Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wybór aptamerów dla białka amyloid $\beta$, czynnika sprawczego choroby Alzheimera

18.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1955

⸱

13 maja 2010

 , 
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Brain Research Institute, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Aptamery to krótkie oligonukleotydy rybo- lub deoksyrybonukleinowe, wyselekcjonowane metodami ewolucji in-vitro na podstawie powinowactwa do konkretnego celu. Aptamery są narzędziami rozpoznawania molekularnego o wszechstronnych zastosowaniach terapeutycznych, diagnostycznych i badawczych. Prezentujemy metody selekcji aptamerów przeciwko białku amyloid β, czynnikowi sprawczemu choroby Alzheimera.

Streszczenie

Choroba Alzheimera (AD) jest postępującym, zależnym od wieku zaburzeniem neurodegeneracyjnym o podstępnym przebiegu, co utrudnia jej diagnozę przedobjawową1. Rozpoznanie AD można postawić z całkowitą pewnością jedynie pośmiertnie, dlatego ustanowienie przedobjawowej, wczesnej diagnostyki AD jest kluczowe dla opracowania i wdrażania skutecznych terapii2,3.

Białko amyloidu β (Aβ) odgrywa centralną rolę w patogenezie AD. Uważa się, że rozpuszczalne, oligomeryczne kompleksy Aβ wpływają na neurotoksyczność leżącą u podstaw dysfunkcji synaptycznej i utraty neuronów w AD4,5. Opisano różne formy rozpuszczalnych kompleksów Aβ, jednak ich wzajemne relacje oraz znaczenie dla etiologii i patogenezy AD są złożone i nie do końca poznane6. Specyficzne narzędzia rozpoznawania molekularnego mogą pomóc w wyjaśnieniu zależności między kompleksami Aβ oraz ułatwić wykrywanie i charakteryzację tych struktur na wczesnym etapie przebiegu choroby, zanim pojawią się objawy. Rozpoznawanie molekularne opiera się zazwyczaj na przeciwciałach. Jednak alternatywna klasa narzędzi rozpoznawania molekularnego, aptamery, oferuje istotne zalety w porównaniu z przeciwciałami7,8. Aptamery są oligonukleotydami generowanymi w drodze selekcji in-vitro: systematycznej ewolucji ligandów poprzez wykładnicze wzbogacanie (SELEX)9,10. SELEX jest procesem iteracyjnym, który podobnie jak ewolucja darwinowska, pozwala na selekcję, amplifikację, wzbogacanie i utrwalanie określonej właściwości, np. silnego i specyficznego wiązania ligandu (aptamery) lub aktywności katalitycznej (rybozymy i DNAzymy).

Mimo pojawienia się aptamerów jako narzędzi w nowoczesnej biotechnologii i medycynie11, były one niedostatecznie wykorzystywane w dziedzinie badań nad amyloidami. Niewiele aptamerów RNA lub ssDNA wyselekcjonowano przeciwko różnym formom białek prionowych (PrP)12-16. Wykazano, że aptamer RNA wytworzony przeciwko rekombinowanemu bydlęcemu PrP rozpoznaje bydlęce PrP-β17, czyli rozpuszczalny, oligomeryczny, bogaty w struktury β-kartki wariant konformacyjny pełnowymiarowego PrP, który tworzy włókna amyloidowe18. Stwierdzono, że aptamery wytworzone przy użyciu monomerycznej i kilku form włóknistych β2-mikroglobuliny (β2m) wiążą włókna niektórych innych białek amyloidogennych poza włóknami β2m19. Ylera et al. opisali aptamery RNA wyselekcjonowane przeciwko unieruchomionemu monomerycznemu Aβ4020. Co nieoczekiwane, aptamery te wiązały włókniste Aβ40. Wszystkie te dane rodzą kilka istotnych pytań. Dlaczego aptamery wyselekcjonowane przeciwko białkom monomerycznym rozpoznawały ich formy polimeryczne? Czy możliwe jest uzyskanie aptamerów przeciwko formom monomerycznym i/lub oligomerycznym białek amyloidogennych? Aby odpowiedzieć na te pytania, podjęliśmy próbę selekcji aptamerów dla kowalencyjnie stabilizowanych oligomerów Aβ4021, wytworzonych przy użyciu fotostymulowanego sieciowania niezmodyfikowanych białek (PICUP)22,23. Podobnie jak w poprzednich badaniach17,19,20, aptamery te reagowały z włóknami Aβ oraz kilkoma innymi białkami amyloidogennymi, prawdopodobnie rozpoznając potencjalnie wspólny strukturalny aptatop amyloidowy21. W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię SELEX wykorzystaną do produkcji tych aptamerów21.

Protokół

Część 1: Przygotowanie białek i sieciowanie

Wstępnie białko wykorzystywane do SELEX poddaje się działaniu 1,1,1,3,3,3-heksafluoropropanolu (HFIP) w celu uzyskania jednorodnych preparatów wolnych od agregatów, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą23. Krok ten jest niezbędny, ponieważ wcześniej powstałe agregaty indukują szybką agregację białek amyloidogennych, co prowadzi do słabej powtarzalności eksperymentalnej24, i są one niepożądane podczas selekcji aptamerów dla niezagregowanych, niefibrylarnych form białka.

