Izolacja DNA z mikroorganizmów jelitowych termita (Zootermopsis angusticollis) oraz wizualizacja mikroorganizmów jelitowych

Podsumowanie

Niniejszy film przedstawia technikę izolacji DNA z gatunków mikroorganizmów zasiedlających jelito tylne termitów. Zaprezentowano również przygotowanie preparatu świeżego, który jest przydatny do wizualizacji mikrobioty jelitowej, a także przeprowadzono przegląd bogatego gatunkowo środowiska jelita.

Streszczenie

Termity należą do niewielu znanych zwierząt zdolnych do przeżycia wyłącznie dzięki konsumpcji drewna. Przewód pokarmowy termitów zawiera gęstą i bogatą gatunkowo populację drobnoustrojów, która wspomaga degradację lignocelulozy głównie do octanu, który jest kluczowym składnikiem odżywczym napędzającym metabolizm termitów (Odelson & Breznak, 1983). W obrębie tych populacji drobnoustrojów znajdują się bakterie, archeony metanogenne, a u niektórych („niższych”) termitów również eukariotyczne pierwotniaki. W związku z tym termity stanowią doskonałe obiekty badawcze do analizy oddziaływań między gatunkami drobnoustrojów oraz licznych funkcji biochemicznych, które pełnią na korzyść swojego gospodarza. Skład gatunkowy populacji mikrobów w jelitach termitów, a także kluczowe geny zaangażowane w różne procesy biochemiczne, były badane z wykorzystaniem technik molekularnych (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi & Leadbetter, 2003). Techniki te opierają się na ekstrakcji i oczyszczaniu wysokiej jakości kwasów nukleinowych z środowiska przewodu pokarmowego termita. Technika ekstrakcji opisana w tym filmie jest zmodyfikowanym zestawieniem protokołów opracowanych dla ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych z próbek środowiskowych (Mor et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi & Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) i pozwala na uzyskanie DNA z materiału jelita tylnego termitów, który nadaje się do użycia jako matryca w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Protokół

Podsumowanie procedury ekstrakcji DNA z całego przewodu pokarmowego termitów:

1. Schłodzić termity na lodzie, usunąć jelita za pomocą sterylnych pęset i ustabilizować próbki jelit w buforze.
2. Zhomogenizować próbki w buforze PVPP/SDS/fenol.
3. Wyekstrahować i oczyścić DNA z surowego lizatu przy użyciu kolumienek Qiagen DNeasy.

Protokół:

1. W warunkach chłodzenia na lodzie, za pomocą sterylnej pęsety usunąć przewody pokarmowe z osobników kasty robotnic termitów.
2. Natychmiast przenieść przewody pokarmowe wraz z ich zawartością do sterylnej, wolnej od nukleaz probówki zawierającej 50 μL lodowatego, 1x buforu TE klasy biologii molekularnej (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0).  Zamrozić próbki w temperaturze -20°C lub przejść bezpośrednio do homogenizacji. 
3. Przenieść próbki przewodów pokarmowych i bufor do sterylnej, wolnej od nukleaz probówki o objętości 2 ml z nakrętką, uprzednio wypełnionej 500 mg sterylnych kulek cyrkoniowo-krzemowych (0,1 mm) oraz 700 μl 1x buforu TE zawierającego 1% w/v poliwiniylopolipirolidonu (PVPP). 
4. Do próbek dodać 50 μl 20% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 500 μl fenolu.
5. Homogenizować (bead-beating) na najwyższym ustawieniu, stosując trzy cykle: 30 s homogenizacji i 30 s chłodzenia na lodzie.
6. Odwirować nierozpuszczalny materiał przez 1 min przy 8 000x g.
7. Oczyścić 300-μl aliquoty warstwy wodnej (górnej) za pomocą kolumn Qiagen DNeasy, stosując metodę opisaną dla oczyszczania surowego lizatu.
8. Oznaczyć ilość kwasów nukleinowych i zamrozić próbki w temperaturze -20°C do późniejszego wykorzystania.

Dyskusja

W naszym doświadczeniu DNA wyizolowane z mikrobiomu gatunków termitów żywiących się drewnem, takich jak Zootermopis nevadensis, jest wystarczająco czyste, by służyć jako matryca do PCR po jednej rundzie ekstrakcji i oczyszczania. Jednakże niektóre termity, np. gatunki żywiące się ściółką lub glebą, mogą mieć w treści jelit wyższe stężenie kwasów huminowych, co może wymagać dodatkowego oczyszczania DNA mikroorganizmów jelitowych. Całkowita wydajność DNA z jelit 5 robotnic Z. nevadensis mieści się w przedziale 10-30 μg. W ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PVPP/SDS/fenol	Bufor			bufor do homogenizacji
DNeasy Tissue Kit	Zestaw	Qiagen	77607	Stosowany zgodnie z protokołem izolacji genomicznego DNA z surowych lizatów (Dodatek H, instrukcja produktu wersja: lipiec 2003)
TE	Bufor	Sigma-Aldrich	T9285	bufor 1x (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) przygotowany z koncentratu 100x
kulkowe nośniki z cyrkonii/krzemionki	Materiały	Biospec Products	11079101z	0.1 mm
PVPP	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P6755	1% w/v poliwiniylopolipirolidonu przygotowanego z odczynnika suchego jako zawiesina 1x w buforze TE
Zootermopsis nevadensis	Zwierzę			Termity
SDS	Odczynnik	Sigma-Aldrich	L4390	20% roztwór dodecylosiarczanu sodu w wodzie przygotowany z odczynnika suchego
Fenol	Odczynnik	Sigma-Aldrich	77607	nasycony buforem TE, ~73%
MiniBeadbeater-8	Narzędzie	Biospec Products	963
BSS	Buforowana roztwór soli, pH 7.2			Skład na litr: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl oraz 10 mL roztworu 1 M NaHCO3
AxioPlan-2	Mikroskop	Carl Zeiss, Inc.		Wyposażony w obiektyw 40x, optivar 1.6x i soczewki okularowe 10x. Próbki oglądano przy użyciu oświetlenia w kontraście fazowym