Poniższy protokół przedstawia proces wycinania trzustki do obrazowania wirtualnych przekrojów oraz następującą po nim kwantyfikację wszystkich komórek beta znakowanych GFP w całej trzustce.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ilościowe oznaczanie masy komórek beta trzustki u myszy in situ
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Śledzenie zmian w konkretnych populacjach komórek w warunkach zdrowia i choroby jest istotnym celem badań biomedycznych. Proces monitorowania proliferacji komórek beta trzustki oraz wzrostu wysepek jest szczególnie wymagający. Opracowaliśmy metodę obrazowania rozkładu komórek beta w nienaruszonej trzustce myszy transgenicznych z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami beta, wykorzystując makro napisane dla programu ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Po wycięciu trzustki i udrożnieniu tkanki (tissue clearing), cały organ jest rejestrowany jako wirtualny przekrój, a następnie analizowane są znakowane GFP komórki beta. Analiza obejmuje kwantyfikację całkowitej powierzchni komórek beta, liczby wysepek oraz rozkładu ich wielkości w odniesieniu do konkretnych parametrów i lokalizacji dla każdej wysepki oraz dla małych skupisk komórek beta. Cały rozkład wysepek może zostać przedstawiony w trzech wymiarach, a informacje wynikające z rozkładu wielkości i kształtu każdej wysepki pozwalają na szybkie, ilościowe i jakościowe porównanie zmian w całkowitej powierzchni komórek beta.
Protokół
Część 1: Przygotowanie próbek
- Umieść mysz pod mikroskopem sekcyjnym, usuń cały trzustkę wraz z przymocowaną dwunastniczą i śledzioną, a następnie połóż organy na wcześniej zważonym szkiełku przedmiotowym. Usuń dwunastniczę, przecinając tkankę łączną wzdłuż strony, w której jest ona związana z trzustką. Wyciąć i usunąć śledzionę oraz nadmiar tłuszczu z trzustki, aż trzustka zostanie całkowicie wyizolowana na szkiełku. (Tłuszcz trzustkowy można rozpoznać po białym kolorze, w odróżnieniu od nieco ciemniejszego i bardziej brązowego koloru tkanki trzustki).
- Połóż szkiełko nakrywkę (duża nakrywka 50x75mm; standardowa nakrywka 25x75mm) nad trzustką w taki sposób, aby była ona w całości przykryta. Użyj obciążnika (np. ciężkiej książki), aby spłaszczyć trzustkę między szkiełkiem przedmiotowym a nakrywką. W zależności od ciężaru obciążnika, spłaszczanie trzustki trwa około pięciu minut.
- Zdejmij obciążnik. Jeśli trzustka jest dobrze spłaszczona na szkiełku, umieść ją w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4°C na noc. Rano zdejmij nakrywki i w ciągu dnia zapewnij pełną ekspozycję całej trzustki na PFA (6-8 godzin). Jeśli trzustka nie jest dobrze utrwalona, pozostaw ją w PFA na dłużej, ewentualnie na noc. Przenieś szkiełka do pojemnika z 1% Triton x-10 w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) na noc. Następnego dnia przenieś szkiełka do pojemnika z nasyconą sacharozą na 1-2 dni. Następnie przenieś szkiełka do pojemnika z 10% glicerolem, aż tkanka zostanie przejrzysta, co pozwala na optymalną rozdzielczość sygnałów fluorescencyjnych; przejrzystość tkanki uzyskuje się w ciągu około 1-3 dni. (Sygnały fluorescencyjne mogą utrzymywać się przez tygodnie, a nawet miesiące, ale obrazowanie należy przeprowadzić wkrótce po uzyskaniu przejrzystości tkanki dla zachowania optymalnej rozdzielczości).
- Przechowuj trzustkę w ciemnym i chłodnym miejscu, aby zachować organ i jego sygnały fluorescencyjne.
Część 2: Obrazowanie i ilościowe określanie powierzchni komórek beta w nienaruszonym trzustce
- Używając pęsety lub dłoni w rękawiczkach, wyjmij preparat z pojemnika z 10% glicerolem. Przygotuj preparat do obrazowania, wycierając nadmiar glicerolu i oczyszczając wyłącznie tył szkiełka cover glass za pomocą etanolu.
- Otwórz oprogramowanie StereoInvestigator (MicroBrightField, Williston, VT) i wybierz obiektyw 2x do obrazowania trzustek myszy starszych niż 3 tygodnie na dużych szkiełkach przedmiotowych lub obiektyw 10x do obrazowania trzustek myszy młodszych niż 3 tygodnie, dociśniętych między dwoma szkiełkami cover glass o średnicy 25 mm. Wyświetl obraz, ustawiając go na obraz na żywo (Image → Live Image). Wybierz czas ekspozycji, który wyraźnie pokazuje komórki beta znakowane GFP. (Zbyt krótka ekspozycja wyklucza mniejsze wysepki i komórki beta, natomiast zbyt długa ekspozycja tworzy dodatkowe fałszywe sygnały).