  1. Odważyć około 80 μg (~180 nmol) czystego Aβ40 przy użyciu mikrowagi. Przenieść suchy liofilizowany peptyd do oznakowanych, silikonowanych, niskoadsorpcyjnych probówek do mikrocentrifugowania o pojemności 1,6 ml.
  2. Rozpuścić peptyd w 100% 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolu (HFIP, 40 μl), aby uzyskać 0,5 mM roztwór peptydu, zgodnie z wcześniejszym opisem23.
  3. Podzielić ten roztwór na cztery alikwoty po 10 μl, tak aby każda probówka zawierała nominalnie około 45 nmol Aβ40. Przystąpić do usuwania HFIP zgodnie z wcześniejszym opisem23.
  4. Przed rozpuszczeniem peptydów traktowanych HFIP w buforze do reakcji sieciowania należy przygotować odczynniki sieciujące i wygaszające. Odważyć nadsiarczan amonu (APS, MW 28,2 g/mol) i przygotować roztwór 40 mM w 10 mM fosforanie sodu, pH 7,4. Mieszać za pomocą wortexa aż do uzyskania przejrzystego roztworu.
  5. Przygotować 2 mM roztwór sześciowodnego dichlororutenu(II) tris(2,2-bipyrydylu) (RuBpy, MW 748,63 g/mol) w 10 mM fosforanie sodu, pH 7,4. Mieszać za pomocą wortexa i zweryfikować całkowite rozpuszczenie. Chronić probówkę przed światłem, owijając ją folią aluminiową.
  6. Przygotować odczynnik wygaszający. Odważyć ditiotreitol (DTT, MW 154,5 g/mol) i rozpuścić w wodzie dejonizowanej lub w 10-mM fosforanie sodu, pH 7,4, do stężenia 1 M.
  7. Rozpuścić peptyd traktowany HFIP dokładnie tak, jak opisano wcześniej23,25, dążąc do uzyskania roztworu peptydu o stężeniu około 60 μM.
  8. Przeprowadzić procedurę PICUP w celu wygenerowania mieszaniny oligomerycznego Aβ40 zgodnie z wcześniejszym opisem23. Typową reakcję PICUP przeprowadza się w objętości 20 μl, gdzie końcowe stężenia białka, RuBpy i APS wynoszą odpowiednio 30 μM, 0,05 mM i 1 mM23. W tym przypadku mieszanina użyta do PICUP zawiera 108 μl białka, 6 μl RuBpy, 6 μl APS i 1 μl DTT, a stężenia białka, RuBpy i APS są podwojone w stosunku do typowej reakcji. Pozwala to zmniejszyć liczbę przeprowadzanych reakcji PICUP i zwiększyć stężenie białka przed odsoleniem.

Część 2: Odsolenie preparatu białkowego

Przed wykorzystaniem białka do procesu SELEX przeprowadza się odsolenie w celu usunięcia odczynników sieciujących zastosowanych w metodzie PICUP. Ta mieszanina reakcyjna PICUP zawiera odczynniki sieciujące oraz białko o stężeniu ~5 μM (stężenie nominalne).

  1. Zdejmij górną zatyczkę z kolumny odsalającej o pojemności 5 ml, zamocuj kolumnę w statywie, pod wylotem kolumny ustaw zlewkę i usuń korek wylotowy. Pozostaw bufor do przechowywania, aby przepłynął przez kolumnę i zebrał się w zlewce.
  2. Równoważ kolumnę w 10 mM octanie amonu o pH 8,3. Dodaj 5 objętości złoża żywicy (25 ml) tego buforu do kolumny w aliquotach po 3 ml i pozwól im przepłynąć.
  3. W międzyczasie opisz 8 niskoadsorpcyjnych probówek z powłoką silikonową o pojemności 1,6 ml i umieść je w statywie.
  4. Po zrównoważeniu kolumny nałóż aliquot 0,5-0,7 ml mieszaniny reakcyjnej PICUP na kolumnę przy każdym pojedynczym użyciu do odsalania (kolumny można myć, przechowywać i równoważyć do późniejszych zastosowań). Pozwól mieszaninie białek wniknąć w żywicę kolumny, a przesącz zebrać do zlewki i odrzucić.
  5. Umieść pierwszą probówkę do zbierania pod wylotem kolumny. Dodaj 0,5 ml buforu octanowego do kolumny i zbierz pierwszą frakcję o objętości 0,5 ml.
  6. Powtórz kroki 2.4 i 2.5, zbierając do odpowiednich probówek do ośmiu frakcji po 0,5 ml.
  7. Ponumeruj kolejny zestaw 8 niskoadsorpcyjnych, małych probówek z powłoką silikonową o pojemności 0,6 ml i umieść je w statywie. Inną probówkę opisz jako „blank”. Pobierz 150 μl każdej frakcji i przenieś do opisanych probówek 0,6 ml. Wykorzystaj 20 μl do analizy SDS-PAGE (Rycina 1) zgodnie z wcześniejszym opisem23.
  8. Przenieś 150 μl 10 mM octanu amonu o pH 8,3 do probówki kontrolnej (blank). Użyj tej probówki do ustawienia próbki zerowej w spektrofotometrze.
  9. Zmierz absorbancję 130 μl każdej frakcji przy λ=280 nm w kuwecie kwarcowej.
  10. Po zmierzeniu absorbancji połącz frakcje o najwyższej zawartości białka (zazwyczaj frakcje 3-5), delikatnie wymieszaj za pomocą pipety i zachowaj aliquot 10 μl do analizy aminokwasowej w celu oznaczenia rzeczywistego stężenia białka (nie pokazano).
  11. Podziel próbkę na kilka aliquotów zawierających ~2 nmol białka na probówkę i liofilizuj próbki w liofilizatorze.
  12. Po zakończeniu liofilizacji potraktuj próbki 10% HFIP w sposób opisany wcześniej.
  13. Przechowuj probówki w temperaturze -20 °C. Wykorzystaj jedną probówkę dla każdego cyklu SELEX (poniżej).

Część 3: Amplifikacja syntetycznej losowej biblioteki ssDNA metodą PCR

Syntetyczna biblioteka ssDNA wykorzystana w niniejszej procedurze SELEX zawierała 49 zrandomizowanych nukleotydów (A:T:G:C=25:25:25:25%) flankowanych regionami stałymi obejmującymi miejsca klonowania (BamHI, EcoRI) oraz promotor T7, zgodnie z wcześniejszym opisem26.

