Artykuł metodologiczny

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów

DOI:

10.3791/1960

⸱

19 maja 2010

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Human Anatomy Institute for Pediatric Regenerative Medicine, School of Medicine, University of California, Davis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół oparty na małych cząsteczkach służący do różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC). Protokół ten pozwala na wysokowydajne generowanie komórek OPC Olig2+NG2+ w ciągu 30 dni różnicowania. Opisujemy również metodę generowania „spiking” OPC, które są zdolne do generowania potencjałów czynnościowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Oligodendrocyty są komórkami mielinizującymi ośrodkowego układu nerwowego. W kontekście regeneracyjnej terapii komórkowej w chorobach demielinizacyjnych istnieje duże zainteresowanie uzyskiwaniem czystej populacji zdeterminowanych progenitorów oligodendrocytów (OPC) do transplantacji. OPC charakteryzują się aktywnością czynnika transkrypcyjnego Olig2 oraz ekspresją powierzchniową proteoglikanu NG2. Wykorzystując linię reporterową embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) GFP-Olig2 (G-Olig2), zoptymalizowaliśmy warunki różnicowania mESC w komórki GFP+Olig2+NG2+ OPC. W naszym protokole opisujemy najpierw generowanie ciał embrionalnych (EB) z mESC. Następnie opisujemy traktowanie pochodnych od mESC ciał EB małymi cząsteczkami: (1) kwasem retinowym (RA) oraz (2) agonistą białka sonic hedgehog (Shh), purmorfaminą (Pur), w określonych warunkach hodowli w celu ukierunkowania różnicowania EB w kierunku linii oligodendroglialnej. Dzięki temu podejściu OPC można uzyskać z wysoką wydajnością (>80%) w czasie 30 dni. Komórki pochodne mESC uzyskane w tym protokole są fenotypowo podobne do OPC pochodzących z pierwotnych kultur tkankowych. OPC pochodne mESC nie wykazują właściwości generowania potencjałów kolczastych (spiking), które opisano dla subpopulacji OPC mózgu in situ. Aby zbadać tę właściwość elektrofizjologiczną, opisujemy generowanie wykazujących spiking OPC pochodnych mESC poprzez ektopową ekspresję NaVpodjednostka 1.2. Komórki generujące i niegenerujące impulsów uzyskane dzięki temu protokołowi pomogą w rozwoju badań funkcjonalnych nad dwiema subpopulacjami OPC.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowe procedury generowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPCs) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESCs) GFP-Olig2:

  1. Linia komórek embrionalnych myszy ES GFP-Olig2 (G-Olig2) zostaje zakupiona z American Type Culture Collection (ATCC). mESC są rutynowo pasażowane co 3 dni na warstwę karmioną z napromieniowanych embrionalnych fibroblastów mysich (MEF). Komórki MEF wysiewa się na płytkę hodowlaną z sześcioma dołkami pokrytą 0,1% żelatyną co najmniej jeden dzień przed pasażowaniem ESC. Pożywka do hodowli mESC to modyfikowana pożywka Eagle'a dla podłoża Dulbecco (DMEM) (GIBCO) uzupełniona o 20% płodowej surowicy bydlęcej (GIBCO), 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 1% nieessentialnych aminokwasów (NEAA) oraz 1 000 U/ml czynnika hamującego białaczkę.
  2. Kolonie mES poddaje się trypsynizacji (TrypLE, 5 min, 37°C) do pojedynczych komórek i zawiesza w pożywce z zamiennikiem surowicy KnockOut (KSR), następnie komórki przenosi się na płytkę z sześcioma dołkami o ultra-niskim przywieraniu Costar (Corning) przy gęstości komórkowej 50 000 komórek/cm2. W tych warunkach mESC tworzą ciała embrionalne (EB). Pożywka KSR składa się z minimalnej pożywki niezbędnej (-MEM) uzupełnionej o 20% KSR, 1 mM pirogronianu sodu, 1% NEAA oraz 0,1 mM β-merkaptoetanolu.
  3. Od 4. do 7. dnia do pożywki KSR lub N2 dodaje się kwas retinowy (RA, 0,2 M) i purmorfaminę (Pur, 1 M), zgodnie z rysunkiem 1A. Pożywka N2 to -MEM zawierająca suplement N2 w stężeniu 1X, 1 mM pirogronianu sodu, 1% NEAA oraz 0,1 mM β-merkaptoetanolu. Pożywkę wymienia się codziennie.
  4. W 8. dniu ciała EB są rozbijane za pomocą TrypLE (5 min, 37°C) i wysiewane na naczynia pokryte 0,01% poliornityną w pożywce OPC, która składa się z pożywki N2 i czynnika wzrostu fibroblastów-2 (FGF-2, 20 ng/ml). Pożywkę wymienia się co dwa dni.
  5. Komórki poddaje się trypsynizacji (TrypLE, 3 min, 37°C) i przesiewają w przybliżeniu co tydzień, gdy osiągną konfluencję. W 30. dniu ponad 80% komórek wykazuje ekspresję GFP/Olig2 i jest pozytywnych pod kątem NG2, co jest charakterystyczne dla OPC.
  6. Aby wygenerować OPC wykazujące aktywność impulsową (spiking OPCs), zestaw BacMam dla kanałów Na+ jest wykorzystywany do wprowadzenia podjednostki Nav1.2 do tych OPC pochodzących z mESC. Odczynnik BacMam (1 ml, komponent A) miesza się z PBS do końcowej objętości 5 ml. Następnie zmieszany odczynnik BacMam dodaje się do hodowli OPC pochodzących z mESC w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm (przy 50-70% konfluencji) po uprzednim wypłukaniu PBS. Po 2-godzinnej inkubacji zmieszany odczynnik BacMam usuwa się i zastępuje pożywką OPC uzupełnioną o enhancer w stężeniu 1X. Enhancer to komponent B rozpuszczony w DMSO (komponent C). Następnie, po kolejnej 2-godzinnej inkubacji, pożywkę z enhancerem usuwa się i zastępuje pełną pożywką OPC. Analizę komórek przeprowadza się 24 godziny później.

