Transformacja Arabidopsis thaliana metodą floral-dip w celu zbadania ekspresji genu reporterowego pTSO2::β-glucuronidase

Podsumowanie

Niniejszy artykuł przedstawia metodę floral-dip w transformacji Arabidopsis thaliana za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens. Poprzez wprowadzenie do Arabidopsis promotora-reportera regulowanego cyklem komórkowym, pTSO2::β-glucuronidase (GUS), obrazujemy sposób wykrywania ekspresji reportera GUS w siewkach transgenicznych.

Streszczenie

Zdolność do wprowadzania obcych genów do organizmu stanowi fundament współczesnej biologii i biotechnologii. W modelowej roślinie kwitnącejArabidopsis thaliana, metoda transformacji poprzez zanurzanie kwiatostanów (floral-dip)^1-2zastąpiło wszystkie poprzednie metody ze względu na swoją prostotę, wydajność i niski koszt. W szczególności pędy młodych kwitnącychArabidopsisrośliny zanurza się w roztworzeAgrobacterium tumefaciensniosących specyficzne konstrukty plazmidowe. Po zanurzeniu rośliny są przenoszone z powrotem do normalnych warunków wzrostu i produkują nasiona, z których niewielki odsetek jest przekształcony za pomocą obcego genu, co pozwala na ich selekcję na pożywce zawierającej antybiotyki. Ta metoda zanurzeniowa kwiatostanów (floral-dip) znacząco ułatwiłaArabidopsisprzeprowadzili badania i wnieśli ogromny wkład w nasze zrozumienie funkcji genów roślin. W niniejszym badaniu wykorzystujemy metodę floral-dip do transformacji genu reporterowego,β-glukuronidaza (GUS)pod kontroląTSO2promotorTSO2, kodujące dla małej podjednostki reduktazy rybonukleotydowej (RNR)³, jest genem regulowanym przez cykl komórkowy, niezbędnym do biosyntezy dNDP w fazie S cyklu komórkowego. AnalizaGUSekspresja w organizmach transgenicznychArabidopsissadzonki wykazują, żeTSO2jest ekspresowany w tkankach intensywnie dzielących się. Opisana metoda eksperymentalna i materiały mogą zostać łatwo zaadaptowane nie tylko do celów badawczych, ale również do celów edukacyjnych na poziomie szkół ponadpodstawowych i uczelni wyższych.

