Artykuł metodologiczny

Test bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) dla interakcji białko-białko w komórkach cebuli przy użyciu pistoletu genowego Helios

DOI:

10.3791/1963

⸱

12 czerwca 2010

 , 
1Dept. Of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł ilustruje, jak prawidłowo używać pistoletu genowego BioRad Helios do wprowadzania plazmidowego DNA do komórek naskórka cebuli i jak testować interakcje białko-białko w komórkach cebuli w oparciu o zasadę dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC)

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Badanie funkcji genów w różnych organizmach opiera się na wiedzy o tym, w jaki sposób produkty genów oddziałują ze sobą w swoim normalnym środowisku komórkowym. Test bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC)1 umożliwia naukowcom wizualizację interakcji białko-białko w żywych komórkach i stał się podstawowym narzędziem badawczym. Test ten opiera się na ułatwionym asocjacji dwóch fragmentów białka fluorescencyjnego (GFP), z których każdy jest połączony z potencjalnym oddziałującym partnerem białkowym. Interakcja dwóch partnerów białkowych ułatwiłaby asocjację N-końcowego i C-końcowego fragmentu GFP, prowadząc do fluorescencji. Dla badaczy roślin komórki naskórka cebuli są idealnym systemem eksperymentalnym do przeprowadzania testu BiFC ze względu na łatwość uzyskiwania i przygotowywania tkanek cebuli oraz bezpośrednią wizualizację fluorescencji przy minimalnej fluorescencji tła. Helios Gene Gun (BioRad) jest powszechnie używany do bombardowania plazmidowego DNA w komórkach cebuli. Demonstrujemy zastosowanie Helios Gene Gun do wprowadzenia konstruktów plazmidowych dla dwóch oddziałujących czynników transkrypcyjnych Arabidopsis thaliana, SEUSS (SEU) i LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 oraz wizualizację ich interakcji za pośrednictwem BiFC w komórkach naskórka cebuli.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I. Przygotowanie plazmidu

Plazmidowe DNA używane do bombardowania musi być wysokiej czystości i w stężeniu 500ng/μl lub większym. W przypadku BiFC obejmującego dwa konstrukty plazmidowe potrzebne jest 25 μg każdego plazmidu. Innymi słowy, stosunek molowy 1:1 dwóch plazmidów należy wymieszać, aby uzyskać 50 μg całkowitego DNA plazmidu do przygotowania wkładów. Należy pamiętać, że dodanie większej ilości DNA niż 50 μg może spowodować aglomerację cząsteczek złota i należy tego unikać. Do izolowania plazmidowego DNA zalecane są dostępne na rynku zestawy do ekstrakcji plazmidowego DNA.

Wektory plazmidowe powinny być stosunkowo małe, takie jak pUC19. Sklonowaliśmy cDNA SEU i LUH odpowiednio do pUC19-SPYNE i pUC19-SPYCE3. Wektory binarne dla transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium, są zbyt duże i nieodpowiednie dla bombardowania.

II. Przygotowanie wkładu

Przygotowanie kartridża polega na pokryciu cząsteczek złota plazmidowym DNA i załadowaniu ich do plastikowej rurki, która jest następnie cięta na półcalowe kawałki, które można załadować do uchwytów na naboje do pistoletów genowych. Przygotowanie kartridża jest opisane bardzo szczegółowo w osobnym artykule4 Jowisza i dlatego nie jest tutaj opisane. Do bombardowania komórek cebuli zalecamy zmieszanie 50 μg plazmidowego DNA z 12,5 mg cząstek złota na preparat, co daje około 50 wkładów przy 1 μg DNA/0,25 mg złota/wkład. Każdy nabój jest przeznaczony do jednego strzału. Cząsteczki złota mogą mieć średnicę 0,6 μm lub 1,0 μm (Cat #1652262 lub Cat #1652263; Biorad). Zalecamy również użycie 0,5 mg/ml roztworu PVP do przygotowania wkładu. W przypadku BiFC należy połączyć dwa plazmidowe DNA każdego przypuszczalnego partnera oddziałującego w tym samym preparacie kartridża.

