Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Podsumowanie

Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnostyki poziomów mRNA w różnych tkankach i stadiach rozwojowych owadów. W niniejszym raporcie prezentujemy zastosowanie qRT-PCR do oznaczenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych oraz stadiach rozwojowych inwazyjnego gatunku owada – opiętka jesionowego.

Streszczenie

Opuszka jesionowa (EAB,Agrilus planipennis) jest egzotycznym inwazyjnym szkodnikiem, który zabił miliony jesionów (Fraxinusspp) w Ameryce Północnej. EAB nadal szybko się rozprzestrzenia i atakuje jesiony w różnym wieku, od sadzonek po drzewa dojrzałe. Do tej pory jednak wiedza molekularna na temat EAB jest bardzo ograniczona lub nie istnieje. Jesteśmy zainteresowani rozszyfrowaniem opartych na mechanizmach molekularnych procesów fizjologicznych na poziomie tkankowym, które pomagają EAB w skutecznej kolonizacji jesionów. W niniejszym raporcie przedstawiamy efektywne wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) do określenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych (w tym w jelicie środkowym, ciałkach tłuszczowych i kutykuli) oraz w różnych stadiach rozwojowych (w tym 1^st- , 2^gie- 3^rd- , 4^th(stadia larwalne, przepoczwarki i osobniki dorosłe) EAB. Jako przykład, gen peritrofin (nazwany tutaj,AP-PERI1) jest przedstawiony jako gen docelowy oraz białko rybosomalne (AP-RP1) jako kontrolę wewnętrzną. Peritrofiny są ważnymi składnikami błony/macierzy peritroficznej (PM), która stanowi wyściółkę jelita owada. PM pełni różnorodne funkcje, w tym uczestniczy w trawieniu oraz zapewnia ochronę mechaniczną nabłonka jelita środkowego.

Protokół

Kompletny protokół z poszczególnymi etapami przedstawiono na schemacie blokowym na Rysunku 1. Szczegółowy opis poszczególnych kroków obejmujących sekcję, ekstrakcję RNA, syntezę pierwszej nici cDNA oraz qRT-PCR znajduje się poniżej.

I. Disekcja larw

1. Przed rozpoczęciem procedury umieść larwy opiętka jesionowego (EAB) na wilgotnym papierze do tkanek do czasu przeprowadzenia sekcji. Świeżo przygotowany 1X roztwór soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) przechowuj w lodzie, aby bufor pozostał zimny przez cały czas trwania sekcji.
2. Na początek przymocuj larwy EAB do płytki sekcyjnej za pomocą cienkich szpilek sekcyjnych. Następnie dodaj do płytki sekcyjnej zimny 1X PBS.
3. W pierwszej kolejności oddziel głowę larwy za pomocą precyzyjnych nożyczek sekcyjnych. Następnie usuń ostatni segment odwłoka larwy.
4. Używając pęsety zegarmistrzowskiej, unieś kutykulę z tułowia larwy. Następnie wykonaj nacięcie wzdłuż tułowia za pomocą nożyczek. Podczas nacinania należy uważać, aby nie przerwać ciągłości jelit.
5. Ostrożnie odizoluj tkankę jelita środkowego od innych tkanek, takich jak ciała tłuszczowe i tkanka łączna. Następnie wypłucz tkankę w świeżym buforze 1X PBS, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczeń z ciała tłuszczowego. Przenieś wyizolowane jelito środkowe do 500 μL schłodzonego odczynnika Trizol w probówce typu eppendorf o pojemności 1,5 mL.
6. Następnie wyizoluj tkankę ciała tłuszczowego za pomocą pęsety i przenieś ją do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 mL zawierającej 500 μL schłodzonego odczynnika Trizol.
7. Na koniec wyizoluj tkankę kutykuli z tułowia larwy, zdrapując wszelkie przylegające tkanki, uważając przy tym, aby nie naruszyć integralności tkanki. Wypłucz wyizolowaną tkankę kutykuli w świeżym buforze PBS i przenieś ją do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 mL z 500 μL schłodzonego odczynnika Trizol.
8. Wyizolowane tkanki ciała tłuszczowego, kutykuli i jelita środkowego można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.
9. W ramach przygotowania do ekstrakcji RNA posegreguj poszczególne próbki EAB zgodnie ze stadiami rozwojowymi. Stadia te obejmują 1., 2., 3. i 4. stadium larwalne, przepoczwary oraz osobniki dorosłe.

