Niniejszy artykuł ilustruje, jak prawidłowo używać gene gun BioRad Helios do wprowadzania plazmidowego DNA do komórek epidermy cebuli oraz jak badać oddziaływania białko-białko w komórkach cebuli w oparciu o zasadę bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC)
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) w celu badania oddziaływań białko-białko w komórkach cebuli z wykorzystaniem armatki genowej Helios
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie funkcji genów w różnych organizmach opiera się na wiedzy o tym, w jaki sposób produkty genów oddziałują ze sobą w ich naturalnym środowisku komórkowym. Test bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC)1pozwala badaczom na wizualizację oddziaływań białko-białko w żywych komórkach i stało się niezbędnym narzędziem badawczym. Analiza ta opiera się na ułatwionym łączeniu się dwóch fragmentów białka fluorescencyjnego (GFP), z których każdy jest połączony z potencjalnym białkiem partnerskim. Oddziaływanie dwóch partnerów białkowych ułatwia asocjację fragmentu N-końcowego i C-końcowego GFP, co prowadzi do powstania fluorescencji. Dla badaczy roślin komórki epidermy cebuli stanowią idealny system eksperymentalny do przeprowadzania analizy BiFC ze względu na łatwość pozyskiwania i przygotowania tkanek cebuli oraz możliwość bezpośredniej wizualizacji fluorescencji przy minimalnej fluorescencji tła. Do bombardowania komórek cebuli DNA plazmidowym powszechnie wykorzystuje się Helios Gene Gun (BioRad). Prezentujemy zastosowanie Helios Gene Gun do wprowadzania konstruktów plazmidowych dla dwóch oddziałującychArabidopsis thalianaczynniki transkrypcyjne, SEUSS (SEU) oraz LEUNIG HOMOLOG (LUH)2oraz wizualizacja ich oddziaływań pośredniczonych przez BiFC w komórkach epidermy cebuli.
Protokół
I. Przygotowanie plazmidu
Plazmidowe DNA używane do bombardowania musi charakteryzować się wysoką czystością i stężeniem wynoszącym 50ng/μl lub wyższym. W przypadku BiFC z wykorzystaniem dwóch konstruktów plazmidowych wymagane jest 25 μg każdego z plazmidów. Innymi słowy, należy zmieszać dwa plazmidy w stosunku molowym 1:1, aby uzyskać łącznie 50 μg plazmidowego DNA do przygotowania wkładów. Należy pamiętać, że dodanie więcej niż 50 μg DNA może spowodować aglomerację cząsteczek złota, czego należy unikać. Do izolacji plazmidowego DNA zaleca się stosowanie dostępnych komercyjnie zestawów do ekstrakcji DNA plazmidowego.
Wektory plazmidowe powinny być stosunkowo małe, np. pUC19. Sklonowano cDNA SEU oraz LUH odpowiednio do pUC19-SPYNE i pUC19-SPYCE3. Wektory binarne do transformacji za pośrednictwem Agrobacterium są zbyt duże i nieodpowiednie do bombardowania.
II. Przygotowanie kartridża
Przygotowanie wkładów polega na powleczeniu cząsteczek złota plazmidowym DNA i umieszczeniu ich w plastikowej rurce, która następnie jest cięta na kawałki o długości pół cala, możliwe do umieszczenia w uchwytach wkładów do armaty genowej. Przygotowanie wkładów zostało szczegółowo opisane w osobnym artykule Jove4, dlatego nie opisuje się go tutaj. W przypadku bombardowania komórek cebuli zalecamy zmieszanie 50 μg plazmidowego DNA z 12,5 mg cząsteczek złota na jedną partię preparatu, co pozwala uzyskać do 50 wkładów przy stężeniu 1 μg DNA/0,25 mg złota na wkład. Każdy wkład służy do jednego strzału. Cząsteczki złota mogą mieć średnicę 0,6 μm lub 1,0 μm (Cat #165262 lub Cat #165263; Biorad). Do przygotowania wkładów zalecamy również stosowanie roztworu PVP o stężeniu 0,5 mg/ml. W przypadku BiFC należy połączyć dwa plazmidowe DNA każdego z domniemanych partnerów oddziałujących w obrębie jednej partii preparatu wkładów.
