Opisujemy protokół oparty na małych cząsteczkach służący do różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC). Protokół ten pozwala na wysokowydajne generowanie komórek OPC Olig2+NG2+ w ciągu 30 dni różnicowania. Opisujemy również metodę generowania „spiking” OPC, które są zdolne do generowania potencjałów czynnościowych.
Artykuł metodologiczny
Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oligodendrocyty są komórkami mielinizującymi ośrodkowego układu nerwowego. W kontekście regeneracyjnej terapii komórkowej w chorobach demielinizacyjnych istnieje duże zainteresowanie uzyskiwaniem czystej populacji zdeterminowanych progenitorów oligodendrocytów (OPC) do transplantacji. OPC charakteryzują się aktywnością czynnika transkrypcyjnego Olig2 oraz ekspresją powierzchniową proteoglikanu NG2. Wykorzystując linię reporterową embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) GFP-Olig2 (G-Olig2), zoptymalizowaliśmy warunki różnicowania mESC w komórki GFP+Olig2+NG2+ OPC. W naszym protokole opisujemy najpierw generowanie ciał embrionalnych (EB) z mESC. Następnie opisujemy traktowanie pochodnych od mESC ciał EB małymi cząsteczkami: (1) kwasem retinowym (RA) oraz (2) agonistą białka sonic hedgehog (Shh), purmorfaminą (Pur), w określonych warunkach hodowli w celu ukierunkowania różnicowania EB w kierunku linii oligodendroglialnej. Dzięki temu podejściu OPC można uzyskać z wysoką wydajnością (>80%) w czasie 30 dni. Komórki pochodne mESC uzyskane w tym protokole są fenotypowo podobne do OPC pochodzących z pierwotnych kultur tkankowych. OPC pochodne mESC nie wykazują właściwości generowania potencjałów kolczastych (spiking), które opisano dla subpopulacji OPC mózgu in situ. Aby zbadać tę właściwość elektrofizjologiczną, opisujemy generowanie wykazujących spiking OPC pochodnych mESC poprzez ektopową ekspresję NaVpodjednostka 1.2. Komórki generujące i niegenerujące impulsów uzyskane dzięki temu protokołowi pomogą w rozwoju badań funkcjonalnych nad dwiema subpopulacjami OPC.
Protokół
Szczegółowe procedury generowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) GFP-Olig2:
- Linia komórek macierzystych zarodkowych myszy GFP-Olig2 (G-Olig2) zostaje zakupiona z American Type Culture Collection (ATCC). mESC są rutynowo pasażowane co 3 dni na warstwę pożywkową z napromieniowanych embrionalnych fibroblastów mysich (MEF). Komórki MEF wysiewa się na sześciodołkową płytkę do hodowli tkankowej powleczoną 0,1% żelatyną co najmniej jeden dzień przed pasażowaniem ESC. Pożywka do hodowli mESC to pożywka Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (GIBCO) uzupełniona o 20% płodowej surowicy bydlęcej (GIBCO), 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM β-merkaptoetanolu/, 1% nieessentialnych aminokwasów (NEAA) oraz 1 000 U/ml czynnika hamującego białaczkę (leukemia inhibitory factor).
- Kolonie mES poddaje się trypsynizacji (TrypLE, 5 min, 37°C) do pojedynczych komórek i zawiesza w pożywce z zamiennikiem surowicy knockout (KSR), a następnie komórki przenosi się na sześciodołkową płytkę Costar o ultra-niskiej adhezji (Corning) przy gęstości 50 000 komórek/cm2. W tych warunkach mESC tworzą ciała zarodkowe (EBs). Pożywka KSR składa się z minimal essential medium (-MEM) uzupełnionego o 20% KSR, 1 mM pirogronianu sodu, 1% NEAA i 0,1 mM β-merkaptoetanolu/.
- Od 4. do 7. dnia do pożywki KSR lub N2 dodaje się kwas retinowy (RA, 0,2 M) i purmorfaminę (Pur, 1 M), zgodnie z rysunkiem 1A. Pożywka N2 to -MEM zawierająca suplement N2 1X, 1 mM pirogronianu sodu, 1% NEAA i 0,1 mM β-merkaptoetanolu/. Pożywkę wymienia się codziennie.
