Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Podsumowanie

Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnostyki poziomów mRNA w różnych tkankach i stadiach rozwojowych owadów. W niniejszym raporcie prezentujemy zastosowanie qRT-PCR do oznaczenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych oraz stadiach rozwojowych inwazyjnego gatunku owada – opiętka jesionowego.

Streszczenie

Opuszka jesionowa (EAB,Agrilus planipennis) jest egzotycznym inwazyjnym szkodnikiem, który zabił miliony jesionów (Fraxinusspp) w Ameryce Północnej. EAB nadal szybko się rozprzestrzenia i atakuje jesiony w różnym wieku, od sadzonek po drzewa dojrzałe. Do tej pory jednak wiedza molekularna na temat EAB jest bardzo ograniczona lub nie istnieje. Jesteśmy zainteresowani rozszyfrowaniem opartych na mechanizmach molekularnych procesów fizjologicznych na poziomie tkankowym, które pomagają EAB w skutecznej kolonizacji jesionów. W niniejszym raporcie przedstawiamy efektywne wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) do określenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych (w tym w jelicie środkowym, ciałkach tłuszczowych i kutykuli) oraz w różnych stadiach rozwojowych (w tym 1^st- , 2^gie- 3^rd- , 4^th(stadia larwalne, przepoczwarki i osobniki dorosłe) EAB. Jako przykład, gen peritrofin (nazwany tutaj,AP-PERI1) jest przedstawiony jako gen docelowy oraz białko rybosomalne (AP-RP1) jako kontrolę wewnętrzną. Peritrofiny są ważnymi składnikami błony/macierzy peritroficznej (PM), która stanowi wyściółkę jelita owada. PM pełni różnorodne funkcje, w tym uczestniczy w trawieniu oraz zapewnia ochronę mechaniczną nabłonka jelita środkowego.

Protokół

Pełny protokół z poszczególnymi etapami przedstawiono na schemacie blokowym na Rysunku 1. Szczegółowe opisy poszczególnych kroków obejmujących sekcję, ekstrakcję RNA, syntezę pierwszej nici cDNA oraz qRT-PCR znajdują się poniżej.

I. Disekcja larw

1. Przed rozpoczęciem procedury umieścić larwy opłatek jesionowego (EAB) na wilgotnym papierze pocienkanym do momentu przeprowadzenia sekcji. Świeżo przygotowany 1X roztwór soli fosforanowej w buforze (PBS) należy przechowywać w lodzie, aby utrzymać niską temperaturę buforu przez cały proces sekcji.
2. Na początek unieruchomić larwy EAB na płytce sekcyjnej za pomocą cienkich szpilek sekcyjnych. Następnie wlać na płytkę sekcyjną zimny 1X PBS.
3. W pierwszej kolejności odciąć głowy larw za pomocą cienkich nożyczek sekcyjnych. Następnie usunąć ostatni segment odwłoka larw.
4. Używając pęsety zegarmistrzowskiej, oddzielić kutykulę od tułowia larwy. Następnie wykonać nacięcie wzdłuż tułowia za pomocą nożyczek. Należy uważać, aby nie przerwać ciągłości jelita podczas wykonywania nacięcia.
5. Ostrożnie wyizolować tkankę jelita środkowego z pozostałych tkanek, takich jak ciała tłuszczowe i tkanka łączna. Następnie wypłukać tkankę w świeżym buforze 1X PBS, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczeń z ciała tłuszczowego. Przenieść wyizolowane jelito środkowe do probówki eppendorfowskiej o pojemności 1,5 mL zawierającej 50 μL schłodzonego odczynnika Trizol.
6. Następnie wyizolować tkankę ciała tłuszczowego za pomocą pęsety i przenieść ją do probówki eppendorfowskiej o pojemności 1,5 mL zawierającej 50 μL schłodzonego odczynnika Trizol.
7. Na koniec wyizolować tkankę kutykuli z tułowia larwy, zeskrobując wszelkie przylegające tkanki i uważając, aby nie naruszyć integralności tkanki. Wypłukać wyizolowaną tkankę kutykuli w świeżym buforze PBS i przenieść ją do probówki eppendorfowskiej o pojemności 1,5 mL z 500 μL schłodzonego odczynnika Trizol.
8. Wyizolowane tkanki ciała tłuszczowego, kutykuli i jelita środkowego można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.
9. W ramach przygotowania do ekstrakcji RNA pogrupować poszczególne próbki EAB zgodnie z etapami rozwoju. Etapy te obejmują 1., 2., 3. i 4. stadium larwalne, przepoczwary oraz osobniki dorosłe.

