Opracowaliśmy mysie modele leukomalacji okołokomorowej (PVL), która jest dominującym uszkodzeniem mózgu u wcześniaków, charakteryzującym się zmianami w istocie białej wokół komór. Głównymi przyczynami PVL są niedotlenienie i niedokrwienie, z towarzyszącą lub bez towarzyszącej infekcji systemowej. Jednostronne podwiązanie tętnicy szyjnej oraz ekspozycja na hipoksję, z wstrzyknięciem lipopolisacharydu lub bez, wywołują zmiany przypominające PVL u myszy w 6. dniu po urodzeniu (P6).
Artykuł metodologiczny
Modele mysie leukomalacji okołodomowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisujemy protokół tworzenia mysich modeli leukomalacji okołodomkowej (PVL). PVL jest dominującą postacią uszkodzenia mózgu u wcześniaków i najczęstszą przyczyną porażenia mózgowego. PVL charakteryzuje się uszkodzeniem istoty białej w obszarach okołodomkowych z wyraźnym uszkodzeniem oligodendroglialnym. Głównymi przyczynami PVL są niedotlenienie/niedokrwienie z towarzyszącą lub bez towarzyszącej infekcją/stanem zapalnym układowym. Wykorzystujemy myszy w 6. dobie po urodzeniu (P6) do tworzenia modeli noworodkowego uszkodzenia mózgu poprzez indukcję niedotlenienia/niedokrwienia z towarzyszącym lub bez towarzyszącej infekcją/stanem zapalnym układowym za pomocą jednostronnego podwiązania tętnicy szyjnej, a następnie poddania niedotlenieniu z wstrzyknięciem lub bez wstrzykiwania endotoksyny lipopolisacharydu (LPS). Immunohistochemia białka zasadowego mieliny (MBP) lub O1 oraz badanie w mikroskopie elektronowym wykazują znaczną utratę mieliny w istocie białej mózgu wraz z dodatkowymi uszkodzeniami hipokampa i wzgórza. Stworzenie mysich modeli PVL znacznie ułatwi badanie patogenezy choroby z wykorzystaniem dostępnych transgenicznych szczepów myszy, prowadzenie badań nad lekami w sposób relatywnie wysokoprzepustowy w celu zidentyfikowania potencjalnych środków terapeutycznych oraz testowanie transplantacji komórek macierzystych z wykorzystaniem immunodeficyjnych szczepów myszy.
Protokół
Szczegółowe procedury wywoływania noworodkowego uszkodzenia mózgu u myszy P6:
- Myszy w 6. dniu po urodzeniu (P6) są znieczulane poprzez pośrednie chłodzenie na lodzie do momentu utraty reakcji na bodźce bólowe (znieczulenie głębokie).
- Po oczyszczeniu skóry alkoholem wykonuje się nacięcie w linii środkowej brzusznej w przedniej części szyi.
- Pod mikroskopem stereoskopowym uzyskuje się dostęp do rozwidlenia prawej tętnicy szyjnej wspólnej poprzez delikatne odsuniecie mięśnia gnykowego i mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego.
- Powięź wokół pochewki tętnicy szyjnej zostaje usunięta, a proksymalna gałąź wewnętrzna zostaje odizolowana od pobliskiego nerwu błędnego i zwojów współczulnych za pomocą haczyka. Następnie tętnica szyjna wewnętrzna jest koagulowana przy użyciu końcówki do kauteryzacji.
- Po kauteryzacji nacięcie skóry zostaje zaszyte, a zwierzę jest utrzymywane w cieple do pełnego wybudzenia, a następnie przekazywane matce.
- Godzinę po podwiązaniu tętnicy zwierzę jest umieszczane w szczelnej komorze nasycanej azotem do momentu osiągnięcia poziomu 6,0% O2. Następnie zwierzę jest poddawane hipoksji przez 35 min.
- Po ekspozycji na hipoksję mysz regeneruje się na podgrzewaczce (33°C) przez 30 min, a następnie wraca do matki. W celu wywołania uszkodzenia mózgu z połączeniem hipoksji/niedokrwienia oraz infekcji/stanu zapalnego, zwierzęciu wstrzykuje się dootrzewnowo 0,015 ml lipopolisacharydu (LPS, 1 mg/kg).
- Cztery dni po hipoksji/niedokrwieniu myszy są znieczulane poprzez pośrednie chłodzenie na lodzie do momentu utraty reakcji na bodźce bólowe, a następnie poddawane perfuzji solą fizjologiczną, a później 4% paraformaldehydem. Mózgi są usuwane i poddawane krioprotekcji.
Rycina 1. Charakterystyka uszkodzenia mózgu w mysim modelu hipoksyczno-izchemicznym z użyciem barwienia H & E. Widoczna jest martwica ogniskowa (strzałki) w białej substancji mózgu po stronie ipsilateralnej (A) w stosunku do podwiązania tętnicy szyjnej, w porównaniu z białą substancją mózgu po stronie kontralateralnej (B). Martwicę ipsilateralną oraz ogniskowe mikrozawały obserwuje się w hipokampie (C) i wzgórzu (D) w mózgach z uszkodzeniem ipsilateralnej białej substancji mózgu.