Protokół

I. Transformacja metodą floral-dip u Arabidopsis thaliana

1. Na około 1 miesiąc przed transformacją wysiej nasiona Arabidopsis do 4–8 doniczek (kwadratowych doniczek o boku 5 cali), sadząc około 10–15 roślin na doniczkę. W przypadku roślin o prawidłowej płodności wystarczające będą 4 doniczki roślin na konstrukt plazmidowy. Jeśli należy transformować mutanty Arabidopsis o obniżonej płodności, należy odpowiednio zwiększyć liczbę doniczek.
2. Rośliny hoduje się w standardowych warunkach (16 h światła i 8 h ciemności w temperaturze 22°C). Jeśli rośliny są hodowane w krótszym dniu lub w niższej temperaturze, będą one dłużej kwitnąć i dłużej oczekiwać na gotowość do transformacji. Odpowiednia pielęgnacja zapewni zdrowe rośliny, co jest niezbędne do pomyślnej transformacji.
3. Zabieg wykonuje się, gdy rośliny właśnie wypuściły pędy kwiatostanowe i zaczęły kwitnąć; są one wówczas gotowe do transformacji. Aby zwiększyć wydajność transformacji, na 3–4 dni przed zabiegiem należy przyciąć główne pędy kwiatostanowe natychmiast po ich wyrośnięciu, aby pobudzić tworzenie większej liczby pędów bocznych. Rośliny należy podlać w dniu poprzedzającym transformację. Zapewnia to, że gleba nie wchłonie zbyt dużej ilości medium do infiltracji podczas zanurzania kwiatostanów.
4. Na dwa dni przed transformacją należy zaszczepić 40 ml LB zawierającego odpowiednie antybiotyki (w przypadku pTSO2::GUS jest to 50 μg/ml kanamycyny) szczepem Agrobacterium tumefaciens GV3101 niosącym konstrukt pTSO2::GUS. pTSO2::GUS jest sklonowany w wektorze pBIN20, który posiada gen NPTII nadający oporność na kanamycynę³. Hodować przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 28-30°C.
5. Następnego dnia przenieść 8 ml kultury nocnej do 400 ml LB zawierającego 50 μg/ml kanamycyny. Hodować przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 28-30°C.
6. W dniu transformacji, gdy OD₆₀₀ kultury Agrobacterium osiągnie około 0,8 (akceptowalny jest zakres OD₆₀₀ od 0,5 do 1), odwirować kulturę nocną Agrobacterium przez 8 minut przy 5000rpm.
7. Osad Agrobacterium zawiesić w 1 L (litrze) medium do infiltracji (10mM MgCl₂, 5% sacharozy, 0,44mM 6-benzyladeniny (BA), 0,3% silwetu L-77, 1x roztworu witamin Gamborg s i wody autoklawowanej). Medium nie wymaga autoklawowania, ale musi być świeżo przygotowane. Wlać 1 L medium do infiltracji zawierającego Agrobacterium do naczynia (np. szklanego naczynia Pyrex o wymiarach 8"x15"x2").
8. Odwrócić doniczkę (rośliny nie wypadną) i zanurzyć wszystkie części nadziemne roślin w roztworze do infiltracji, utrzymując je w nim przez 5 minut, przetwarzając jedną doniczkę na raz. Podczas zanurzania wszystkich części nadziemnych rośliny w medium do infiltracji należy unikać namaczania gleby, aby zmniejszyć ryzyko wzrostu grzybów w podłożu.
9. Po zanurzeniu ustawić wszystkie doniczki bokiem na kilku warstwach ręcznika papierowego w tacy. Ręczniki papierowe wchłoną nadmiar medium do infiltracji. Przykryć tacę folią spożywczą, aby zapewnić wysoką wilgotność. Umieścić tacę w komorze wzrostu roślin.
10. Następnego dnia zdjąć folię spożywczą i ręczniki papierowe, a następnie ustawić doniczki pionowo. Nie podlewać tych roślin przez kolejne cztery do pięciu dni. Następnie pielęgnować rośliny w zwykły sposób, aż zawiążą nasiona, a następnie zebrać nasiona masowo.
11. Przygotować płytki (szalki Petriego 150x15mm) z podłożem MS zawierającym 50 μg/ml kanamycyny (odważyć 2,2 g soli podstawowych Murashige i Skoog bez witamin, rozpuścić w 500 ml wody, ustawić pH na 5,8 za pomocą 1M NaOH, dodać 4 g agaru, autoklawować, schłodzić i dodać kanamycynę do stężenia końcowego 50 μg/ml). Płytki przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia.
12. W celu wyselekcjonowania transgenicznych roślin opornych na antybiotyk należy przesiać minimum 20 000 nasion. 0,1 grama to około 5000 nasion. Odważyć i oszacować ilość nasion.
13. Zsterylizować nasiona, myjąc je w probówce Falcon 15 ml w 70% etanolu przez 30 sekund. Przemyć nasiona raz sterylną wodą. Namoczyć nasiona przez 30 sekund w roztworze zawierającym 1:10 rozcieńczenie kupnego 5% wybielacza (Clorox). Przepłukać nasiona sterylną wodą od trzech do sześciu razy. W komorze z laminarnym przepływem powietrza nanieść pipetą około 5000 nasion na każdą płytkę MS (kanamycyna), rozprowadzić nasiona równomiernie na płytce i uszczelnić płytki taśmą Micropore 3M, aby uniknąć kontaminacji.
14. Inkubować płytki w temperaturze 4°C w ciemności przez 3–4 dni, a następnie przenieść płytki do komory (może to być ta sama komora wzrostu roślin). Po około 14 dniach siewki transgeniczne pozostają zielone, natomiast siewki nietransgeniczne blakną i obumierają. Przenieść siewki transgeniczne do gleby, powoli wyciągając korzenie z podłoża i umieszczając je w ziemi.