II. Izolacja RNA (zgodnie z protokołem producenta dla odczynnika Trizol)

Homogenizacja

1. Aby rozpocząć ekstrakcję RNA, należy najpierw zhomogenizować tkanki za pomocą plastikowych tłuczków w probówkach typu eppendorf o pojemności 1,5 mL zawierających Trizol. Po homogenizacji należy uzupełnić całkowitą objętość każdej próbki odczynnikiem Trizol do 1 mL.
2. W przypadku stadiów rozwojowych, całe zwierzę należy zhomogenizować w ciekłym azocie przy użyciu moździerza i tłuczka. Następnie należy dodać alikwot homogenatu (50 μg) do 1 mL Trizolu.

Rozdział faz:

3. Inkubować probówki z próbkami zawierające 1 mL Trizol przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Po inkubacji dodać 200μL chloroformu do każdej probówki. Niezwłocznie po dodaniu chloroformu energicznie wstrząsnąć probówkami przez około 15 sekund. Następnie inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez kolejne 2-3 minuty.
5. Następnie odwirować próbki przy 12,000Xg przez 15 minut w temperaturze 2 °C. Po wirowaniu RNA znajdzie się w fazie wodnej. Objętość fazy wodnej powinna wynosić 600 μl, czyli 60% całkowitej objętości Trizol.

Wytrącanie RNA

6. Ostrożnie usuń wyłącznie fazę wodną. Obecność substancji znajdujących się poniżej fazy wodnej spowoduje zanieczyszczenie wyekstrahowanego RNA. Następnie przenieś fazę wodną do odpowiednio oznakowanej probówki typu Eppendorf o pojemności 1.5 mL.
7. Aby wytrącić RNA z fazy wodnej, dodaj 0.5 mL izopropanolu do każdej probówki i wymieszaj. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji wiruj probówki z prędkością 12,000Xg przez 10 minut w temperaturze 2°C.

Przemywanie RNA

8. Po wirowaniu odlej nadsącz z probówek. RNA znajduje się w żelowatym osadzie powstałym na dnie probówki. Przemyj osad 75% etanolem, dodając co najmniej 1 mL 75% etanolu na każdy 1 mL Trizolu. Wymieszaj na wortexie. Następnie wiruj probówki z prędkością 7500Xg przez 5 minut w temperaturze 2 °C.

Elucja RNA

9. Odrzuć nadsącz z probówek. Ponownie odwiruj probówki w małej wirówce stołowej przez 1 minutę. Usuń nadmiar nadsączu z probówki za pomocą ostrożnego pipetowania. Pozostaw probówkę otwartą i pozwól osadowi wyschnąć na powietrzu przez 5-10 minut. Należy uważać, aby nie przesuszyć osadu, ponieważ znacząco zmniejszy to jego rozpuszczalność.
10. Po wysuszeniu na powietrzu resuspenduj osad w wodzie traktowanej pirowęglanem dwuetylowym (DEPC). Ilość wody użytej do resuspensji osadu zależy od jego wielkości. Użyj 50 μL wody traktowanej DEPC dla małego osadu lub 100 μL dla dużego osadu. Pozostaw osad do całkowitego rozpuszczenia w wodzie traktowanej DEPC, kilkukrotnie przesuwając końcówkę pipety w górę i w dół.
11. Po rozpuszczeniu osadu inkubuj próbkę w temperaturze 55 °C przez 10 minut.
12. Następnie zmierz stężenie każdej próbki RNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop (2 μL próbki RNA).
13. Próbki RNA przechowuj w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.

III. Synteza pierwszej nici cDNA (zgodnie z protokołem producenta przy użyciu zestawu SuperScript first strand Synthesis firmy Invitrogen).

1. Do każdej próbki RNA dodać do probówki PCR następujące składniki:

   RNA	x μl
   Mieszanina 10mM dNTP	1μl
   Oligo(dt) (0.5 μg/ μl)	1 μl
   Woda traktowana DEPC	(8-x) μl
   Objętość całkowita:	10 μl
   Uwaga: x to objętość RNA wykorzystana do syntezy cDNA. W zależności od stężenia RNA, do każdej reakcji należy użyć 2-3 μg RNA, a objętość całkowita każdej reakcji powinna wynosić 10 μl.