  1. Aby przeprowadzić amplifikację biblioteki, przygotować standardową reakcję PCR w następujący sposób: 202 μl wody dejonizowanej, 40 μl buforu 10x do polimerazy Taq DNA, 2 μl matrycy ssDNA (0,5 nmol), 120 μl 25 mM MgCl2, 28 μl mieszanki 10 mM doksy nukleotydów trifosforanowych (dNTPs), 1 μl primera bezpośredniego (30 pmol), 1 μl primera odwrotnego (30 pmol) oraz 4 μl polimerazy Taq.
  2. Reakcję PCR przeprowadzić w termocyklerze zgodnie z następującymi ustawieniami: 5 min w 94 °C dla denaturacji wstępnej, 20 cykli obejmujących: 94 °C przez 30 s, 52 °C przez 30 s dla hybrydyzacji, 72 °C przez 30 s dla elongacji oraz elongacja końcowa w 72 °C przez 7 min.
  3. Po zakończeniu reakcji PCR oczyścić amplifikowany produkt DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR Qiagen QiaQuick zgodnie z instrukcjami producenta. Zazwyczaj w tych eksperymentach stężenie i wydajność DNA wynoszą 160 ± 10 ng/μl w 50 μl.
  4. Ilość DNA po PCR zweryfikować za pomocą elektroforezy w 2% żelu agarozowym.

Część 4: Generowanie RNA znakowanego 32P poprzez transkrypcję in-vitro

  1. Przygotować reakcję transkrypcji w probówce o pojemności 1,6 ml z zamknięciem typu O-ring zgodnie z instrukcjami producenta, z następującymi modyfikacjami: 20 μl 5x buforu do transkrypcji T7, po 7,5 μl każdego z 10 mM rATP, rGTP, rUTP, 1 μl 10 mM rCTP, 2 μl α32P-CTP (300 Ci/mmol), 5-10 μg oczyszczonej matrycy DNA (~30-40 μl oczyszczonego produktu DNA), 10 μl mieszaniny enzymów, a następnie uzupełnić objętość końcową do 10 μl, dodając wodę wolną od nukleaz.
  2. Łagodnie wymieszać roztwór za pomocą pipety, odwir purged mieszaninę w wirówce i inkubować przy 37 °C przez noc.
  3. Po zakończeniu reakcji należy usunąć matrycę DNA. Dodać RQ1 RNase-free DNase do stężenia 1 U/μg matrycy DNA i inkubować przez 4 h przy 37 °C w celu trawienia matrycy DNA.
  4. Po 4 h wyekstrahować RNA, dodając 1 objętość nasyconego cytrynianem fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (125:24:1, pH 4,7). Wymieszać za pomocą wortexa przez ~1 min i wirować przy 16 0 g przez 2 min.
  5. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki lub usunąć dolną fazę poprzez aspirację za pomocą mikropipety. Dodać 1 objętość chloroformu:alkoholu izoamylowego (24:1), wymieszać w vortexie przez 1 min i wirować zgodnie z opisem w punkcie 4.4.
  6. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki lub usunąć dolną fazę poprzez aspirację za pomocą mikropipety. Pozostałości chloroformu można usunąć, wykonując krótkie wirowanie (10 sekund) w mikrowirówce i usuwając dolną fazę za pomocą mikropipety. Na tym etapie łatwiej jest usunąć fazę dolną niż nadnadkład.
  7. Aby wytrącić RNA, dodać 0,1 objętości 3M octanu sodu (pH 5,2) oraz 1 objętość 2-propanolu. Wymieszać i umieścić w zamrażarce przy -20 °C na 15 min.
  8. Po 15 min wirować z maksymalną prędkością, najlepiej w chłodzonej mikrowirówce przy 4 °C, przez 20-30 min, aby wytrącić produkt RNA.
  9. Ostrożnie odessać nadnadkład, przemyć osad RNA 0,5 ml 70% etanolu, odwirować przy 4 °C i usunąć etanol poprzez aspirację.
  10. Przenieść probówkę z osadem RNA do bloku grzejnego i suszyć osad przy 37 °C przez 5 min.
  11. Rozpuścić próbkę RNA w 150 mM buforze STE, pH 8,0 (załączonym do mikrokolumn illustra ProbeQuant G-50) lub w wodzie wolnej od nukleaz do objętości identycznej z objętością reakcji transkrypcji in-vitro, czyli do 100 μl (krok 4.1).
  12. Podgrzać probówkę z produktem RNA przy 70 °C przez 10 min w bloku grzejnym i wymieszać w vortexie, aby ułatwić rozpuszczanie RNA.
  13. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 min w temperaturze pokojowej.
  14. Przenieść 1-μl aalikwot RNA do opisanej probówki 0,6 ml w celu wykonania pomiaru scyntylacyjnego oraz elektroforezy na żelu poliakrylamidowym TBE-mocznik (Część 6).

Część 5: Usuwanie niewłąconych nukleotydów, odsalanie RNA i pomiary scyntylacyjne