II. Badanie wzorców ekspresji pTSO2::GUS

1. Zebrać siewki transgeniczne pTSO2::GUS i umieścić je w zimnym 90% acetonie w szklanych fiolkach scyntylacyjnych lub probówkach do mikrocentryfugi utrzymywanych w lodzie. W przypadku analizy dużej liczby próbek można zastosować polistyrenowe płytki mikrotitracyjne (nie polipropylenowe).
2. Po zebraniu wszystkich próbek pozostawić fiolki w temperaturze pokojowej na 20 minut. W tym czasie przygotować świeży bufor barwiący bez x-Gluc (0,2% Triton x-100, 50mM bufor NaHPO₄ pH7,2, 2mM ferrocyjanek potasu, 2mM ferrycyjanek potasu) i umieścić go w lodzie.
3. Usunąć aceton z próbek i dodać bufor barwiący.
4. Przygotować roztwór barwiący z x-Gluc (0,2% Triton x-100, 50mM bufor NaHPO₄ pH7,2, 2mM ferrocyjanek potasu, 2mM ferrycyjanek potasu, 2mM x-gluc). Usunąć bufor barwiący z próbek i dodać do nich bufor barwiący zawierający x-Gluc.
5. Infiltrować próbki pod próżnią przez 15 do 20 minut. Powoli zwolnić próżnię i sprawdzić, czy wszystkie próbki zatopiły się pod powierzchnią roztworu barwiącego. W razie potrzeby powtórzyć infiltrację, aż wszystkie próbki zatoną po zwolnieniu próżni.
6. Inkubować próbki w temperaturze 37°C przez noc w buforze barwiącym z x-Gluc.
7. Wyjąć próbki z inkubatora i usunąć bufor barwiący. Przemyć próbki w kolejnych seriach etanolu (20%, 35% i 50% etanolu) w temperaturze pokojowej, wymieniając roztwór co 30 minut.
8. Utrwalić tkanki w fiksatywie FAA (50% etanol, 5% formaldehyd, 10% kwas octowy, reszta woda) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć FAA i dodać 70% etanol. Na tym etapie tkanki można oglądać i fotografować pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w kamerę cyfrową. Ciemnoniebieski kolor wskazuje miejsca ekspresji TSO2 (Rycina 1). Alternatywnie tkanki można przechowywać w temperaturze 4°C do późniejszej analizy.
   
   
   Rycina 1. Ekspresja pTSO2::GUS w siewkach transgenicznych (A), korzeniach bocznych (B) oraz wierzchołku korzenia (C). Należy zauważyć, że promotor TSO2 jest wysoce aktywny w młodych tkankach i tkankach w stanie podziału. Sporadyczny wzór ekspresji pokazany na (C) jest typowy dla genów ekspresjonowanych w konkretnych fazach cyklu komórkowego.

Reprezentatywne wyniki

Przy prawidłowym wykonaniu wydajność transformacji powinna wynosić około 0,1-0,2%. Innymi słowy, przesiewając każde 5000 nasion, powinno się otrzymać 5-10 transgenicznych siewek. Średnio, transformując 4 doniczki roślin typu dzikiego, można uzyskać około 100 linii transgenicznych.

W przypadku siewek transgenicznych zawierających konstrukt pTSO2::GUS³, ciemnoniebieskie zabarwienie odzwierciedlające aktywność GUS występuje w aktywnie dzielących się komórkach, w tym w młodych liściach, wierzchołku pędu, czubku korzenia oraz prymordiach korzeni bocznych (Rycina 1). Niejednolity, sporadyczny wzór jest charakterystyczny dla ekspresji specyficznej dla fazy cyklu komórkowego.

Dyskusja

Wydajność transformacji jest określana przez wiele różnych czynników, które omówiono poniżej:

1. Kluczowe znaczenie mają zdrowie oraz wiek roślin. Idealne są rośliny w wieku około jednego miesiąca, wytwarzające liczne niedojrzałe pąki kwiatowe. Przycięcie pędów głównych w celu pobudzenia wzrostu pędów bocznych na 3-4 dni przed transformacją zwiększy wydajność procesu. Starsze rośliny również dadzą transformanty, ale z niższą częstotliwością.
2. Istotna jest płodność roślin. W przypadku transformacji mutan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6-benzyladenina	Sigma-Aldrich	852430
Silwet-77	Crompton Corp.		Toksyczne, używać rękawic
Podłoże podstawowe Murashige i Skoog (MS)	Sigma-Aldrich	M5519
Roztwór witamin Gamborg’s 1000X	Sigma-Aldrich	G1019
X-Gluc (sól cykloheksaminowa 5-bromo-4-chloro-3-indolylu β-D-glukuronidu)	Biosynth International, Inc	B-7300	Toksyczne, światłoczułe, przechowywać w ciemności
Taśma Micropore 3M	Fisher Scientific	19027761