- Kliknij w dowolnym miejscu na ekranie, aby ustanowić punkt odniesienia, a następnie obrysuj cały obszar trzustki. Uruchom proces Virtual Slice (Image → Acquire Virtual Slice). Wyznacz i wybierz najlepszą płaszczyznę ogniskowej — tzn. płaszczyznę z największą liczbą widocznych i ostrych wysepek oraz komórek beta — na osi Z, obracając pokrętłem ostrości. Po dokonaniu wyboru StereoInvestigator automatycznie przechwytuje obraz wyświetlany na ekranie. Dzięki zmotoryzowanemu stolikowi funkcja Virtual Slice sekwencyjnie rejestruje każdy panel optyczny jako oddzielny obraz w obrębie narysowanego konturu (Ryc. 1A), a następnie łączy je wszystkie w jeden scalony obraz (Ryc. 1B). Obrazowanie Virtual Slice wykorzystuje konfigurację epifluorescencyjną — tzn. filtry szerokopolowe —, która pozwala kamerze przechwycić wszystkie sygnały obecne na danej głębokości, w tym te nieostre, tak aby finalny Virtual Slice był zintegrowanym obrazem dwuwymiarowym, a nie projekcją maksymalną z trójwymiarowej rekonstrukcji całej trzustki. Średni czas skanowania Virtual Slice wynosi 30 min na próbkę, ale w przypadku dużej trzustki może zająć do godziny.
- Po zapisaniu obrazu rozpocznij jego analizę, otwierając go w programie ImageJ. Gdy obraz zostanie załadowany i pojawi się na ekranie, otwórz i uruchom makro do analizy Virtual Slice (Supplementary material 1).
- Postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku dostarczonymi przez makro. Usuń niepożądane artefakty powstałe w wyniku rozproszenia światła za pomocą narzędzi „Magic Wand” i „Select Area”. Sprawdź i odejmij niepotrzebne tło z obrazu. Wyznacz promień największej wysepki za pomocą narzędzia „Line”, aby funkcja Rolling Ball mogła skutecznie usunąć autofluorescencję i światło rozproszone. Przetestuj i wybierz najbardziej odpowiedni „Low Threshold”, aby uchwycić sygnały fluorescencyjne małych wysepek i skupisk komórek beta (<3x104 μm2). Przetestuj i wybierz najbardziej odpowiedni „High Threshold”, aby uchwycić sygnały fluorescencyjne wysepek. Przeprowadź kwantyfikację Virtual Slice, która zmierzy i wygeneruje listę powierzchni, obwodu, kolistości oraz średnicy Fereta wysepek.
Rysunek 1A Analiza obrazu Virtual Slice całego rozkładu komórek beta w nienaruszonym trzustce dorosłego osobnika
Obrazy poszczególnych paneli optycznych trzustki samca myszy w wieku 10 tygodni, wykonane przy użyciu obiektywu 2x. Obrazy obejmują cały rozkład wysepek, w tym nawet małe skupiska komórek beta (<10 komórek).
Rycina 1B Analiza obrazowa wirtualnych przekrojów (Virtual Slice) całkowitego rozkładu komórek beta w nienaruszonym trzustce dorosłego osobnika
Zunifikowany wirtualny przekrój z grzbietową częścią trzustki po prawej stronie i brzuszna częścią trzustki po lewej stronie. Pasek skali wynosi 5 mm.