Po przygotowaniu kartridży, ważne jest, aby przetestować naboje, wystrzeliwując nowo wyprodukowane naboje pod ciśnieniem helu między 150 a 200 psi do kwadratowego Parafilmu, który jest owinięty wokół szalki Petriego. Pozwoli to sprawdzić, czy cząsteczki złota mogą być skutecznie wypychane z wkładów; powinieneś zobaczyć słabe cząsteczki złota na Parafilmie. Daje to wyobrażenie o obszarze, który pokryje każde ujęcie. Możesz zauważyć różne ilości cząsteczek złota wypychanych na Parafilm przy różnych ciśnieniach helu (w zakresie 150-200 psi). Jeśli nie ma znaczącej różnicy, wybierz niższe ciśnienie do bombardowania.

III. Przygotowanie tkanek cebuli

W dniu strzelania, zdejmij zewnętrzną skórkę z dużej żółtej cebuli. Za pomocą czystej i ostrej żyletki wytnij 4-5 warstw na głębokość prostokąta o wymiarach około 2 x 8 cm. Wyjmij prostokątną tkankę cebuli, wyrzuć dwie zewnętrzne warstwy, pozostałe warstwy cebuli pokrój na kawałki o wymiarach około 2X1,5 cm. Umieść kawałki cebuli na szalce Petriego zawierającej bibułę filtracyjną (papier Whatman 3MM pociętą w kółka) zwilżoną sterylną wodą. Przykryj szalkę Petriego i są gotowe do pracy.

IV. Bombardowanie

  1. Załaduj wkłady do białych okrągłych uchwytów na naboje. Wkłady zawierające różne konstrukcje plazmidowe powinny być ładowane do różnych uchwytów wkładów. Każdy uchwyt na naboje może pomieścić do 12 nabojów na 12 strzałów.
  2. Włóż baterię i świeżą wkładkę lufy do pistoletu Helios Gene Gun. Upewnij się, że zarówno wkładka lufy, jak i pistolet mają zamocowane odpowiednie o-ringi.
  3. Najpierw włóż pusty uchwyt na nabój do pistoletu genowego, z oznaczeniem #12 na uchwycie naboju skierowanym w górną część pistoletu. Przesuń uchwyt wkładu raz lub dwa razy, aby upewnić się, że jest prawidłowo włożony.
  4. Przymocuj pistolet do zbiornika helu i wyreguluj ciśnienie w zakresie od 150 do 200 psi.
  5. Załóż ochronniki słuchu i kilkakrotnie odpal pistolet z pustym uchwytem na naboje, aby wyczyścić komorę pistoletu i upewnić się, że ciśnienie jest stabilne.
  6. Wyjmij pusty uchwyt na naboje i włóż załadowany uchwyt na naboje. Przesuń uchwyt naboju tak, aby nabój, który chcesz wystrzelić, znajdował się na dole (godzina 6) uchwytu naboju. Strzelanie do kawałka cebuli w tym miejscu zapewnia formę negatywnej kontroli fluorescencji tła.
  7. Umieść kawałki cebuli na środku pustej szalki Petriego najbardziej wewnętrzną warstwą cebuli skierowaną do góry. Oprzyj wkładkę lufy pistoletu genowego na szalce Petriego i odpal broń, przytrzymując boczny przycisk podczas pociągania za spust. Przenieś zbombardowaną cebulę na szalkę Petriego zawierającą wilgotną bibułę filtracyjną o grubości 3 mm.
  8. Przejdź do następnego naboju i wystrzel inny kawałek cebuli. Powtarzaj ten krok, aż wystrzeliwujesz od czterech do pięciu kawałków cebuli. Każdy kawałek cebuli jest strzelany raz.
  9. Zmienić na inny uchwyt wkładu załadowany wkładami zawierającymi inny plazmid lub inną kombinację plazmidów. Pamiętaj również o wymianie wkładki lufy, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Strzel od czterech do pięciu kawałków cebuli.
  10. Po bombardowaniu włóż całą cebulę do potraw perti. Przykryj szalki Petriego pokrywkami. Owiń je Parafilmem, aby zapobiec wysuszeniu. Inkubuj kawałki cebuli w temperaturze pokojowej w ciemności przez 16-48 godzin.
  11. Wyłącz gaz i zwolnij ciśnienie przed odłączeniem pistoletu genowego od zbiornika helu. Odkręć wkładkę lufy i wyjmij uchwyt naboju oraz zużyte (lub nieużywane) naboje.
  12. Czyszczenie uchwytów nabojów i wkładek lufy poprzez zanurzenie ich w zlewce z wodą z mydłem. Umieścić zlewkę w soniku do kąpieli i sonikować przez 20 minut. Następnie spłucz je wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości mydła. Namocz je w 70% etanolu na godzinę, a następnie wysusz na ręcznikach papierowych.