Reprezentatywne wyniki i rysunki:
Modele mysie PVL z niedotlenieniem/niedokrwieniem i/lub infekcją/stanem zapalnym uzyskuje się poprzez jednostronne podwiązanie tętnicy szyjnej, a następnie poddanie zwierząt działaniu hipoksji i wstrzyknięcie LPS. Definiujemy te nowe modele mysie jako odpowiednie modele PVL. Badanie neuropatologiczne przekrojów czołowych barwionych hematoksyliną i eozyną (H & E) w obrębie całego przodomózgowia wykazuje ogniskową martwicę w centralnej istocie białej półkuli mózgu po stronie podwiązania tętnicy szyjnej (Ryc. 1A), przy względnym oszczędzeniu neuronów w nadległej korze mózgowej w porównaniu z przeciwległą istotą białą mózgu (Ryc. 1B). W ogniskowo zmartwiczej istocie białej stwierdza się wyraźny wzrost komórkowości, składającej się z makrofagów i astrocytów reaktywnych, co jest charakterystyczne dla ogniskowego PVL u ludzi. W przeciwległej centralnej istocie białej jądra oligodendroglialne są ułożone w pęczki przypominające pęczki włókien; architektura ta jest całkowicie zniszczona przez martwicę ogniskową po stronie ipsilateralnej. Warto zauważyć, że w mózgach z jednostronnym uszkodzeniem istoty białej stwierdzamy również ipsilateralną martwicę w hipokampie (Ryc. 1C) i wzgórzu (ogniskowe mikrozawały) (Ryc. 1D). Ludzkie PVL również nie występuje w całkowitej izolacji od towarzyszących zmian w istocie szarej. Znakiem rozpoznawczym PVL jest względne, choć nie całkowite, oszczędzenie kory mózgowej nad uszkodzoną istotą białą – cecha ta, naszym zdaniem, występuje w opracowanych przez nas modelach mysich.
Rycina 2. Skala ocen od 0 do 5 służąca do oceny uszkodzeń istoty białej przy użyciu MBP lub O1 w mysich modelach leukomalacji okołodomowej.
Nasze modele mysie wykazują cechy PVL zarówno na poziomie fenotypowym, jak i molekularnym. Do oceny uszkodzeń wykorzystaliśmy detekcję immunocytochemiczną podstawowego białka mieliny (MBP) lub antygenu O1, opracowaliśmy standardową skalę od 0 do 5 do oceny stopnia uszkodzenia istoty białej (Rys. 2) oraz scharakteryzowaliśmy patologię istoty białej (Rys. 3). Niedawno w celu zastąpienia wstępnej metody półilościowej wdrożono nieobciążoną analizę stereologiczną. Ponadto, aby zbadać korelacyjne efekty uszkodzenia istoty białej w odniesieniu do wyników funkcjonalnych, przeprowadziliśmy testy behawioralne funkcji motorycznych. Wykazaliśmy, że myszy wykazują wyraźne deficyty motoryczne w dniach P10-21 po zastosowaniu hipoksji/niedokrwienia oraz LPS w dniu P6. Ustaliliśmy kryteria oceny w skali 0-4 w celu zdefiniowania dysfunkcji kończyn przeciwległych u uszkodzonych myszy w dniach P10-21. Typowo zdrowe myszy potrafią szybko przebiec pod kątem 30° (ocena 4) i wspiąć się na nachylenie 45° bez ześlizgiwania się (ocena 3). Myszy z uszkodzeniami otrzymują niższe oceny, co koreluje ze stopniem uszkodzenia istoty białej.
Rycina 3. Charakterystyka uszkodzenia istoty białej za pomocą barwienia na MBP lub O1 oraz struktury mieliny za pomocą mikroskopu elektronowego (EM). Barwienia na MBP i O1 wykazują utratę mieliny w istocie białej mózgu po stronie ipsilateralnej względem ligacji w porównaniu do istoty białej po stronie kontralateralnej. Badanie EM wykazuje zmielinizowane aksony w istocie białej mózgu po stronie kontralateralnej względem ligacji oraz zdegenerowaną tkankę w istocie białej po stronie ipsilateralnej.
Przewidujemy, że opracowanie nowych modeli mysich PVL pozwoli nam na badanie specyficznych mechanizmów uszkodzeń mózgu niedojrzałego o charakterze PVL. Będziemy analizować patogenezę z wykorzystaniem transgenicznych szczepów myszy, aby zbadać rolę poszczególnych cząsteczek oraz ocenić cele neuroprotekcji.