Po przygotowaniu wkładów należy je przetestować, wystrzeliwując nowo wykonane wkłady pod ciśnieniem helu od 150 do 20 psi w kwadratowy fragment Parafilmu owinięty wokół szalki Petriego. Pozwoli to sprawdzić, czy cząstki złota są efektywnie wyrzucane z wkładów; na Parafilmie powinny pojawić się słabo widoczne cząstki złota. Pozwala to ocenić obszar, który zostanie pokryty przez pojedynczy strzał. Można zauważyć różną ilość cząstek złota wyrzuconych na Parafilm przy różnych ciśnieniach helu (w zakresie 150-20 psi). Jeśli nie występuje istotna różnica, do bombardowania należy wybrać niższe ciśnienie.
III. Przygotowanie tkanek cebuli
W dniu przeprowadzania zdjęć obierz zewnętrzną warstwę skórki z dużej żółtej cebuli. Używając czystego i ostrego ostrza żyletki, wytnij obszar prostokątny o wymiarach około 2 X 8 cm na głębokość 4-5 warstw. Wyjmij prostokątną tkankę cebuli, odrzuć dwie zewnętrzne warstwy, a pozostałe warstwy cebuli potnij na kawałki o rozmiarach około 2X1,5 cm. Umieść kawałki cebuli w szalce Petriego zawierającej papier filtracyjny (wycięte w krążki papier Whatman 3MM) zwilżony sterylną wodą. Przykryj szalkę Petriego; próbki są gotowe do użycia.
IV. Bombardowanie
- Załaduj wkłady do białych, okrągłych uchwytów na wkłady. Wkłady zawierające różne konstrukty plazmidowe należy załadować do osobnych uchwytów. Każdy uchwyt może pomieścić do 12 wkładów na 12 strzałów.
- Włóż baterię i nową wkładkę lufy do pistoletu genowego Helios. Upewnij się, że zarówno wkładka lufy, jak i pistolet mają zamontowane odpowiednie uszczelki typu o-ring.
- Najpierw włóż do pistoletu genowego pusty uchwyt na wkłady, tak aby oznaczenie #12 na uchwycie było skierowane ku górze pistoletu. Przesuń uchwyt raz lub dwa razy, aby upewnić się, że został poprawnie zainstalowany.
- Podłącz pistolet do butli z helem i ustaw ciśnienie w zakresie od 150 do 20 psi.
- Załóż ochronniki słuchu i oddaj kilka strzałów z pustym uchwytem, aby oczyścić komorę pistoletu i upewnić się, że ciśnienie jest stabilne.
- Wyjmij pusty uchwyt i włóż załadowany uchwyt na wkłady. Przesuń uchwyt tak, aby wkład, z którego chcesz wystrzelić, znajdował się na dole (godzina 6) uchwytu. Wystrzelenie w kawałek cebuli na tym etapie stanowi formę kontroli negatywnej dla fluorescencji tła.
- Umieść kawałki cebuli na środku pustej szalki Petriego, tak aby wewnętrzna warstwa cebuli była skierowana do góry. Oprzyj wkładkę lufy pistoletu genowego o szalkę Petriego i oddaj strzał, przytrzymując boczny przycisk i naciskając spust. Przenieś bombardowaną cebulę do szalki Petriego zawierającej zwilżony papier filtrujący 3MM.
- Przejdź do następnego wkładu i wystrzel w inny kawałek cebuli. Powtarzaj ten krok, aż zostanie wystrzelonych od czterech do pięciu kawałków cebuli. Każdy kawałek cebuli jest ostrzeliwany raz.
- Zmień uchwyt na inny, załadowany wkładami zawierającymi inny plazmid lub inną kombinację plazmidów. Pamiętaj o wymianie wkładki lufy, aby zapobiec kontaminacji. Wystrzel w cztery do pięciu kawałków cebuli.