- W 8. dniu ciała zarodkowe (EBs) są rozbijane przy użyciu TrypLE (5 min, 37°C) i wysiewane na naczynia powleczone 0,01% poliornityną w pożywce OPC, która składa się z pożywki N2 i czynnika wzrostu fibroblastów-2 (FGF-2, 20 ng/ml). Pożywkę wymienia się co dwa dni.
- Komórki są trypsynizowane (TrypLE, 3 min, 37°C) i przesiewane mniej więcej co tydzień, gdy osiągną pełną konfluencję. W 30. dniu ponad 80% komórek wykazuje ekspresję GFP/Olig2 i jest pozytywnych pod kątem NG2, co jest charakterystyczne dla OPC.
- W celu generowania OPC wykazujących aktywność elektryczną (spiking OPCs), używa się zestawu BacMam do kanałów Na+, aby wprowadzić podjednostkę Nav1.2 do tych pochodzących z mESC komórek OPC. Odczynnik BacMam (1 ml, komponent A) miesza się z PBS do końcowej objętości 5 ml. Następnie zmieszany odczynnik BacMam dodaje się do hodowli mESC-derived OPC w 60 mm naczyniu hodowlanym (przy 50-70% konfluencji) przed płukaniem PBS. Po 2-godzinnej inkubacji zmieszany odczynnik BacMam jest usuwany i zastępowany pożywką OPC uzupełnioną o enhancer 1X. Enhancer to komponent B zrekonstytuowany w DMSO (komponent C). Następnie, po dodatkowej 2-godzinnej inkubacji, pożywkę z enhancerem usuwa się i zastępuje pełną pożywką OPC. Analizę komórek przeprowadza się 24 godziny później.
Reprezentatywne wyniki:
Zgodnie z protokołem różnicowania przedstawionym na Ryc. 1A, mESC G-Olig2 zawieszono początkowo w medium KSR na 4 dni w celu utworzenia ciałt embrionalnych (EB) (Ryc. 1B). Następnie EB poddano sekwencyjnej obróbce za pomocą RA i Pur. W 4. dniu EB nie wykazywały fluorescencji GFP, natomiast w 8. dniu (D8) zaobserwowano silną fluorescencję GFP (Ryc. 1B). W tym punkcie czasowym EB poddano trypsynizacji i wysiano w medium N2 uzupełnionym o czynniki wzrostu FGF-2. Po dalszej hodowli przez 22 dni (D30), odsetek komórek GFP+ wyniósł 80,3 ± 0,6% zgodnie z wynikami cytometrii przepływowej. Jak pokazano na Ryc. 1C, komórki GFP+ spójnie nakładały się na barwienie NG2 (96,4 ± 1,3% komórek GFP-dodatnich było NG2-dodatnich, a 94,8 ± 1,5% komórek NG2-dodatnich było GFP-dodatnich). Zatem komórki te wykazują ekspresję GFP/Olig2 oraz NG2, co pozwala zdefiniować je jako OPC.
OPC pochodzące z mESC (76 komórek) nie generowały potencjałów czynnościowych po depolaryzacji (Rys. 2A). Po transdukcji bakulowirusem niosącym podjednostkę Nav1.2, te OPC pochodzące z mESC (94,1%, 16 z 17 komórek) mogły zostać zaklasyfikowane jako komórki generujące impulsy (Rys. 2B).
Rysunek 1. Różnicowanie GOlig-mESC w OPC. (A) Schemat przedstawiający protokół różnicowania oparty na ciałach zarodkowych (EB) i napędzany małymi cząsteczkami. W dniu D8 ciała EB zostały rozaggregowane i wysiane. Komórki pasażowano raz w tygodniu po osiągnięciu konfluencji. (B) Ciała EB w dniu D8, ale nie w dniu D4, wykazały ekspresję GFP. (C) Immunobarwienie NG2 (czerwony) było zgodne z ekspresją GFP (zielony) w dniu D30. DAPI (niebieski) wykorzystano do identyfikacji jąder komórkowych. Pasek skali: 20 mm.
