Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Podsumowanie

Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnostyki poziomów mRNA w różnych tkankach i stadiach rozwojowych owadów. W niniejszym raporcie prezentujemy zastosowanie qRT-PCR do oznaczenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych oraz stadiach rozwojowych inwazyjnego gatunku owada – opiętka jesionowego.

Streszczenie

Opuszka jesionowa (EAB,Agrilus planipennis) jest egzotycznym inwazyjnym szkodnikiem, który zabił miliony jesionów (Fraxinusspp) w Ameryce Północnej. EAB nadal szybko się rozprzestrzenia i atakuje jesiony w różnym wieku, od sadzonek po drzewa dojrzałe. Do tej pory jednak wiedza molekularna na temat EAB jest bardzo ograniczona lub nie istnieje. Jesteśmy zainteresowani rozszyfrowaniem opartych na mechanizmach molekularnych procesów fizjologicznych na poziomie tkankowym, które pomagają EAB w skutecznej kolonizacji jesionów. W niniejszym raporcie przedstawiamy efektywne wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) do określenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych (w tym w jelicie środkowym, ciałkach tłuszczowych i kutykuli) oraz w różnych stadiach rozwojowych (w tym 1^st- , 2^gie- 3^rd- , 4^th(stadia larwalne, przepoczwarki i osobniki dorosłe) EAB. Jako przykład, gen peritrofin (nazwany tutaj,AP-PERI1) jest przedstawiony jako gen docelowy oraz białko rybosomalne (AP-RP1) jako kontrolę wewnętrzną. Peritrofiny są ważnymi składnikami błony/macierzy peritroficznej (PM), która stanowi wyściółkę jelita owada. PM pełni różnorodne funkcje, w tym uczestniczy w trawieniu oraz zapewnia ochronę mechaniczną nabłonka jelita środkowego.

Protokół

Kompletny protokół z poszczególnymi etapami przedstawiono na schemacie blokowym na Rysunku 1. Poszczególne kroki obejmujące sekcję, ekstrakcję RNA, syntezę pierwszej nici cDNA oraz qRT-PCR zostały szczegółowo opisane poniżej.

I. Disekcja larw

1. Przed rozpoczęciem procedury należy umieścić larwy opłatek jesionowy (Emerald ash borer, EAB) na wilgotnym papierze ręcznikowym do czasu przeprowadzenia sekcji. Świeżo przygotowany 1X roztwór soli fosforanowej w buforze (phosphate buffered saline, PBS) należy przechowywać w lodzie, aby bufor pozostał zimny przez cały czas trwania sekcji.
2. Na początek należy unieruchomić larwy EAB na płytce sekcyjnej za pomocą cienkich szpilek sekcyjnych. Następnie na płytkę należy wlać zimny 1X PBS.
3. W pierwszej kolejności należy odciąć głowy larw za pomocą cienkich nożyczek sekcyjnych. Następnie należy usunąć ostatni segment odwłoka larw.
4. Za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej należy oddzielić kutykulę od ciała larwy. Następnie, używając nożyczek, należy wykonać nacięcie wzdłuż ciała. Podczas nacinania należy uważać, aby nie przerwać ciągłości jelita.
5. Należy ostrożnie wyizolować tkankę jelita środkowego od innych tkanek, takich jak ciała tłuszczowe i tkanka łączna. Następnie tkankę należy przepłukać świeżym buforem 1X PBS, aby upewnić się, że nie występuje zanieczyszczenie ciałem tłuszczowym. Wyizolowane jelito środkowe należy przenieść do probówki eppendorf 1,5 mL zawierającej 500 μL schłodzonego odczynnika Trizol.
6. Następnie należy wyizolować tkankę ciała tłuszczowego za pomocą pęsety i przenieść ją do probówki eppendorf 1,5 mL zawierającej 500 μL schłodzonego odczynnika Trizol.
7. Na koniec należy wyizolować tkankę kutykuli z ciała larwy, zeskrobując wszelkie przylegające tkanki i dbając o to, by nie naruszyć integralności tkanki. Wyizolowaną tkankę kutykuli należy przepłukać w świeżym buforze PBS i przenieść do probówki eppendorf 1,5 mL z 500 μL schłodzonego odczynnika Trizol.
8. Wyizolowane tkanki ciała tłuszczowego, kutykuli i jelita środkowego można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji RNA.
9. W ramach przygotowania do ekstrakcji RNA należy posortować poszczególne próbki EAB zgodnie z etapami rozwoju. Etapy te obejmują 1., 2., 3. i 4. stadium larwalne, przepoczwarki oraz osobniki dorosłe.