V. Obserwacja

  1. Po inkubacji bombardowanych kawałków cebuli przez 16-20 godzin w temperaturze pokojowej, możemy obserwować fluorescencję GFP lub YFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, takiego jak Zeiss Axio Observer.z1 użyty w tym badaniu.
  2. Użyj kleszczyków z płaskimi końcami, aby powoli oderwać pojedynczą warstwę komórek od wewnętrznego naskórka cebuli (warstwy, która jest bezpośrednio skierowana w stronę pistoletu podczas bombardowania). Umieść skórkę na kropli wody na szkiełku. Dodaj szkiełko nakrywkowe, ale uważaj, aby zminimalizować bąbelki.
  3. W jasnym polu mikroskopu najpierw sprawdź, czy nie ma strumieni cytoplazmatycznych, aby upewnić się, że komórki są żywe. Aby to zrobić, wystaw szkiełko na jasne światło pola przez kilka minut, aby rozgrzać tkankę cebuli, a następnie poszukaj poruszających się plastydów. Strumieniowanie cytoplazmatyczne nie zawsze jest łatwe do zauważenia, więc nie zniechęcaj się, jeśli ich nie widzisz.
  4. Do detekcji fluorescencji należy użyć odpowiednich filtrów wzbudzenia i detekcji dla GFP lub YFP. Ważne jest, aby uwzględnić kontrole negatywne, takie jak kawałki cebuli przestrzelone plazmidem niefluorescencyjnym. Słabe żółte sygnały mogą pojawić się z uszkodzonych komórek, pęcherzyków powietrza lub zanieczyszczeń. Ważne jest również, aby uwzględnić kontrole pozytywne. Plazmid zawierający konstytutywnie wyrażony reporter fluorescencyjny, taki jak 35S::GFP, jest doskonałą kontrolą pozytywną. Widoczne sygnały GFP z komórek naskórka cebuli (ryc. 1A, D) wskazują, że wkłady, tkanki cebuli i wystrzeliwanie pistoletu genowego są odpowiednio przygotowane i wykonane. Następnie zaobserwowaliśmy interakcje między SEU-pSPYNE i LUH-pSPYCE w kawałkach cebuli bombardowanych wkładami zawierającymi mieszaninę DNA 35S::SEU-pSPYNE i 35S::LUH-pSPYCE. Słabą fluorescencję YFP zaobserwowano tylko w jądrze (Figura 1 B, E), co wskazuje na bezpośrednią fizyczną interakcję między SEU i LUH, która zbliżyła do siebie rozszczepione fragmenty YFP w jądrze. Należy zauważyć, że sygnał YFP z BiFC jest znacznie słabszy niż sygnał GFP z 35S::GFP.