II. Ekstrakcja RNA (zgodnie z protokołem producenta dla odczynnika Trizol)

Homogenizacja

1. Aby rozpocząć ekstrakcję RNA, najpierw należy użyć plastikowych tłuczków do homogenizacji tkanek w probówkach Eppendorf o pojemności 1,5 mL zawierających Trizol. Po homogenizacji należy uzupełnić objętość każdej próbki odczynnikiem Trizol do 1 mL.
2. W przypadku etapów rozwojowych należy homogenizować całe zwierzę w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka. Następnie należy dodać alikwot homogenatu (50 μg) do 1 mL Trizolu.

Rozdział faz:

3. Inkubuj probówki z próbkami z 1 mL Trizol przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Po inkubacji dodaj 20 μL chloroformu do każdej probówki. Natychmiast po dodaniu chloroformu energicznie wstrząsaj probówkami przez około 15 sekund. Następnie inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez kolejne 2-3 minuty.
5. Następnie odwiruj próbki przy 12,0Xg przez 15 minut w temperaturze 2 °C. Po wirowaniu RNA znajdzie się w fazie wodnej. Objętość fazy wodnej powinna wynosić 60 μl, czyli 60% całkowitej objętości Trizol.

Wytrącanie RNA

6. Ostrożnie pobierz wyłącznie fazę wodną. Obecność substancji znajdujących się poniżej fazy wodnej spowoduje zanieczyszczenie ekstrahowanego RNA. Następnie przenieś fazę wodną do odpowiednio oznakowanej probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 mL.
7. Aby wytrącić RNA z fazy wodnej, dodaj do każdej probówki 0,5 mL alkoholu izopropylowego i wymieszaj. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji odwiruj probówki z prędkością 12,0Xg przez 10 minut w temperaturze 2°C.

Przemywanie RNA

8. Po odwirowaniu usunąć nadsącz z probówek. RNA znajduje się w żelowatym osadzie utworzonym na dnie probówki. Przemyć osad 75% ethanolem, dodając co najmniej 1 mL 75% ethanolu na każde 1 mL Trizol. Wymieszać za pomocą wortexa. Następnie wirować probówki z prędkością 7500Xg przez 5 minut w temperaturze 2 °C.

Elucja RNA

9. Odlej nadsącz z probówek. Ponownie odwiruj probówki w małej wirówce stołowej przez 1 minutę. Usuń pozostały nadmiar nadsączu z probówki za pomocą ostrożnego pipetowania. Pozostaw probówkę otwartą i pozwól osadowi wyschnąć na powietrzu przez 5-10 minut. Należy uważać, aby nie przesuszyć osadu, ponieważ znacznie zmniejszy to jego rozpuszczalność.
10. Po wysuszeniu na powietrzu resuspenduj osad w wodzie traktowanej pirowęglanem dwuetylowym (DEPC). Ilość wody użytej do resuspensji osadu zależy od jego wielkości. Użyj 50 μL wody traktowanej DEPC dla małego osadu lub 100 μL dla dużego osadu. Pozwól osadowi całkowicie rozpuścić się w wodzie traktowanej DEPC, kilkakrotnie przesuwając końcówkę pipety w górę i w dół.
11. Po rozpuszczeniu osadu inkubuj próbkę w temperaturze 5 °C przez 10 minut.
12. Następnie zmierz stężenie każdej próbki RNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop (2 μL próbki RNA).
13. Próbki RNA przechowuj w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.

III. Synteza pierwszej nici cDNA (zgodnie z protokołem producenta przy użyciu zestawu SuperScript first strand Synthesis firmy Invitrogen).

1. Do każdej próbki RNA dodać do probówki PCR następujące składniki:

   RNA	x μl
   10mM dNTP mix M	1μl
   Oligo(dt) (0.5 μg/ μl)	1 μl
   Woda traktowana DEPC	(8-x) μl
   Objętość całkowita:	10 μl
   Uwaga: x to objętość RNA użytego do syntezy cDNA. W zależności od stężenia RNA, do każdej reakcji należy użyć 2-3 μg RNA, a całkowita objętość każdej reakcji powinna wynosić 10 μl.