W celu usunięcia niewbudowanych nukleotydów należy użyć dwóch kolumn G-50 zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Odwrócić kolumny i wymieszać za pomocą wortexa, aby resuspender żywicę.
  2. Oderwać dolną zatyczkę kolumn wzdłuż perforacji, używając plastikowego narzędzia dołączonego do zestawu, dbając o to, aby nie uszkodzić wylotu. Poluzować nakrętkę o jedną czwartą obrotu i umieścić kolumny w czystych probówkach zbiorczych dołączonych do zestawu G-50.
  3. Wirować kolumny w probówkach zbiorczych przy 730 g g przez 1 min, aby usunąć bufor do przechowywania.
  4. Przenieś kolumny do dwóch nowych probówek o pojemności 1,6 ml z zamknięciem typu O-ring i naładuj 50 μl z 32próbkę RNA znakowaną fosforem P bezpośrednio na żywicę w każdej kolumnie, nie naruszając struktury żywicy.
  5. Wirować przy 730 obr./min g przez 2 min, aby zebrać oczyszczony znakowany RNA. Po tym kroku należy usunąć kolumny.
  6. Transfer 1 μl oczyszczonego na G-50 RNA do probówki o pojemności 0,6 ml w celu przeprowadzenia liczenia scyntylacyjnego i elektroforezy (część 6). Przechowywać zapas RNA w temperaturze -20 °C do czasu zastosowania w procedurze SELEX. Zaleca się, aby RNA zostało wykorzystane w ciągu 2 dni od znakowania, aby uniknąć jego degradacji oraz utraty aktywności.
  7. Użyj dwóch 1-μl alikwoty RNA z kroków 4.14 i 5.6 do pomiaru liczby zliczeń na minutę (cpm/μl) przy użyciu licznika scyntylacyjnego. W niniejszym przypadku zastosowano laboratoryjny licznik scyntylacyjny Triathler.
  8. Przenieść probówki zawierające próbkę RNA do plastikowego adaptera używanego do 32liczenie P, za pomocą Triathler. Umieścić probówkę i adapter w komorze pomiarowej, zamknąć pokrywę komory, wybrać 32Liczba P, a następnie naciśnij start, aby rozpocząć liczenie.
  9. Oblicz procentowy stopień włączenia znacznika, tj. % włączenia α32P-CTP = (cpm/μl dla próbki „G-50” ÷ cpm/μl dla próbki „CAŁKOWITEJ”) x 10. Próbka CAŁKOWITA to próbka przed oczyszczaniem na kolumnie G-50.
  10. Po pomiarze scyntylacyjnym i obliczeniu procentowego wbudowania, oblicz wydajność RNA oraz aktywność właściwą RNA. Na przykład, jeśli liczniki dla puli RNA przed (237370 cpm/μl) oraz po oczyszczaniu na kolumnie G-50 (19130 cpm/μl) daje 81% włączenia, następnie przed obliczeniem wydajności RNA wylicza się następujące wartości:

    Od kroku 4.1, ilość α32P-CTP o aktywności 30 Ci/mmol i 10 μCi/μl jest:
    Wzór obliczeniowy znakowania radioizotopowego; proces konwersji μCi, Ci, mmol; równanie chemii analitycznej..
    Ilość użytego nieznakowanego CTP wynosi:
    Równanie konwersji stężenia molowego, przedstawiające przeliczenie na pmol..
    Całkowita ilość zużytego CTP wynosi 106,7 pmol. Masę cząsteczkową RNA oblicza się w następujący sposób
    Obliczenie równowagi statycznej, wzór: \((10bp-17bp)\times\frac{321,45g/mol}{1bp}-61,96\frac{g}{mol}\).
    gdzie 321,45 g/mol27 jest średnią masą rNTP, 10 bp to liczba zasad w sekwencji, a 17 bp to liczba zasad w promotorze T7, które nie są transkrybowane. Odjęcie 61,96 g/mol od masy cząsteczkowej oligonukleotydu uwzględnia usunięcie HPO2 (63,98) oraz dodanie dwóch atomów wodoru (2,02)27Ponieważ spośród 4 rNTP, CTP jest odczynnikiem ograniczającym, gdyby wszystkie cząsteczki CTP zostały włączone, teoretyczna masa otrzymanego RNA wyniosłaby:
    Równanie konwersji masy; pokazuje \( \frac{pg}{pmol} \times pmol = \mu g \); schemat wyniku obliczeń..
    Jednak ze względu na 81% wbudowanie, masa ta wynosi obecnie 2156 μgLiczba zliczeń na μg RNA wynosiłoby wówczas
    Wzór obliczeniowy radioaktywności, 100 μL × 19130 cpm/μL ÷ 2156 μg = 874 cpm/μg, metoda naukowa.
    gdzie 100 μl jest objętość reakcji transkrypcji, a w przeliczeniu na mole: 26618.4 μg/μmol 874 cpm/μg=2,4x108 kopie na minutę/μmolNa tej podstawie można obliczyć ilość RNA w nmol oraz odpowiednią objętość wykorzystaną do inkubacji z białkiem, np. 5 μl Próbka RNA będzie zawierać ok. 4 nmol RNA, tj.
    Wzór na obliczanie stężenia aktywności promienistej; obejmuje konwersję jednostek z cpm/µl na µmol.
    W badaniach tych wykorzystano od 30 pmol do 1 nmol białka oraz od 4 nmol do 10 nmol RNA.21.

Część 6: Charakterystyka produktu RNA za pomocą elektroforezy i autoradiografii

  1. Aby przygotować próbki do elektroforezy, należy użyć 1-μl alikwoty RNA przed i po oczyszczaniu na kolumnie G-50 z kroków odpowiednio 4.14 i 5.6. Dodać 4 μl bufor STE oraz 5 μl 2x bufor do próbek TBE-mocznik Novex.
  2. Podgrzewać próbki w temperaturze 70 °C przez 5 min, zgodnie z powszechnymi zaleceniami dla elektroforezy RNA (stwierdzono, że podgrzewanie jest zbędne, ponieważ rozdzielczość żelu dla próbek RNA z podgrzewaniem i bez podgrzewania jest w tej konfiguracji doświadczalnej taka sama).
  3. Złóż żel poliakrylamidowy 6% TBE-urea w aparaturze do elektroforezy, a następnie wypełnij komory wewnętrzną i zewnętrzną 1x buforem do elektroforezy Novex TBE-Urea. Przepłucz studzienki gotowego żelu za pomocą buforu, używając pipety o objętości 1 ml.
  4. Odwirować probówki z RNA i nanieść próbki (10 μl (łącznie) przy użyciu końcówek do nakładania próbek na żel. Elektroforezę prowadzić przy napięciu 180 V przez 50 min.
  5. Po 50 minutach wyjmij żel z formy, rozłamując plastikową ramkę; usuń i wyrzuć jedynie krótszą podstawkę formy, pozostawiając dłuższą podstawkę jako wsparcie dla żelu.
  6. Oczyścić powierzchnię obszaru roboczego za pomocą preparatu Decon (lub innego odpowiedniego środka do dekontaminacji radioaktywnej), upewniając się, że wszystkie zanieczyszczone obszary radioaktywne zostały usunięte.
  7. Rozłożyć dwie warstwy folii spożywczej Saran; zawinąć żel oraz plastikową podkładkę w tę dwuwarstwową folię.
  8. Naświetl żel zawinięty w folię plastikową, przykładając do niego arkusz filmu rentgenowskiego do autoradiografii wewnątrz kasety naświetlającej w ciemni, przy bezpiecznym świetle. Pozostaw kasetę przy -20 °C przez 60–90 min.
  9. Wywołać film w ciemni przy świetle bezpiecznym po 60–90 min, używając automatycznej wywoływarki do filmów (rycina 2).