- Po bombardowaniu przenieś wszystkie kawałki cebuli z powrotem do szalek Petriego. Przykryj szalki pokrywkami. Owiń je Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu. Inkubuj kawałki cebuli w temperaturze pokojowej w ciemności przez 16-48 godzin.
- Wyłącz dopływ gazu i zwolnij ciśnienie przed odłączeniem pistoletu genowego od butli z helem. Wykręć wkładkę lufy, a następnie wyjmij uchwyt na wkłady oraz zużyte (lub niezużyte) wkłady.
- Wyczyść uchwyty na wkłady i wkładki lufy, zanurzając je w zlewce z wodą z mydłem. Umieść zlewkę w myjce ultradźwiękowej i poddaj działaniu ultradźwięków przez 20 minut. Następnie opłucz je wodą, aby usunąć wszystkie pozostałości mydła. Namocz je w 70% etanolu przez godzinę, a następnie osusz na ręcznikach papierowych.
V. Obserwacja
- Po inkubowaniu bombardowanych fragmentów cebuli przez 16-20 godzin w temperaturze pokojowej, można obserwować fluorescencję GFP lub YFP przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego, takiego jak Zeiss Axio Observer.z1 wykorzystany w niniejszym badaniu.
- Za pomocą pęsety o płaskich końcach powoli oddzielić pojedynczą warstwę komórek z wewnętrznej epidermy cebuli (warstwy bezpośrednio skierowanej w stronę urządzenia do bombardowania). Umieścić preparat na kropli wody na szkiełku przedmiotowym. Nałożyć szkiełko nakrywkę, dbając o zminimalizowanie ilości pęcherzyków powietrza.
- W świetle przeświecanym mikroskopu sprawdzić najpierw obecność cyklozy, aby upewnić się, że komórki są żywe. W tym celu naświetlać preparat światłem pola jasnego przez kilka minut w celu ogrzania tkanki cebuli, a następnie szukać ruchomych plastydów. Cykloza nie zawsze jest łatwa do zaobserwowania, dlatego nie należy się zrażać w przypadku jej braku.
- Do detekcji fluorescencji należy użyć odpowiednich filtrów wzbudzenia i emisji dla GFP lub YFP. Ważne jest uwzględnienie kontroli negatywnych, takich jak fragmenty cebuli bombardowane niefluorescencyjnym plazmidem. Słabe żółte sygnały mogą pojawiać się w komórkach uszkodzonych, pęcherzykach powietrza lub resztkach tkankowych. Równie ważne jest uwzględnienie kontroli pozytywnych. Plazmid zawierający konstytutywnie ekspresowany reporter fluorescencyjny, taki jak 35S::GFP, stanowi doskonałą kontrolę pozytywną. Widoczne sygnały GFP w komórkach epidermy cebuli (Rysunek 1A, D) wskazują, że wkłady, tkanki cebuli oraz proces strzelania z genu-pistoletu zostały prawidłowo przygotowane i przeprowadzone. Następnie zaobserwowano interakcje między SEU-pSPYNE a LUH-pSPYCE w fragmentach cebuli bombardowanych wkładami zawierającymi mieszaninę DNA 35S::SEU-pSPYNE i 35S::LUH-pSPYCE. Słaba fluorescencja YFP została zaobserwowana wyłącznie w jądrze komórkowym (Rysunek 1 B, E), co wskazuje na bezpośrednią fizyczną interakcję między SEU a LUH, która doprowadziła do połączenia fragmentów rozszczepionego YFP w jądrze. Należy zauważyć, że sygnał YFP z BiFC jest znacznie słabszy niż sygnał GFP z 35S::GFP.