Reprezentatywne wyniki:

Zgodnie z protokołem różnicowania przedstawionym na Ryc. 1A, mESC G-Olig2 zawieszono początkowo w medium KSR na 4 dni w celu utworzenia ciał embrionalnych (EB) (Ryc. 1B). Następnie ciała EB poddano sekwencyjnemu traktowaniu RA oraz Pur. W 4. dniu ciała EB nie wykazywały fluorescencji GFP, natomiast w 8. dniu (D8) wykazano silną fluorescencję GFP (Ryc. 1B). W tym punkcie czasowym ciała EB poddano trypsynizacji i wysiano w medium N2 suplementowanym czynnikami wzrostu FGF-2. Po dalszej hodowli przez 22 dni (D30), odsetek komórek GFP+ osiągnął 80,3 ± 0,6% zgodnie z wynikami cytometrii przepływowej. Jak pokazano na Ryc. 1C, komórki GFP+ wykazywały spójne nakładanie się z barwieniem NG2 (96,4 ± 1,3% komórek GFP dodatnich było jednocześnie NG2 dodatnich, a 94,8 ± 1,5% komórek NG2 dodatnich było GFP dodatnich). Zatem komórki te wykazują ekspresję GFP/Olig2 oraz NG2, co definiuje je jako OPC.

OPC pochodne z mESC (76 komórek) nie generowały potencjałów czynnościnościowych po depolaryzacji (Rys. 2A). Po transdukcji bakulowirusem niosącym podjednostkę Nav1.2, te OPC pochodne z mESC (94,1%, 16 z 17 komórek) mogły zostać zaklasyfikowane jako komórki wykazujące aktywność impulsową (Rys. 2B).

Oś czasu różnicowania neuronalnego, obrazy mikroskopowe; dni wzrostu komórek 4-30, analiza fluorescencji.
Rysunek 1. Różnicowanie GOlig-mESC do OPCs. (A) Schemat przedstawiający protokół różnicowania w oparciu o ciałka zarodkowe (EB) i sterowane małymi cząsteczkami. W dniu D8 ciałka EB zostały rozdzielone i wysiane. Komórki pasażowano raz w tygodniu po osiągnięciu konfluencji. (B) Ciałka EB w dniu D8, ale nie w dniu D4, wykazywały ekspresję GFP. (C) Immunobarwienie NG2 (czerwone) było zgodne z ekspresją GFP (zielone) w dniu D30. DAPI (niebieski) zastosowano do identyfikacji jąder komórkowych. Pasek skali: 20 mm.