Część 7: Inkubacja białka z RNA i wiązanie na filtrze

W pierwszej kolejności RNA i białko inkubuje się w roztworze, a następnie sekwencje RNA wiążące się z białkiem oddziela się od sekwencji niewiążących. W miarę postępu cykli SELEX, wiązanie na filtrze będzie wskazywać na stopień wzbogacenia wiązania białka z RNA.

  1. Inkubować RNA w temperaturze 90 °C przez 10 min w celu denaturacji, a następnie w temperaturze pokojowej przez 10 min w celu powolnej renaturacji.
  2. Rozpuścić białko z kroku 2.12 w 8 μl 60 mM NaOH i dodać 36 μl wolnej od nukleaz wody dejonizowanej. Sonicować mieszaninę przez 1 min i dodać 36 μl 2x buforu wiążącego RNA (20 mM Tris, 30 mM NaCl, 10 mM MgCl2, pH 7.5).
  3. Wymieszać odpowiednią ilość RNA z 20 μl 10x buforu wiążącego RNA i uzupełnić objętość do 200 μl, dodając wodę wolną od nukleaz. Oznaczyć probówkę jako „kontrola negatywna”.
  4. Wymieszać 20 μl białka i pożądaną ilość RNA z 20 μl 10x buforu wiążącego RNA i uzupełnić objętość do 20 μl wodą wolną od nukleaz. Oznaczyć probówkę jako „reakcja”.
  5. Wymieszać i inkubować probówki przez 30 min w temperaturze pokojowej. W tym czasie przygotować filtry i układ do wiązania na filtrze do następnego kroku.
  6. Podłączyć kolbę z bocznym wylotem o pojemności 125 ml do wlotu próżniowego. Umieścić uprzednio oczyszczoną, porowatą szklaną podstawkę pod filtr na kolbie.
  7. Równoważyć 3 membrany filtracyjne w 2-3 ml 1x buforu wiążącego RNA w czalce Petriego o wymiarach 35x10 mm przez 10-15 min. Pierwszy filtr posłuży do regulacji ssania próżniowego, drugi zostanie użyty do wiązania na filtrze samego RNA (kontrola negatywna), a trzeci do wiązania na filtrze mieszaniny RNA-białko.
  8. Po 30 min odwirować reakcję wiązania oraz probówki kontrolne z maksymalną prędkością przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  9. Włączyć próżnię i umieścić pierwszą membranę na porowatym szkle. Za pomocą mikropipety nanieść 0,5 ml buforu wiążącego RNA na membranę i wyregulować próżnię tak, aby każda kropla buforu powoli przepływała przez membranę.
  10. Umieścić drugą membranę na porowatym szkle i przy tej samej prędkości przepływu nanieść kontrolę negatywną na membranę.
  11. Nanieść 4x0,5-ml alikwoty 1x buforu wiążącego RNA, aby przemyć membranę, a następnie odrzucić filtrat. Należy pamiętać, że jeśli wymagane jest uprzednie oczyszczanie, filtrat jest zachowywany do ekstrakcji RNA. Uprzednie oczyszczanie usuwa sekwencje RNA, które wiążą się z filtrem.
  12. Zdjąć membranę kontroli negatywnej i umieścić ją w odpowiednio oznaczonej probówce 1,6 ml do liczenia scyntylacyjnego.
  13. Zastąpić porowate szkło drugą, uprzednio oczyszczoną podstawką ze szkła porowatego.
  14. Umieścić trzeci dysk na porowatym szkle i nanieść mieszaninę reakcyjną. Przemyć filtr zgodnie z krokiem 7.1 i odrzucić filtrat. Liczbę przemyć można zwiększyć w późniejszych cyklach SELEX w celu zwiększenia rygorystyczności warunków SELEX.
  15. Zdjąć dysk filtra i umieścić go w probówce 1,6 ml oznaczonej jako „mieszanina reakcyjna” i zachować do liczenia scyntylacyjnego.
  16. Przeprowadzić liczenie scyntylacyjne zgodnie z krokiem 5.8 i zapisać wyniki dla poszczególnych filtrów.
  17. Obliczyć poziom radioaktywności związanej z filtrem w porównaniu do całkowitej ilości radioaktywności naniesionej na membrany (% wiązania). Pozwoli to ocenić wzbogacenie wiązania w miarę postępu procesu SELEX.

Część 8: Ekstrakcja RNA z filtrów

Z filtrów ekstrahuje się RNA w celu uzyskania sekwencji wiążących się z białkiem. Sekwencje te są następnie amplifikowane w celu przeprowadzenia kolejnego cyklu SELEX.