Dyskusja
Uraz rozwijającego się mózgu prowadzi do niszczycielskich konsekwencji neurologicznych. Co uderzające, obraz okołoporodnego uszkodzenia mózgu jest silnie zależny od wieku. U noworodków donoszonych dotyczy ono głównie kory mózgowej z charakterystyczną utratą neuronów. Natomiast u noworodków przedwcześnie urodzonych selektywnie dotyka ono białej materii mózgu z wyraźnym uszkodzeniem rozwijających się oligodendrocytów; zaburzenie to określa się mianem okołokomorowego rozmięknienia białej materii (PVL). Skala problemu uszkodzeń mózgu u noworodków przedwcześnie urodzonych jest ogromna. Przedwczesne porody i usprawnienie neonatologicznej opieki intensywnej doprowadziły do przeżycia niemal 90% z 13 milionów noworodków przedwcześnie urodzonych na całym świecie (około 56 000 w Stanach Zjednoczonych), które rodzą się każdego roku z masą ciała poniżej 1500 g, tzn. są to noworodki o bardzo niskiej masie urodzeniowej. Około 10% osób, które przeżyły, wykazuje w późniejszym czasie mózgowe porażenie dziecięce, a około 50% ma deficyty poznawcze i behawioralne. PVL jest najważniejszą patologią mózgu leżącą u podstaw mózgowego porażenia dziecięcego u noworodków przedwcześnie urodzonych. Obecnie nie istnieje specyficzna terapia PVL, częściowo dlatego, że jego patogeneza nie jest jeszcze dobrze poznana1,2.
Chociaż etiologia PVL jest wieloczynnikowa, uważa się, że główną przyczyną PVL jest okołoporodowe niedotlenienie/niedokrwienie połączone z wewnątrzmaciczną infekcją matki. Wcześniej opracowano model niedotlenienia/niedokrwienia PVL u szczura w dniu P73. Model ten jest wyjątkowy, ponieważ przypomina PVL u wcześniaków. Charakterystyczną cechą tego modelu jest selektywna patologia istoty białej, w przeciwieństwie do większości modeli udarów, które charakteryzują się zawałem istoty szarej. Należy jednak nie pomijać ograniczeń modelu niedotlenienia-niedokrwienia u szczura. Po pierwsze, etiologia PVL jest często wieloczynnikowa. Oprócz niedotlenienia/niedokrwienia, z PVL silnie wiąże się infekcja/stan zapalny układu matka-płód. Zatem połączenie niedotlenienia/niedokrwienia oraz infekcji/stanu zapalnego prawdopodobnie pozwoliłoby stworzyć modele bardziej przypominające PVL. Wiek gryzoni, który najlepiej koreluje z ludzkim okresem rozwojowym największego ryzyka wystąpienia zmian PVL (24–32 tydzień gestacji), przypada na okres ponatalny, ponieważ różnicowanie oligodendroglialne u gryzoni jest głównie zdarzeniem ponatalnym. Ponieważ w wieku ponatalnym nie jest możliwe wywołanie infekcji/stanu zapalnego układu matka-płód, uzasadnione byłoby symulowanie infekcji na odpowiednim ponatalnym etapie rozwoju w celu stworzenia modelu PVL u gryzoni. Podjęliśmy próbę połączenia iniekcji LPS z modelem niedotlenienia/niedokrwienia u myszy w dniu P6, aby wywołać zmiany PVL o większym znaczeniu klinicznym. Po drugie, optymalne eksperymentalne podejście typu proof-of-concept w celu wykazania sprawczej roli danej cząsteczki wymaga zastosowania myszy transgenicznych; manipulacje genetyczne są znacznie trudniejsze u szczurów niż u myszy. W związku z tym postanowiliśmy przenieść nasz model eksperymentalny PVL ze szczura na mysz.
Modele mysie PVL znacznie ułatwią 1) badanie biologii i patogenezy choroby z wykorzystaniem dostępnych transgenicznych szczepów myszy; 2) prowadzenie badań nad lekami w celu odkrycia potencjalnych substancji o działaniu terapeutycznym; 3) testowanie użyteczności komórek macierzystych przy użyciu immunodeficyjnych szczepów myszy.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została częściowo sfinansowana z grantów National Institutes of Health (RO1 NS059043 oraz RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Foundation for Anemia Research, Feldstein Medical Foundation oraz Shriners Hospitals for Children.
Pragniemy podziękować dr. Davidowi Pleasure'owi za jego sugestie. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantów przyznanych W.D. przez National Institutes of Health (RO1 NS059043 oraz RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society oraz Shriners Hospitals for Children. Oświadczamy, że nie istnieją żadne konflikty interesów związane z niniejszym artykułem.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Komora hipoksyczna | BioSpherix | A-30274 | |
| Hak chirurgiczny | F.S.T. | 10064-14 |
Bibliografia
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D. Progress in periventricular leukomalacia. Arch. Neurol. 65, 1291-1295 (2008).
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
Przedruki i uprawnienia