II. Izolacja RNA (zgodnie z protokołem producenta dla odczynnika Trizol)

Homogenizacja

1. Aby rozpocząć ekstrakcję RNA, należy najpierw użyć plastikowych tłuczków do homogenizacji tkanek w probówkach Eppendorf o pojemności 1,5 mL zawierających Trizol. Po homogenizacji należy uzupełnić całkowitą objętość każdej próbki do 1 mL za pomocą odczynnika Trizol.
2. W przypadku stadiów rozwojowych należy homogenizować całe zwierzę w ciekłym azocie przy użyciu moździerza i tłuczka. Następnie należy dodać alikwot homogenatu (50 μg) do 1 mL Trizolu.

Rozdzielanie faz:

3. Inkubować probówki z próbkami zawierające 1 mL Trizol przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Po inkubacji dodać do każdej probówki 200μL chloroformu. Bezpośrednio po dodaniu chloroformu energicznie potrząsać probówkami przez około 15 sekund. Następnie inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez kolejne 2-3 minuty.
5. Następnie wirować próbki z prędkością 12,000Xg przez 15 minut w temperaturze 2 °C. Po wirowaniu RNA znajdzie się w fazie wodnej. Objętość fazy wodnej powinna wynosić 600 μl, czyli 60% całkowitej objętości Trizol.

Wytrącanie RNA

6. Ostrożnie usuń wyłącznie fazę wodną. Obecność substancji znajdujących się poniżej fazy wodnej spowoduje zanieczyszczenie ekstrahowanego RNA. Następnie przenieś fazę wodną do odpowiednio oznakowanej probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 mL.
7. Aby wyprecypitować RNA z fazy wodnej, dodaj do każdej probówki 0,5 mL alkoholu izopropylowego i wymieszaj. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji wirowaj probówki przy 12,000Xg przez 10 minut w temperaturze 2°C.

Przemywanie RNA

8. Po wirowaniu odlej nadsącz z probówek. RNA znajduje się w żelowatym osadzie utworzonym na dnie probówki. Przemyj osad 75% etanolem, dodając co najmniej 1 mL 75% etanolu na każdy 1 mL Trizol. Wymieszaj na wirówce vortex. Następnie wiruj probówki z prędkością 7500Xg przez 5 minut w temperaturze 2 °C.

Elucja RNA

9. Odlej nadsącz z probówek. Ponownie odwiruj probówki w małej wirówce stołowej przez 1 minutę. Usuń nadmiar nadsączu z probówki za pomocą ostrożnego pipetowania. Pozostaw probówkę otwartą i pozwól osadowi wyschnąć na powietrzu przez 5-10 minut. Należy uważać, aby nie przesuszyć osadu, ponieważ znacznie zmniejszy to jego rozpuszczalność.
10. Po wysuszeniu na powietrzu zawiesić ponownie osad w wodzie traktowanej pirowęglanem dwuetylowym (DEPC). Ilość wody użytej do resuspensji zależy od wielkości osadu. Użyj 50 μL wody traktowanej DEPC dla małego osadu lub 100 μL dla dużego osadu. Pozostaw osad do całkowitego rozpuszczenia w wodzie traktowanej DEPC, kilkakrotnie przesuwając końcówkę pipety w górę i w dół.
11. Po rozpuszczeniu osadu inkubuj próbkę w temperaturze 55 °C przez 10 minut.
12. Następnie zmierz stężenie każdej próbki RNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop (2 μL próbki RNA).
13. Próbki RNA przechowuj w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.

III. Synteza pierwszej nici cDNA (zgodnie z protokołem producenta z użyciem zestawu SuperScript first strand Synthesis firmy Invitrogen).