Reprezentatywne wyniki
W opisanym tutaj badaniu plazmid kontrolny 35S::GFP wykazuje silną fluorescencję, która wypełnia całą komórkę, w tym zarówno jądro, jak i cytoplazmę (Rycina 1A, D). Białko GFP jest na tyle małe, że dyfunduje do jądra bez sygnału lokalizacji jądrowej. W przeciwieństwie do niego, SEU i LUH to dwa czynniki transkrypcyjne Arabidopsis, o których wcześniej wykazano, że oddziałują ze sobą w teście drożdżowego systemu dwuhybrydowego2. SEU-pSPYNE (SEU połączone z fragmentem N-końcowym YFP) oraz LUH-pSPYCE (LUH połączone z fragmentem C-końcowym YFP), oba zbyt duże, aby dyfundować do jądra, zawierają sygnały lokalizacji jądrowej2,5. Sygnał fluorescencji YFP wykryty w jądrze komórkowym cebuli (Rycina 1 B, E) wskazuje, że SEU-pSPYNE i LUH-pSPYCE mogą oddziaływać w jądrach cebuli. Nie wykryto sygnału fluorescencji w cebulach bombardowanych mieszaniną plazmidów składającą się z plazmidu wektora pSPYNE zawierającego fragment N-końcowy YFP oraz LUH-pSPYCE (Rycina 1C, F).
Fluorescencja YFP indukowana przez BiFC jest znacznie słabsza niż fluorescencja GFP pochodząca z plazmidu 35S::GFP. W naszym badaniu białka te wykazały również różną lokalizację subkomórkową (porównać rysunek 1A z B). Dodatkowo, liczba komórek fluorescencyjnych jest znacznie mniejsza w przypadku BiFC, ponieważ metoda ta działa tylko wtedy, gdy oba plazmidy partnerskie skutecznie wnikną i zostaną wykazane w tych samych komórkach cebuli.
Rycina 1. Obrazy fluorescencyjne (A, B, C) i w polu jasnym (D, E, F) komórek cebuli poddanych bombardowaniu różnymi konstruktami plazmidowymi. (A) i (D), komórki cebuli poddane bombardowaniu 35S::GFP. GFP dyfunduje przez cytoplazmę i jądro komórkowe. (B) i (E), komórki cebuli poddane bombardowaniu równomolarnymi mieszaninami DNA plazmidowego 35S::SEU-pSPYNE (SEU połączone z fragmentem N-końcowym YFP) oraz 35S::LUH-pSPYCE (LUH połączony z fragmentem C-końcowym). Interakcja między SEU-pSPYNE a LUH-pSPYCE jest widoczna jako fluorescencyjne jądro komórkowe. (C) i (F), kontrola negatywna przedstawiająca komórki cebuli poddane bombardowaniu mieszaninami plazmidów wektora pUC19-SPYNE i LUH-pSPYCE. Nie wykryto sygnału fluorescencyjnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
- Osobom korzystającym z urządzenia po raz pierwszy zalecamy przećwiczenie całej procedury, od przygotowania wkładu po obserwację, z użyciem pojedynczego konstytutywnego reportera plazmidowego, takiego jak 35S::GFP lub 35S::GUS. W naszej pracy wykorzystaliśmy plazmid 35S::GFP uzyskany od dr Steve’a Mounta i dr Xiaoning Zhang6 (Rycina 1A, D). Wkłady kontrolne do transfekcji genowej sprzedawane przez RioRad (Kat 165-2244) nie nadają się do stosowania u roślin.
- W przypadku BiFC konieczne jest zastosowanie drugiej kontr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr. Steve'owi Mountowi oraz dr Xiaoning Zhang za konstrukt 35S::GFP pGlowbug, a także za stypendium doktorskie Hokensen przyznane C. H. Badania w laboratorium Z. L. są wspierane przez amerykańską Narodową Fundację Naukową (National Science Foundation, IOB0616096 i MCB0744752). Z. L. otrzymuje częściowe wsparcie z Uniwersyteckiej Stacji Doświadczalnej Rolniczej Uniwersytetu Maryland.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Żółta cebula | Dowolny dostawca | ||
| Działo genowe Helios | Bio-Rad | ||
| Mikroskop fluorescencyjny z odpowiednimi filtrami dla GFP lub YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
Bibliografia
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