Reprezentatywne wyniki

W naszym opisanym tutaj badaniu, plazmid kontroli pozytywnej 35S::GFP emituje silną fluorescencję, która wypełnia całą komórkę, w tym zarówno jądro, jak i cytoplazmę (Rysunek 1A, D). Białko GFP jest na tyle małe, że może dyfundować do jądra bez sygnału lokalizacji jądrowej. Natomiast SEU i LUH to dwa czynniki transkrypcyjne Arabidopsis, które wcześniej okazały się oddziaływać w teście dwuhybrydowym drożdży2. SEU-pSPYNE (SEU sprzężony z N-końcowym fragmentem YFP) i LUH-pSPYCE (SEU połączony z N-końcowym fragmentem YFP), oba zbyt duże, aby dyfundować do jądra, zawierają sygnały lokalizacji jądrowej2,5. Sygnał fluorescencyjny YFP wykryty w jądrze komórki cebuli (ryc. 1 B, E) wskazuje, że SEU-pSPYNE i LUH-pSPYCE mogą oddziaływać w jądrach cebuli. Nie wykrywa się sygnału fluorescencyjnego w cebuli bombardowanej mieszanką plazmidu wektorowego pSPYNE zawierającą N-końcowy fragment YFP i LUH-pSPYCE (Figura 1C, F).

Fluorescencja YFP za pośrednictwem BiFC jest znacznie słabsza niż fluorescencja za pośrednictwem GFP z plazmidu 35S::GFP. W naszym badaniu wykazały one również różną lokalizację subkomórkową (porównaj ryc. 1A z B). Ponadto liczba komórek fluorescencyjnych jest znacznie niższa w przypadku BiFC, ponieważ BiFC działa tylko wtedy, gdy oba plazmidy partnerskie pomyślnie wchodzą i ulegają ekspresji w tych samych komórkach cebuli.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Obrazy fluorescencyjne (A, B, C) i jasnego pola (D, E, F) komórek cebuli bombardowane różnymi konstruktami plazmidowymi. (A) i (D), Komórki cebuli bombardowane 35S::GFP. GFP dyfunduje przez cytoplazmę i jądro. (B) i (E), komórki cebuli bombardowane równymi mieszankami molowymi DNA plazmidu 35S::SEU-pSPYNE (SEU połączonego z N-końcowym fragmentem YFP) i 35S::LUH-pSPYCE (LUH połączonego z fragmentem C-końcowym). Interakcja pomiędzy SEU-pSPYNE i LUH-pSPYCE jest wykazywana przez jądro fluorescencyjne. (C) i (F), kontrola ujemna pokazująca komórki cebuli bombardowane mieszankami plazmidów wektorowych pUC19-SPYNE i LUH-pSPYCE. Nie jest wykrywany sygnał fluorescencyjny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dla początkujących użytkowników zalecamy przećwiczenie całej procedury, od przygotowania wkładu po obserwację, z pojedynczym reporterem konstytutywnym plazmidu, takim jak 35S::GFP lub 35S::GUS. Użyliśmy plazmidu 35S::GFP uzyskanego od dr Steve'a Mounta i Xiaoning Zhang6 (ryc. 1A, D). Wkłady kontrolne zastrzyków genowych sprzedawane w RioRad (kat. 165-2244) nie są odpowiednie dla roślin.
  2. W przypadku BiFC konieczna jest druga kontrola pozytywna, która powinna składać się z dwóch znanych oddziałujących partnerów poł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy doktorom Steve'owi Mountowi i Xiaoning Zhangowi za konstrukt 35S::GFP pGlowbug i stypendium doktoranckie Hokensen dla C. H. Badania w laboratorium Z. L. są wspierane przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (IOB0616096 i MCB0744752). Z.L. jest częściowo wspierany przez Rolniczą Stację Doświadczalną Uniwersytetu Maryland.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cebula żółtaDowolny dostawca Helios
Gene GunBio-Rad
Mikroskop fluorescencyjny z odpowiednimi filtrami do GFP lub YFPZeiss, Nikon, Olympus

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
  2. Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
  3. Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
  4. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
  5. Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
  6. Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bimolecular Fluorescence ComplementationProtein Protein InteractionOnion Epidermal CellsHelios Gene GunFluorescence MicroscopyPlasmid BombardmentGold Particle CoatingSEU LUH InteractionYFP Fluorescence DetectionNegative Control Assay

Powiązane artykuły