1. Do każdej próbki RNA należy dodać do probówki PCR następujące składniki:

   RNA	x μl
   10mM mieszanina dNTP M	1μl
   Oligo(dt) (0.5 μg/ μl)	1 μl
   woda traktowana DEPC	(8-x) μl
   Objętość całkowita:	10 μl
   Uwaga: x to objętość RNA wykorzystana do syntezy cDNA. W zależności od stężenia RNA, do każdej reakcji należy użyć 2-3 μg RNA, a całkowita objętość każdej reakcji powinna wynosić 10 μl.

2. Powyższą mieszaninę reakcyjną należy inkubować w termocyklerze w temperaturze 65°C przez 4 minuty.
3. Probówki należy wyjąć z termocyklera i bezzwłocznie umieścić w lodzie na co najmniej 2 minuty.
4. Przygotować master mix pierwszej nici, dodając następujące składniki:

   10X Bufor RT	2μl
   25mM MgCl2	4 μl
   0.1M DTT	2 μl
   RNase out	1 μl

5. Do każdej probówki zawierającej próbkę RNA należy dodać 9 μl master mixu, wymieszać za pomocą pipety i krótko odwirować mieszaninę.
6. Probówki należy ponownie umieścić w termocyklerze i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 42°C.
7. Należy zatrzymać pracę termocyklera i do każdej probówki dodać 1 μl enzymu odwrotnej transkryptazy Superscript II (Invitrogen). Ten etap należy przeprowadzić szybko.
8. Próbki należy inkubować w temperaturze 42°C przez 1,5 godziny.
9. Reakcję należy przerwać, inkubując próbki w temperaturze 70°C przez 15 minut.
10. Probówki należy wyjąć z termocyklera i umieścić w lodzie.
11. Do każdej probówki należy dodać 1 μl RNase H, a następnie ponownie umieścić je w termocyklerze w temperaturze 37°C na 20 minut.
12. Po wyjęciu próbek z termocyklera do każdej probówki należy dodać 20 μl wody wolnej od nukleaz. Na tym etapie objętość każdej próbki ulega podwojeniu.
13. Należy sprawdzić stężenie każdej próbki, wykorzystując 2 μl materiału. Należy pobrać alikwoty z każdej próbki i doprowadzić je do stężenia 20ng/μl w celu zastosowania w qRT-PCR. Ilość wody potrzebna do uzyskania stężenia 20ng/μl zależy od początkowego stężenia zsyntetyzowanego cDNA.

IV. qRT-PCR:

Projektowanie starterów i wyznaczenie genu referencyjnego

1. Zaprojektuj primery o temperaturze topnienia (Tm) 60°C i wielkości produktu ok. 100bp.
2. W tym doświadczeniu jako gen docelowy wykorzystano AP-PERI1. Do późniejszej analizy i normalizacji danych niezbędny jest gen referencyjny lub kontrola wewnętrzna. Jako gen referencyjny w tym doświadczeniu zastosowano białko rybosomalne (AP-RP1).
3. Przygotuj 5uM roztwory robocze primerów, które zostaną wykorzystane, w tym primery dla genu referencyjnego.

Przygotowanie standardów

4. W celu obliczenia wydajności stosowanych starterów należy przygotować wzorce.
5. Przygotować mieszaninę cDNA z różnych próbek, które będą poddane analizie.
6. Przygotować 5-krotne rozcieńczenia seryjne dla każdego planowanego punktu na wykresie. Cztery rozcieńczenia powinny być wystarczające, jednak wysoce zalecanych jest pięć.
7. Objętość będzie zależeć od liczby punktów oraz liczby powtórzeń technicznych. Należy przygotować ilość wystarczającą do stworzenia wzorca dla każdego badanego genu, w tym dla genu referencyjnego.

Szablon płytki

8. Przygotuj szablon określający nazwę próbki dla każdego dołka na płytce do qRT-PCR. Pamiętaj o uwzględnieniu standardów dla każdego genu oraz co najmniej dwóch powtórzeń technicznych dla każdej próbki.