Reprezentatywne wyniki
Prawidłowe przygotowanie trzustki do obrazowania metodą Virtual Slice umożliwi efektywną kwantyfikację wszystkich beta-komórek znakowanych GFP w całej trzustce w postaci obrazu Virtual Slice z wyraźnymi i odrębnymi wysepkami. Skuteczne obrazowanie całej trzustki metodą Virtual Slice in situ zapewnia możliwość badania i ilościowego określania komórek beta, nie tylko w odniesieniu do pojedynczych wysp i całkowitej powierzchni wysp, ale także w zakresie rozkładu wielkości wysp, analizy regionalnej oraz wzorców wzrostu. Chociaż ImageJ pozwala na jednoczesne wykrywanie wszystkich komórek beta podczas analizy obrazów wirtualnych przekrojów, umożliwia on również kontrolę nad wyborem komórek beta do kwantyfikacji poprzez ograniczenie analizy do określonych wielkości wysp (według powierzchni lub średnicy) lub ich lokalizacji. Standardowa analiza wyklucza artefakty, np. zanieczyszczenia, które są mniejsze niż jedna pojedyncza komórka beta (<170 μm2) i rejestruje pole, obwód (odległość otaczającą dany obszar), kołowość (stopień zaokrąglenia, gdzie 1,0 reprezentuje idealne koło) oraz średnicę Fereta (najdłuższą odległość w obrębie obszaru) dla każdego wykrytego wysepki. Analiza Virtual Slice pozwala na ulepszenie obrazów wirtualnych przekrojów poprzez zastosowanie segmentacji Watershed, która rozróżnia i rozdziela nakładające się wysepki na poszczególne jednostki w zależności od ich kształtu. Analiza generuje ponadto serię szczegółowych obrazów, obejmujących maski obrazów dla niskiej i wysokiej intensywności (Rys. 1C), obrys wszystkich domniemanych wysepek, z których każda jest indywidualnie ponumerowana i wymieniona w tabeli z odpowiednimi informacjami (Rys. 1D), a także oryginalny obraz Virtual Slice (Rys. 1B). Należy zauważyć, że potencjalny błąd techniczny przy wyborze wartości progowych może zafałszować ilościowe oznaczenie wysepek poprzez włączenie zbędnego światła otaczającego duże struktury lub poprzez zmniejszenie całkowitej liczby wysepek, szczególnie w przypadku słabych sygnałów pochodzących z małych cząstek.
Rycina 1C Analiza obrazu Virtual Slice całej dystrybucji komórek beta w nienaruszonym trzustce dorosłego osobnika
Maska cząsteczek fluorescencyjnych wirtualnym przekroju. Kody kolorów: [1] niebieski: niska intensywność fluorescencji; [2] zielony: średnia intensywność fluorescencji; i [3] czerwony: wysoka intensywność fluorescencji.
Rysunek 1D Analiza obrazu z wirtualnego przekroju (Virtual Slice) całego rozkładu komórek beta w nienaruszonym trzustce dorosłego osobnika
Ilościowe oznaczenie poszczególnych wysepek/skupisk komórek beta. Należy zwrócić uwagę, że każda wysepka (w tym małe skupiska komórek beta) jest ponumerowana, a szczegółowe informacje na jej temat znajdują się w odpowiedniej tabeli. Dla każdej struktury określono cztery parametry: (1) powierzchnię; (2) obwód; (3) kolistość: stopień zaokrąglenia, gdzie wartość 1,0 reprezentuje idealne koło; oraz (4) średnicę Fereta: najdłuższą odległość w obrębie obszaru. Zwróćmy uwagę, że obiekt nr 706 obrazuje rozdzielczość analizy dla obszaru obejmującego zaledwie kilka komórek beta. Segmentacja metodą watershed (dzielenie wodne) wykrywa grupy sąsiadujących wysepek, takich jak ta przedstawiona na obrazie, i odpowiednio rozróżnia je jako odrębne wysepki (wysepki 154, 155 i 156).
Rysunek 1E Analiza obrazu Virtual Slice całego rozkładu komórek beta w nienaruszonym trzustce dorosłego osobnika
Trójwymiarowy wykres analizy wirtualnego przekroju, z osiami reprezentującymi pole powierzchni, obwód oraz średnicę Fereta. Każda kropka reprezentuje wysepkę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Analiza obrazów wirtualnych przekrojów (Virtual Slice) wysepek oraz skupisk komórek beta w nienaruszonym trzustce zapewnia szeroki wgląd w całkowity rozkład wysepek. Dzięki temu możliwe jest badanie i porównywanie rozwoju oraz zmian w całkowitym rozkładzie wysepek w czasie. Przykład takiego podejścia zaprezentowano w naszej analizie powstawania wysepek trzustkowych (1). Kompleksowa analiza trzustek noworodków myszy w różnych punktach czasowych (P1-P21) wykazała, że wysepki powstają w wyniku podziału (fission). Podczas gd...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Badanie jest wspierane przez granty Public Health Service USA nr DK-081527, DK-072473 oraz DK-20595 przyznane University of Chicago Diabetes Research and Training Center (Animal Models Core), a także darowiznę od Kovler Family Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pinceta | Miltex Inc. | ||
| Nożyczki | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Nożyczki | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Duże szkiełko przedmiotowe | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Duże szkiełko nakrywkowe | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Szkiełko przedmiotowe | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Szkiełko nakrywkowe | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Szkiełko nakrywkowe | Erie Scientific | koło 25mm | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Olympus Corporation | ||
| Mikroskop do sekcji | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Myszy MIP-GFP | Jackson Laboratory |
Bibliografia
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
