniać w zależności od typu posiadanego systemu mikroskopowego i rodzaju biał...