Analiza zaciskowego pomiaru napięcia, prądy przy -60 mV, schemat przedstawiający porównanie aktywności kanałów jonowych, oznaczone A/B.
Rycina 2. Generowanie OPC wykazujących aktywność impulsową z nieimpulsowych OPC pochodnych z mESC poprzez wirusową ekspresję kanałów Nav. (A) Potencjał błonowy utrzymywano na poziomie -60 mV; OPC pochodne z mESC nie generowały potencjałów czynnościnościowych, nawet po depolaryzacji komórki do 0 mV. (B) Przykład generowania potencjału czynnościnościowego (wyróżniono na czerwono) przez OPC pochodne z mESC po transdukcji wirusowej.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

embrionalne komórki macierzyste (ESCs), wyizolowane z blastocysty, mogą różnicować się we wszystkie linie komórkowe organizmu 3, 4, stanowiąc model in vitro do badania wczesnego rozwoju ssaków, w tym specyfikacji oligodendrocytów. Wykazano, że mESCs różnicują się w komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPCs) pod wpływem działania białka sonic hedgehog (Shh) 5. Co więcej, indukowane przez Shh różnicowanie OPC z mESCs zachowuje prawidłową chronologię obserwowaną w rozwoju embrionalnym 6. Zatem charakter różnicowania OPC z mESCs in vitro uznaje się za spójny z wiedzą zdobytą na podstawie rozwoju in vivo. W niniejszej pracy, wykorzystując małe cząsteczki RA oraz agonistę Shh, Pur, z sukcesem i wysoką wydajnością zróżnicowano mESCs G-Olig2 w komórki GFP+Olig2+NG2+ OPCs.

OPC, charakteryzujące się ekspresją proteoglikanu NG2 7 oraz czynnika transkrypcyjnego z motywem helix-loop-helix Olig2 8, generują oligodendrocyty w rozwijającym się i dojrzałym OUN, gdzie stanowią znaczący odsetek (~ 5%) wszystkich komórek i są głównym proliferującym typem komórek 9. Przez niemal dwie dekady badacze wykazywali, że kanały NaV są ekspresjonowane w subpopulacji OPC i mogą być aktywowane podczas depolaryzacji 10, 11. Co więcej, niedawna uderzająca obserwacja9 wykazała, że w białej materii OUN szczura in situ, OPC (~ 50%) generowały potencjały czynnościowe podczas depolaryzacji w zależności od ekspresji napięciowo zależnych kanałów sodowych (NaV), a zatem można je podzielić na subpopulacje generujące i niegenerujące impulsów (spiking i nonspiking). Funkcje tych właściwości generowania impulsów pozostają jednak w dużej mierze nieznane. Stwierdziliśmy, że pod względem elektrofizjologicznym OPC pochodzące z mESC, zróżnicowane zgodnie z protokołem zależnym od Shh, nie były identyczne z OPC mózgu in situ. Po wprowadzeniu podjednostki NaV1.2 te nieaktywne OPC pochodzące z mESC zyskały zdolność do generowania impulsów.

Zatem opisane tutaj OPC pochodzące z mESC, wykazujące lub niewykazujące aktywności impulsowej, oraz protokół różnicowania mogą ułatwić (1) badanie różnic funkcjonalnych między impulsowymi a nieimpulsowymi OPC, (2) przesiewanie nowych czynników, które mogłyby promować ekspresję kanałów sodowych w OPC pochodzących z mESC, (3) opracowanie i optymalizację protokołu różnicowania OPC z ludzkich ESC lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs).

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsza praca była częściowo finansowana z grantów przyznanych W.D. przez National Institutes of Health (RO1 NS059043 oraz RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Foundation for Anemia Research, Feldstein Medical Foundation oraz Shriners Hospitals for Children.

Dziękujemy dr. Davidowi Pleasure'owi oraz Jennifer Plane za sugestie. Oświadczamy, że nie istnieją żadne konflikty interesów związane z niniejszym artykułem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MEFGlobalStemGSC-6001G
TrypLE ExpressInvitrogen12604
Kwas retinowySigma-AldrichR-2625
PurmorfaminaCayman Chemical10009634
FGF-2EMD MilliporeGF003
BacMam NaV 1.2InvitrogenB10341

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xian, H., Gottlieb, D. I. Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells. Glia. 47 (1), 88-101 (2004).
  2. Clair, A., Gottlieb, D. I. A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting. Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).
  3. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  4. Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  5. Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).
  6. Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells. J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain. J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).
  8. Ligon, K. L. Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).
  9. Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).
  10. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561, 109-122 (2004).
  11. Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter. Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cia ka embrionalnetraktowanie kwasem retinowymagonista purmorfaminar nicowanie OPCreporter GFP Olig2marker powierzchniowy NG2kolczaste OPCtransdukcja wirusowa

Powiązane artykuły