  1. Po pomiarze w liczniku scyntylacyjnym wyjmij filtr z reakcji wiązania z probówki (z kroku 7.15) i umieść go w czystej, suchej szalce Petriego o wymiarach 35x10 mm.
  2. Za pomocą czystego skalpela i pęsety potnij membranę na małe kawałki.
  3. Używając pęsety, umieść pocięte kawałki membrany w tej samej opisanej probówce z kroku 8.1.
  4. Dodaj 40 μl buforu do elucji (7 M urea, 3 mM EDTA, 10 mM cytrynianu sodu, pH 5.0) i inkubuj probówkę w temperaturze 95 °C przez 10 min.
  5. Odwiruj probówkę z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej, odessij i zbierz bufor ekstrakcyjny do nowej opisanej probówki.
  6. Zmierz pozostałą radioaktywność w probówce zawierającej kawałki membrany za pomocą licznika scyntylacyjnego, aby ocenić wydajność ekstrakcji.
  7. Powtórz proces ekstrakcji (kroki 8.4-8.6) trzykrotnie. Wydajność po 3 ekstrakcjach wynosi zazwyczaj ~95-96%.
  8. Do probówek zawierających ekstrakty RNA dodaj 1 objętość (40 μl) nasyconego cytrynianem (pH 4.7) fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (125:24:1). Wymieszaj w wortexerze przez ~1 min i odwiruj przy 16,0 g przez 2 min.
  9. Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki lub usuń dolną fazę przez aspirację za pomocą mikropipety.
  10. Dodaj 1 objętość chloroformu:alkoholu izoamylowego (24:1), wymieszaj wortexerze przez 1 min i odwiruj przy 16,0 g przez 2 min.
  11. Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki lub usuń dolną fazę przez aspirację za pomocą mikropipety.
  12. Aby wytrącić RNA, dodaj 0,1 objętości 3 M octanu sodu, pH 5.2, 3-4 μl glikogenu (10 μg/μl) jako koprecypitantu RNA oraz 1 objętość ekwiwalentu 2-propanolu. Wymieszaj i pozostaw w zamrażarce w temperaturze -20 °C przez noc.
  13. Wiruj z maksymalną prędkością, najlepiej w mikrowirówce w temperaturze 4 °C, przez 20-30 min, aby wytrącić RNA z kroku 8.12.
  14. Po wirowaniu RNA oddziela się w fazie ciekłej, która jest ledwo widoczna. Ostrożnie odessij nadsącz, nie naruszając tej ledwo widocznej fazy osadu na dnie probówki.
  15. Przemyj „pellet” RNA 0,5 ml 70% etanolu, wiruj przez 5 min z maksymalną prędkością w 4 °C i usuń etanol przez aspirację, nie naruszając ledwo widocznej fazy osadu.
  16. Rozpuść pellet RNA w 50 μl buforu STE i przystąp do oczyszczania na kolumnie G-50 zgodnie z krokiem 5.

Część 9: Odwrotna transkrypcja i PCR dla kolejnych cykli SELEX

Aby przejść do kolejnego cyklu SELEX, RNA musi zostać poddane odwrotnej transkrypcji do DNA i amplifikacji metodą PCR.

  1. W 5 oznakowanych probówkach o pojemności 0,6 ml zmieśzać 3 μl oczyszczonego, odsolonego na kolumnach G-50 RNA z 2 μl 8-krotnie rozcieńczonego primera wstecznego. Jedną probówkę oznaczyć jako „kontrolę negatywną”.
  2. Mieszaninę inkubować przy 70 °C przez 5 min, a następnie na lodzie przez kolejne 5 min, aby umożliwić hybrydyzację primera z RNA.
  3. Do tej mieszaniny na lodzie dodać 6,4 μl wody wolnej od nukleaz, 4 μl 5x buforu reakcyjnego ImProm-II, 1,6 μl 25 mM MgCl2, 1 μl 10 mM mieszaniny dNTP, 1 μl inhibitora rybonukleazy RNasein oraz 1 μl odwrotnej transkryptazy ImProm-II, tak aby całkowita objętość wyniosła 15 μl.
  4. W przypadku kontroli negatywnej dodać 7,4 μl wody wolnej od nukleaz i pominąć dodanie odwrotnej transkryptazy. Odpowiednio oznaczyć probówki. Kontrolę negatywną stosuje się w celu weryfikacji, czy DNA zanieczyszczające z poprzedniego cyklu nie ulegają amplifikacji w kolejnym cyklu SELEX. Krok ten pozwala sprawdzić skuteczność trawienia matrycy DNA przez RQ1 DNazę wolną od RNaz w kroku 4.3.
  5. W termocyklerze inkubować mieszaninę reakcyjną przy 25 °C przez 5 min oraz przy 42 °C przez 1 h w celu odpowiednio przyłączenia primera i elongacji pierwszej nici DNA, a następnie przy 70 °C przez 15 min w celu inaktywacji odwrotnej transkryptazy.
  6. Po reakcji odwrotnej transkrypcji przygotować mieszaninę do PCR. Do wszystkich probówek dodać 30 μl wody wolnej od nukleaz, 10 μl 10x buforu Taq, 30 μl 25 mM MgCl2, 7 μl 10 mM mieszaniny dNTP, po 1 μl każdego primera oraz 1 μl polimerazy Taq.
  7. Przeprowadzić program PCR zgodnie z instrukcjami w Części 3 przez 9-14 cykli.
  8. Oczyścić produkt DNA zgodnie z opisem w kroku 3.3.
  9. Zmieszać 8 μl produktu DNA z 2 μl barwnika do ładowania DNA i przeprowadzić elektroforezę na 2% żelu agarozowym przy 100 V przez 15-20 min (Rysunek 3).
  10. Produkt DNA jest gotowy do transkrypcji na znakowane RNA zgodnie z Częścią 4 i do wykorzystania w kolejnym cyklu SELEX.

Część 10: Reprezentatywne wyniki

W eksperymentach SELEX istotne są natura oligomerów Aβ40 użytych jako cel, jakość RNA wykorzystywanego w każdym cyklu oraz skuteczna ekstrakcja i amplifikacja RNA po każdym cyklu. Wykorzystano metodę PICUP do otrzymania mieszaniny oligomerów Aβ40 do SELEX po oczyszczeniu i usunięciu odczynników sieciujących. Eksperymenty odsolenia opisane w Części 2 zazwyczaj prowadzą do utraty 50-5% białka. Ilość i jakość białka można ocenić za pomocą pomiarów absorbancji (λ=280) oraz elektroforezy SDS-PAGE (Rysunek 1). Na Rysunku 1 przedstawiono średni profil absorbancji eluatów Aβ40 z 5 oddzielnych eksperymentów, na który nałożono typowy profil SDS-PAGE dla Aβ40 elutowanego w jednym z tych eksperymentów. Dane pokazują, że białko konsekwentnie eluuje z kolumny w frakcjach 3-5, a odczynniki sieciujące eluują po frakcji 6 (zwiększona absorbancja w frakcji 7, Rysunek 1). SDS-PAGE wykazuje typowy rozkład oligomerów Aβ402. Rozkład ten był powtarzalny po liofilizacji frakcji białkowych (2.1), traktowaniu HFIP (2.1), ponownym rozpuszczeniu (7.1) i ponownej analizie metodą SDS-PAGE.