2. Umieścić powyższą mieszaninę reakcyjną w termocyklerze w temperaturze 65°C na 4 minuty.
3. Wyjąć probówki z termocyklera i natychmiast umieścić je w lodzie na co najmniej 2 minuty.
4. Przygotować mieszaninę główną (master mix) pierwszej nici, dodając następujące składniki:

   10X Bufor RT	2μl
   25mM MgCl2	4 μl
   0.1M DTT	2 μl
   RNase out	1 μl

5. Do każdej probówki zawierającej próbkę RNA dodać 9 μl mieszaniny głównej, wymieszać poprzez pipetowanie i krótko odwirować mieszaninę.
6. Umieścić probówki z powrotem w termocyklerze i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 42°C.
7. Wstrzymać pracę termocyklera i dodać 1 μl enzymu odwrotnej transkryptazy Superscript II (Invitrogen) do każdej probówki. Krok ten należy wykonać szybko.
8. Inkubować próbki w temperaturze 42°C przez 1,5 godziny.
9. Zakończyć reakcję w temperaturze 70°C przez 15 minut.
10. Wyjąć probówki z termocyklera i umieścić je w lodzie.
11. Do każdej probówki dodać 1 μl RNazy H i umieścić je ponownie w termocyklerze w temperaturze 37°C na 20 minut.
12. Po wyjęciu próbek z termocyklera, do każdej probówki dodać 20 μl wody wolnej od nukleaz. Na tym etapie objętość każdej próbki ulega podwojeniu.
13. Sprawdzić stężenie każdej próbki, wykorzystując 2 μl materiału. Pobrać alikwot każdej próbki, aby uzyskać stężenie 20ng/μl do zastosowania w qRT-PCR. Ilość wody potrzebna do doprowadzenia próbek do stężenia 20ng/μl będzie zależeć od początkowego stężenia zsyntetyzowanego cDNA.

IV. qRT-PCR:

Projektowanie starterów i wyznaczenie genu referencyjnego

1. Zaprojektuj startery o temperaturze topnienia (Tm) 60°C i wielkości produktu ok. 100bp.
2. W tym doświadczeniu jako gen docelowy wykorzystano AP-PERI1. Do późniejszej analizy i normalizacji danych niezbędny jest gen referencyjny lub kontrola wewnętrzna. Jako gen referencyjny w tym doświadczeniu zastosowano białko rybosomalne (AP-RP1).
3. Przygotuj 5uM roztwory robocze starterów, które będą wykorzystywane, w tym startery dla genu referencyjnego.

Przygotowanie standardów

4. W celu obliczenia wydajności stosowanych starterów należy przygotować wzorce.
5. Przygotować mieszaninę cDNA z różnych próbek, które będą badane.
6. Przygotować 5-krotne rozcieńczenia szeregowe dla każdego pożądanego punktu na wykresie. Cztery rozcieńczenia powinny być wystarczające, ale wysoce zaleca się wykonanie pięciu.
7. Objętość będzie się różnić w zależności od liczby punktów oraz liczby powtórzeń technicznych. Ilość materiału powinna być wystarczająca do przygotowania wzorca dla każdego badanego genu, wliczając gen referencyjny.

Szablon płytki

8. Opracuj szablon określający nazwę próbki dla każdego dołka na płytce do qRT-PCR. Pamiętaj o uwzględnieniu standardów dla każdego genu oraz co najmniej dwóch powtórzeń technicznych dla każdej próbki.

Ustaw parametry cyklu

9. Włącz urządzenie do qRT-PCR i wprowadź parametry cyklu. Parametry cyklu dla tego eksperymentu są następujące:
   Krok 1:
   • 1 cykl: 95°C 3 min
   Krok 2:
   • 40 cykli: 95°C 15 sec, a następnie 60°C 30 sec
     (Opcjonalnie: w celu wyznaczenia krzywej topnienia należy uwzględnić następujące kroki)
   Krok 3:
   • 1 cykl: 95°C 1 min
   Krok 4:
   • 1 cykl: 55°C 1 min
   Krok 5:
   • 81 cykli: 55°C 30 sec

Przygotowanie płytki do urządzenia CFX96 (BioRad)