2. Umieścić powyższą mieszaninę reakcyjną w termocyklerze w temperaturze 65°C na 4 minuty.
3. Wyjąć probówki z termocyklera i natychmiast umieścić je na lodzie na co najmniej 2 minuty.
4. Przygotować master mix pierwszej nici, dodając następujące składniki:

   10X RT Buffer	2μl
   25mM MgCl2	4 μl
   0.1M DTT	2 μl
   RNase out	1 μl

5. Do każdej probówki zawierającej próbkę RNA dodać 9 μl master mixu, wymieszać poprzez pipetowanie i krótko odwirować mieszaninę.
6. Umieścić probówki z powrotem w termocyklerze i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 42°C.
7. Wstrzymać pracę termocyklera i do każdej probówki dodać 1 μl enzymu odwrotnej transkryptyazy Superscript II (Invitrogen). Ten etap należy przeprowadzić szybko.
8. Inkubować próbki w temperaturze 42°C przez 1,5 godziny.
9. Zakończyć reakcję w temperaturze 70°C przez 15 minut.
10. Wyjąć probówki z termocyklera i umieścić je na lodzie.
11. Do każdej probówki dodać 1 μl RNazy H i ponownie umieścić je w termocyklerze w temperaturze 37°C na 20 minut.
12. Po wyjęciu próbek z termocyklera dodać do każdej probówki 20 μl wody wolnej od nukleaz. Na tym etapie objętość każdej próbki ulega podwojeniu.
13. Sprawdzić stężenie każdej próbki, wykorzystując 2 μl materiału. Odmierzyć alikwot każdej próbki, aby uzyskać stężenie 20ng/μl do wykorzystania w qRT-PCR. Ilość wody potrzebna do doprowadzenia próbek do stężenia 20ng/μl zależy od początkowego stężenia zsyntetyzowanego cDNA.

IV. qRT-PCR:

Projektowanie starterów i wyznaczenie genu referencyjnego

1. Zaprojektuj primery o temperaturze topnienia (Tm) 60°C i rozmiarze produktu ok. 10bp.
2. W tym eksperymencie jako gen docelowy wykorzystano AP-PERI1. Do późniejszej analizy i normalizacji danych niezbędny jest gen referencyjny lub kontrola wewnętrzna. Jako gen referencyjny w tym doświadczeniu zastosowano białko rybosomalne (AP-RP1).
3. Przygotuj roztwory robocze primerów o stężeniu 5uM, w tym primery dla genu referencyjnego.

Przygotowanie standardów

4. W celu obliczenia wydajności stosowanych starterów należy przygotować standardy.
5. Przygotować mieszaninę cDNA z różnych próbek, które będą testowane.
6. Wykonać 5-krotne rozcieńczenia seryjne dla każdego pożądanego punktu na wykresie. Cztery rozcieńczenia powinny być wystarczające, ale wysoce zaleca się wykonanie pięciu.
7. Objętość będzie zależeć od liczby punktów oraz liczby powtórzeń technicznych. Powinno być wystarczająco dużo materiału, aby przygotować standard dla każdego badanego genu, w tym genu referencyjnego.

Szablon płytki

8. Przygotuj szablon wskazujący nazwę próbki dla każdej studzienki w płytce do qRT-PCR. Pamiętaj o uwzględnieniu standardów dla każdego genu oraz co najmniej dwóch powtórzeń technicznych dla każdej próbki.

Ustaw parametry cyklu

9. Włącz urządzenie do qRT-PCR i wprowadź parametry cykli. Parametry cykli dla tego eksperymentu są następujące:
   Krok 1:
   • 1 cykl: 95°C 3 min
   Krok 2:
   • 40 cykli: 95°C 15 sec, a następnie 60°C 30 sec
     (Opcjonalnie: w celu wyznaczenia krzywej topnienia należy uwzględnić poniższe kroki)
   Krok 3:
   • 1 cykl: 95°C 1 min
   Krok 4:
   • 1 cykl: 55°C 1 min
   Krok 5:
   • 81 cykli: 5°C 30 sec

Przygotowanie płytki dla urządzenia CFX96 (BioRad)

11. Przygotować mieszaninę główną (master mix) dla każdego genu (w tym genu referencyjnego) w oddzielnych probówkach. Dla każdej dołki mieszanina główna składa się z