Rysunek 2. Generowanie wykazujących aktywność impulsacyjną OPC z nieimpulsacyjnych OPC pochodzących z mESC poprzez wirusową ekspresję kanałów Nav. (A) Potencjał błonowy utrzymywano na poziomie -60 mV; OPC pochodzące z mESC nie generowały potencjałów czynnościowych, nawet po depolaryzacji komórki do 0 mV. (B) Przykład generowania potencjału czynnościowego (zaznaczonego na czerwono) przez OPC pochodzące z mESC po transdukcji wirusowej.
Dyskusja
embrionalne komórki macierzyste (ESCs), wyizolowane z blastocysty, mogą różnicować się we wszystkie linie komórkowe organizmu 3, 4, stanowiąc model in vitro do badania wczesnego rozwoju ssaków, w tym specyfikacji oligodendrocytów. Wykazano, że mESCs różnicują się w komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPCs) pod wpływem działania białka sonic hedgehog (Shh) 5. Co więcej, indukowane przez Shh różnicowanie OPC z mESCs zachowuje prawidłową chronologię obserwowaną w rozwoju embrionalnym 6. Zatem charakter różnicowania OPC z mESCs in vitro uznaje się za spójny z wiedzą zdobytą na podstawie rozwoju in vivo. W niniejszej pracy, wykorzystując małe cząsteczki RA oraz agonistę Shh, Pur, z sukcesem i wysoką wydajnością zróżnicowano mESCs G-Olig2 w komórki GFP+Olig2+NG2+ OPCs.
OPC, charakteryzujące się ekspresją proteoglikanu NG2 7 oraz czynnika transkrypcyjnego z motywem helix-loop-helix Olig2 8, generują oligodendrocyty w rozwijającym się i dojrzałym OUN, gdzie stanowią znaczący odsetek (~ 5%) wszystkich komórek i są głównym proliferującym typem komórek 9. Przez niemal dwie dekady badacze wykazywali, że kanały NaV są ekspresjonowane w subpopulacji OPC i mogą być aktywowane podczas depolaryzacji 10, 11. Co więcej, niedawna uderzająca obserwacja9 wykazała, że w białej materii OUN szczura in situ, OPC (~ 50%) generowały potencjały czynnościowe podczas depolaryzacji w zależności od ekspresji napięciowo zależnych kanałów sodowych (NaV), a zatem można je podzielić na subpopulacje generujące i niegenerujące impulsów (spiking i nonspiking). Funkcje tych właściwości generowania impulsów pozostają jednak w dużej mierze nieznane. Stwierdziliśmy, że pod względem elektrofizjologicznym OPC pochodzące z mESC, zróżnicowane zgodnie z protokołem zależnym od Shh, nie były identyczne z OPC mózgu in situ. Po wprowadzeniu podjednostki NaV1.2 te nieaktywne OPC pochodzące z mESC zyskały zdolność do generowania impulsów.
Zatem opisane tutaj OPC pochodzące z mESC, wykazujące lub niewykazujące aktywności impulsowej, oraz protokół różnicowania mogą ułatwić (1) badanie różnic funkcjonalnych między impulsowymi a nieimpulsowymi OPC, (2) przesiewanie nowych czynników, które mogłyby promować ekspresję kanałów sodowych w OPC pochodzących z mESC, (3) opracowanie i optymalizację protokołu różnicowania OPC z ludzkich ESC lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs).
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca była częściowo finansowana z grantów przyznanych W.D. przez National Institutes of Health (RO1 NS059043 oraz RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Foundation for Anemia Research, Feldstein Medical Foundation oraz Shriners Hospitals for Children.
Dziękujemy dr. Davidowi Pleasure'owi oraz Jennifer Plane za sugestie. Oświadczamy, że nie istnieją żadne konflikty interesów związane z niniejszym artykułem.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| MEF | GlobalStem | GSC-6001G | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | |
| Kwas retinowy | Sigma-Aldrich | R-2625 | |
| Purmorfamina | Cayman Chemical | 10009634 | |
| FGF-2 | EMD Millipore | GF003 | |
| BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |
Bibliografia
- Xian, H., Gottlieb, D. I. Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells. Glia. 47 (1), 88-101 (2004).
- Clair, A., Gottlieb, D. I. A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting. Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).
- Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells. J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).
- Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain. J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).
- Ligon, K. L. Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).
- Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).
- Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561, 109-122 (2004).
- Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter. Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).
Przedruki i uprawnienia