11. Przygotować master mix dla każdego genu (łącznie z genem referencyjnym) w oddzielnych probówkach. Dla każdej studzienki master mix składa się z:

    Woda wolna od nukleaz	2μl
    2.5 X SYBR green	4 μl
    Starter forward	1 μl
    Starter reverse	1 μl
    Objętość całkowita	8 μl

12. Podczas przygotowywania master mixu należy uwzględnić 1-2 dodatkowe reakcje, aby zrekompensować błędy pipetowania.
13. Zgodnie z wcześniej opracowanym schematem, dodać 2 μL (20 ng/ μL) cDNA do każdej studzienki. Następnie dodać 8 μL master mixu do każdej studzienki, co da objętość całkowitą 10 μL na reakcję.
14. Pipetować w górę i w dół (2-3X), aby upewnić się, że próbka jest dobrze wymieszana. Sprawdzić, czy na końcówce nie pozostał płyn. Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej, należy używać nowej końcówki dla każdej próbki.
15. Po przygotowaniu całej płytki, zakryć ją taśmą optyczną. Należy unikać dotykania taśmy, ponieważ obecność tłuszczu może wpłynąć na odczyt. Następnie wirować płytkę przy 500 rpm przez 1 minutę, aby upewnić się, że wszystkie produkty w studzienkach znajdują się na dnie płytki.
16. Po wirowaniu sprawdzić, czy na dnie płytki nie ma lodu ani wody. Na koniec umieścić płytkę w urządzeniu do qRT-PCR i uruchomić program PCR.

V. Schematyczna reprezentacja eksperymentu

Rysunek 1: Schemat blokowy przedstawiający sekwencję kroków w badaniu ekspresji genów.

Rycina 2: A) sekcja larwy EAB pokazująca jelito środkowe w centrum. B) wyizolowane jelito środkowe larwy EAB

Rycina 3: A) Średnie względne wartości ekspresji (REVs) dla genu peritrofin (AP-PERI1) w różnych tkankach larwalnych, w tym w kutykuli (Cu), jelicie środkowym (MG) i ciałach tłuszczowych (FB). Jako kontrolę wewnętrzną do normalizacji danych uzyskanych dla badanego genu AP-PERI1 wykorzystano specyficzne dla EAB białko rybosomalne (nazwane tutaj AP-RP1). B) Względna krotność zmiany poziomu AP-PERI1 w tkankach larwalnych. Tkanka kutykuli wykazała najniższą ekspresję, dlatego została przyjęta jako próbka kalibracyjna (1X) (Pfaffl, 2001).

Rysunek 4: A) Średnie wartości względnej ekspresji (REV) genu peritrofin (AP-PERI1) w różnych stadiach rozwojowych EAB, w tym w stadiach larwalnych (1., 2., 3. i 4. stadium), przepoczwarkach (PP) oraz u osobników dorosłych (A). Specyficzne dla EAB białko rybosomalne (AP-RP1) posłużyło jako kontrola wewnętrzna do normalizacji danych uzyskanych dla badanego genu AP-PERI1. B) Względna krotność zmiany AP-PERI1 w różnych stadiach rozwojowych. Próbka PP wykazała najniższy poziom mRNA, w związku z czym została przyjęta jako kalibrator (próbka 1X).

VI. Podsumowanie

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnozowania poziomów mRNA w różnych tkankach i stadiach rozwojowych owadów. Ponadto qRT-PCR stanowi w większości kluczowe narzędzie do walidacji danych uzyskanych z wysokoprzepustowych analiz ekspresji genów, takich jak mikromacierze oraz RNA-Seq nowej generacji.

Dyskusja

Wartość cyklu progowego (Ct) uzyskano dla każdej próbki na płytce do qRT-PCR. W celu sporządzenia krzywej wzorcowej wartość Ct uzyskaną dla każdego rozcieńczenia naniesiono na wykres w funkcji logarytmu jego stężenia. Następnie wartości Ct dla próbek eksperymentalnych naniesiono na tę krzywą wzorcową serii rozcieńczeń. Ilości docelowe obliczono na podstawie oddzielnych krzywych wzorcowych wygenerowanych dla każdego eksperymentu, tj. ekspresji w tkankach i ekspresji rozwojowej. Wartości ekspresji względnej (REVs) określon...