Integralność RNA w każdym cyklu SELEX jest również istotna dla iteracyjnego postępu procesu SELEX, szczególnie w przypadku zastosowania rybo-oligonukleotydów podatnych na działanie nukleaz. Po amplifikacji i znakowaniu RNA (część 4) jakość znakowanego RNA można ocenić za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym TBE-mocznik. Typowy profil nienaruszonego produktu znakowanego RNA przed i po oczyszczaniu na kolumnie G-50 (część 5) przedstawiono na rysunku 2.

Po każdym cyklu SELEX RNA jest ekstrahowane z błony po wiązaniu na filtrze (Część 8) i poddawane odwrotnej transkrypcji (Część 9) do DNA w celu amplifikacji PCR (Krok 9.5). Matryca DNA z poprzedniego cyklu jest następnie wykorzystywana do generowania RNA znakowanego 32P (Część 4) dla następnego cyklu. Jeśli w znakowanym produkcie RNA po reakcjach transkrypcji in-vitro (Część 4) przetrwa część zanieczyszczającej matrycy DNA z poprzedniego cyklu, wydajność cykli SELEX spadnie, co będzie wymagało przeprowadzenia większej liczby cykli. Aby to kontrolować, po każdym cyklu SELEX i odpowiadającej mu reakcji PCR z odwrotną transkrypcją przeprowadza się elektroforezę w agarozie (9.12). Brak produktu DNA w probówkach z reakcją kontrolną negatywną (9.4) wskazuje na skuteczne usunięcie matrycy DNA pochodzącej z poprzedniego cyklu SELEX (Rysunek 3). W przypadku zaobserwowania amplifikacji DNA metodą PCR w probówce kontrolnej negatywnej zaleca się przedłużenie czasu inkubacji z DNazą RQ1 (4.3). Zalecany przez producenta czas inkubacji z DNazą RQ1 wynosi 15 min, jednak stwierdzono, że do całkowitego usunięcia matrycy DNA wymagana była dłuższa inkubacja (4-5 h) (Rysunek 3).

Oczyszczanie białek; wynik żelu SDS-PAGE, wykres absorbancji; analiza frakcji metodą elektroforezy.
Rycina 1. SDS-PAGE i profil absorbancji odsolonych oligomerów Aβ40 generowanych za pomocą PICUP. Profil absorbancji z 5 poszczególnych kolumn do odsalania został uśredniony i nałożony na reprezentatywny żel. Markery masy cząsteczkowej znajdują się po prawej stronie.

Wynik elektroforezy RNA; schemat żelu; analiza rozdziału RNA metodą elektroforetyczną.
Rycina 2. Elektroforeza żelowa RNA w układzie TBE-mocznik-poliakryloamid przed i po oczyszczaniu na kolumnie G-50. Kierunek migracji produktu RNA przebiega od katody do anody, zgodnie z oznaczeniem.