    Woda wolna od nukleaz	2μl
    2,5X SYBR Green	4 μl
    Starter przedni	1 μl
    Starter odwrotny	1 μl
    Objętość całkowita	8 μl

12. Podczas przygotowywania mieszaniny głównej (master mix) należy uwzględnić 1-2 dodatkowe reakcje, aby zniwelować błędy pipetowania.
13. Zgodnie z wcześniej zaprojektowanym szablonem, dodać 2 μL (20 ng/ μL) cDNA do każdej dołki. Następnie dodać 8 μL mieszaniny master mix do każdej studzienki, co daje objętość całkowitą wynoszącą 10 μL na jedną reakcję.
14. Pipetować w górę i w dół (2–3 razy), aby upewnić się, że próbka została dobrze wymieszana. Sprawdzić, czy na końcówce nie pozostał płyn. Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej, należy używać nowej końcówki dla każdej próbki.
15. Po przygotowaniu całej płytki należy zakleić ją taśmą optyczną. Należy unikać dotykania taśmy, ponieważ obecność tłuszczu może wpłynąć na odczyt. Następnie płytkę należy wirować z prędkością 50 obr./min przez 1 minutę, aby upewnić się, że wszystkie produkty w dołkach znajdują się na dnie płytki.
16. Po odwirowaniu należy upewnić się, że na dnie płytki nie ma lodu ani wody. Następnie płytkę należy umieścić w urządzeniu do qRT-PCR i uruchomić program PCR.

V. Schematyczne przedstawienie eksperymentu

Rysunek 1: Schemat blokowy przedstawiający sekwencyjny przebieg etapów badania ekspresji genów.

Rysunek 2A) sekcja larwy EAB z widocznym jelitem środkowym w części centralnej. B) wyizolowane jelito środkowe larwy EAB

Rysunek 3: A) Średnie wartości względnej ekspresji (REV) dla genu peritrofiny (AP-PERI1) w różnych tkankach larwalnych, w tym w kutykuli (Cu), jelicie środkowym (MG) i ciałkach tłuszczowych (FB). Specyficzne dla EAB białko rybosomalne (tutaj nazwane, AP-RP1) wykorzystano jako kontrolę wewnętrzną do normalizacji danych uzyskanych dla badanego genu, AP-PERI1B) Względna krotność zmiany AP-PERI1 w tkankach larwalnych. Tkanka kutykuli wykazywała najniższą ekspresję, dlatego została przyjęta jako próbka kalibracyjna (1X) (Pfaffl, 201).

Rycina 4: A) Średnie wartości względnej ekspresji (REV) dla genu peritrofin (AP-PERI1) w różnych stadiach rozwojowych EAB, w tym w stadiach larwalnych (I, II, III i IV), przepoczwarach (PP) oraz imago (A). Specyficzne dla EAB białko rybosomalne (AP-RP1) wykorzystano jako kontrolę wewnętrzną do normalizacji danych uzyskanych dla badanego genu, AP-PERI1B) Względna krotność zmiany AP-PERI1 na różnych etapach rozwoju. Próbka PP wykazała najniższy poziom mRNA, w związku z czym przyjęto ją jako kalibrator (próbka 1X).

VI. Podsumowanie

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnozowania poziomów mRNA w różnych tkankach owadów oraz na różnych etapach ich rozwoju. Ponadto qRT-PCR stanowiła przede wszystkim kluczowe narzędzie służące do walidacji danych uzyskanych z wysokoprzepustowych analiz ekspresji genów, takich jak mikromacierze oraz sekwencjonowanie RNA nowej generacji (RNA-Seq).

Dyskusja

Wartość cyklu progowego (Ct) uzyskano dla każdej próbki na płytce do qRT-PCR. W celu sporządzenia krzywej wzorcowej wartość Ct uzyskaną dla każdego rozcieńczenia naniesiono na wykres w funkcji logarytmu jego stężenia. Następnie wartości Ct dla próbek eksperymentalnych naniesiono na tę krzywą wzorcową serii rozcieńczeń. Ilości docelowe obliczono na podstawie oddzielnych krzywych wzorcowych wygenerowanych dla każdego eksperymentu, tj. ekspresji w tkankach i ekspresji rozwojowej. Wartości ekspresji względnej (REVs) określon...