Wyniki elektroforezy żelowej, rozdział DNA, pokazujące próbki w porównaniu z kontrolą negatywną, marker 10 bp.
Rycina 3. Elektroforeza w żelu agarozowym produktu DNA po odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Punktem wyjścia procesu SELEX jest synteza losowej biblioteki oligonukleotydów zawierającej zazwyczaj od 1012 do 1015 sekwencji. W przypadku DNA SELEX biblioteka ta jest wykorzystywana bezpośrednio po wygenerowaniu puli ssDNA, natomiast w RNA SELEX, zaprezentowanym tutaj, biblioteka ssDNA jest najpierw konwertowana enzymatycznie na pulę RNA poprzez transkrypcję in-vitro. Następnie SELEX jest przeprowadzany iteracyjnie, przy czym każdy cykl obejmuje ekspozycję i wiązanie oligonukleotydów z z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez granty AG030709 z NIH/NIA oraz 07-65798 z Departamentu Zdrowia Publicznego Kalifornii (California Department of Public Health). Dziękujemy Margaret M. Condron za syntezę peptydów i analizę aminokwasów, dr Elizabeth F. Neufeld za pomoc i wsparcie w początkowych etapach projektu, dr Chi-Hong B. Chen za zapewnienie wsparcia i odczynników oraz dr Andrew D. Ellington za pomocne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aβ40Laboratorium Biopolimerów UCLAProszek liofilizowany
Automatyczna mikrowaga MX5 Automated-SMettler Toledo
Probówki o pojemności 1,6 ml powlekane silikonemDenville ScientificC19033 lub C19035
1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP)TCI AmericaH0424Stosować w dygestorium.
Persiarczan amonuSigma-AldrichA-7460Mieszać w wstrząsarku wirówkowym (vortex) do czasu uzyskania klarownego roztworu. APS należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem i wykorzystać w ciągu 48 h.
Heksahydrat dichlorotris(2,2'-bipirydylo)rutenu(II)Sigma-Aldrich224758-1GWymieszaj w wstrząsarce wirowej (vortex), aż roztwór stanie się klarowny. Przykryj probówkę z RuBpy folią aluminiową, aby chronić odczynnik przed światłem otoczenia. RuBpy należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem i wykorzystać w ciągu 48 h.
Ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
D-Salt™ Excellulose™ kolumny do odsalaniaThermo Fisher Scientific, Inc.20449
Octan amonuFisher ScientificA637-500
probówki o pojemności 0,6 ml z powłoką silikonowąDenville ScientificC19063
Żele Novex Tricine (10–20%)InvitrogenEC6625B0X10-dołkowa; rozmiar mini (8 cm x 8 cm); 25 μobjętość nakładania na dołek; zakres rozdziału od 5 kDa do 40 kDa
Kuweta kwarcowaHellma105.250-QS
spektrofotometr Beckman DU 640Beckman Coulter Inc.
biblioteka ssDNAIntegrated DNA TechnologiesZamawiane na specjalne zamówienieBibliotekę zaprojektowano tak, aby zawierała 49 losowych nukleotydów flankowanych przez dwa regiony stałe zawierające miejsca wiązania starterów oraz miejsca klonowania: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 5'-TCC GTT CGG GAT CCT-3'’
polimeraza DNA TaqUSB Corp., Affymetrix71160Rekombinowany Thermus aquaticus polimeraza DNA dostarczona w ilości 10× bufor do PCR oraz oddzielna probówka z 25 mM MgCl22 do rutynowej reakcji PCR.
Mieszanina nukleotydów do PCR, roztwór 10 mMUSB Corp., Affymetrix77212(po 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Starter forwardIntegrated DNA TechnologiesZamówione na specjalne zamówienie5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’
Starter odwrotnyIntegrated DNA TechnologiesZamawiane na specjalne zamówienie5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’
TermocyklerDenville ScientificTechne TC-312
Zestaw QIAquick PCR Purification Kit (50)Qiagen28104
AgarozaDenville ScientificCA3510-8
Sterylne probówki stożkowe o pojemności 1,6 ml z nakrętkami z uszczelkami typu O-ringDenville ScientificC19040-S
RiboMAX™ System wielkoskalowej produkcji RNA–T7Promega Corp.P1300Zestaw zawiera: 120 μMieszanina enzymów (polimeraza RNA, rekombinowana RNazyna)® inhibitor rybonukleazy i rekombinowana nieorganiczna pirofosfataza); 240 μbufor do transkrypcji 5; 100 μkażdy z 4 rNTP, 100 mM; 110 j. RQ1 DNase wolnej od RNaz, 1 j./μl; 10 μliniowy kontrolny DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M octanu sodu (pH 5,2); 1,25 ml wody wolnej od nukleaz
α-32P-cytydyna 5’-trifosforan, 250 μCi (9,25 MBq), PerkinElmer, Inc.BLU008H250UCAktywność właściwa: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM tricyny (pH 7,6)
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy nasycony cytrynianem (125:24:1, pH 4,7)Sigma-Aldrich77619
Chloroform:alkohol izoamylowy (24:1)Sigma-AldrichC0549
Etanol bezwodny do biologii molekularnejSigma-AldrichE7023
chłodząca mikrocentryfuga Z216-MKDenville ScientificC0216-MK
illustra ProbeQuant™ Mikrokolumny G-50GE HealthcareZakupiono w Fisher Scientific (45-001-487)Wypełnione Sephadexem™ G-50 klasy DNA, uprzednio równoważony w buforze STE zawierającym 0,15% Kathonu jako biocydu
Blatowy licznik scyntylacyjny TriathlerHidex Oy, Turku, FinlandiaModel Triathler LSC: 425-034
Novex® bufor do próbek TBE-mocznik (2×)InvitrogenLC6876
Żele 6% TBE-mocznikowe 1,0 mm, 10 studzienekInvitrogenEC6865BOX
Novex® Bufor do elektroforezy TBE (5x)×)InvitrogenLC6675
Dekontaminant radioaktywnyFisher Scientific04-355-67
Końcówki do nakładania próbek na żelDenville ScientificP3080
XCell SureLock Mini-komórkaInvitrogenEI0001XCell SureLock Mini-komórka
Kalka autoradiograficznaDenville ScientificE3018Stosować w całkowitej ciemności
Film do autoradiografii, Hyperfilm™ ECL (elektrochemiluminescencja)AmershamRPN3114KMożna stosować w czerwonym świetle ochronnym.
Dyski membranoweEMD MilliporeGSWP02500mieszane estry celulozy, hydrofilowe, 0,22-μmembrany m-disc
Szklana podstawa z fritem do kolby o pojemności 125 mlVWR international26316-696
szalki PetriegoFisher Scientific08-757-11YZ
MocznikFisher ScientificAC32738-0050
EDTAFisher Scientific118430010
GlikogenSigma-AldrichG1767
2-propanol do biologii molekularnejSigma-AldrichI9516
Rekombinowany inhibitor RNazyUSB Corp., Affymetrix71571
ImProm-II™System odwrotnej transkrypcjiPromega Corp.A3802
Rekombinowany inhibitor RNazyUSB Corp., Affymetrix71571
RapidRun™ Barwnik do nakładania próbekUSB Corp., Affymetrix77524

Bibliografia

  1. Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
  2. Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer's disease. Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).
  3. Kawas, C. H. Clinical practice. Early Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).
  4. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid β-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
  5. Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. Paradigm shifts in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies. J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).
  6. Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer's disease and related disorders. Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).
  7. Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).
  8. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).
  9. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  10. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  11. Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).
  12. Weiss, S. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).
  13. Bibby, D. F. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins. J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).
  14. Rhie, A. Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).
  15. King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).
  16. Proske, D. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).
  17. Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity. Prion. 2, 73-80 (2008).
  18. Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions. J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).
  19. Bunka, D. H. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).
  20. Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).
  21. Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity. PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).
  22. Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
  23. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J. Vis. Exp. , (2009).
  24. Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
  25. Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
  26. Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).
  27. Adams, D. S. Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
  28. Gopinath, S. C. Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).
  29. Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ. Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Selekcja aptamer wmetodologia SELEXamyloid beta 40wi zanie RNAtest wi zania na filtrzetranskrypcja in vitrosieciowanie bia ekprocedura PICUPelektroforeza w eluliczenie scyntylacyjne
Wybór aptamerów dla białka amyloid $\beta$, czynnika sprawczego choroby Alzheimera
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.