Ustaw parametry cykli

9. Włącz urządzenie do qRT-PCR i wprowadź parametry cykli. Parametry cykli dla tego eksperymentu są następujące:
   Krok 1:
   • 1 cykl: 95°C 3 min
   Krok 2:
   • 40 cykli: 95°C 15 sec, a następnie 60°C 30 sec
     (Opcjonalnie: w celu wyznaczenia krzywej topnienia należy uwzględnić następujące kroki)
   Krok 3:
   • 1 cykl: 95°C 1 min
   Krok 4:
   • 1 cykl: 55°C 1 min
   Krok 5:
   • 81 cykli: 55°C 30 sec

Przygotowanie płytki do urządzenia CFX96 (BioRad)

11. Przygotować master mix dla każdego genu (w tym genu referencyjnego) w oddzielnej probówce. Dla każdej studzienki master mix składa się z

    Woda wolna od nukleaz	2μL
    2,5 X SYBR green	4 μl
    Starter prawostronny	1 μl
    Starter odwrotny	1 μl
    Objętość całkowita	8 μl

12. Podczas przygotowywania mieszaniny głównej (master mix) należy uwzględnić 1-2 dodatkowe reakcje, aby zrekompensować błędy pipetowania.
13. Zgodnie z wcześniej zaprojektowanym szablonem, dodać 2 μL (20 ng/ μL) cDNA do każdej studzienki. Następnie dodać 8 μµl master mixu do każdej studzienki, co daje całkowitą objętość 10 μL na reakcję.
14. Wykonać 2-3 cykle pipetowania (zasysania i wydmuchiwania), aby upewnić się, że próbka została dobrze wymieszana. Sprawdzić, czy na końcówce nie pozostał płyn. Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej, należy używać nowej końcówki dla każdej próbki.
15. Po przygotowaniu całej płytki należy przykryć ją taśmą optyczną. Należy unikać dotykania taśmy, ponieważ obecność tłuszczu może wpłynąć na odczyt. Następnie płytkę wirować z prędkością 500 obr./min przez 1 minutę, aby upewnić się, że wszystkie produkty w dołkach znajdują się na dnie płytki.
16. Po odwirowaniu należy upewnić się, że na dnie płytki nie znajduje się lód ani woda. Na koniec należy umieścić płytkę w urządzeniu do qRT-PCR i uruchomić program PCR.

V. Schematyczny przebieg eksperymentu

Rysunek 1: Schemat blokowy przedstawiający sekwencyjną kolejność kroków w badaniu ekspresji genów.

Rycina 2: A) sekcja larwy EAB z widocznym jelitem środkowym w centrum. B) wyizolowane jelito środkowe larwy EAB

Rycina 3: A) Średnie wartości względnej ekspresji (REVs) dla genu peritrofiny (AP-PERI1) w różnych tkankach larwalnych, w tym w kutykuli (Cu), jelicie środkowym (MG) i ciałkach tłuszczowych (FB). Białko rybosomalne specyficzne dla EAB (nazwane tutaj AP-RP1) służyło jako kontrola wewnętrzna do normalizacji danych uzyskanych dla badanego genu AP-PERI1. B) Względna zmiana krotności ekspresji AP-PERI1 w tkankach larwalnych. Tkanka kutykuli wykazała najniższą ekspresję i została zatem przyjęta jako próbka kalibracyjna (1X) (Pfaffl, 2001).

Rysunek 4: A) Średnie wartości względnej ekspresji (REVs) dla genu peritrofiny (AP-PERI1) w różnych stadiach rozwojowych EAB, w tym w stadiach larwalnych (1., 2., 3. i 4. stadium), przepoczwarczeniu (PP) i stadium dorosłym (A). Specyficzne dla EAB białko rybosomalne (AP-RP1) służyło jako kontrola wewnętrzna do normalizacji danych uzyskanych dla badanego genu AP-PERI1. B) Względna zmiana krotności ekspresji AP-PERI1 w różnych stadiach rozwojowych. Próbka PP wykazała najniższy poziom mRNA i została zatem przyjęta jako kalibrator (próbka 1X).

VI. Podsumowanie

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnozowania poziomów mRNA w różnych tkankach owadów i etapach ich rozwoju. Co więcej, qRT-PCR stanowiło zazwyczaj kluczowe narzędzie do walidacji danych generowanych przez wysokoprzepustowe analizy ekspresji genów, takie jak mikromacierze oraz sekwencjonowanie RNA nowej generacji (RNA-Seq).

Dyskusja

Wartość cyklu progowego (Ct) uzyskano dla każdej próbki na płytce do qRT-PCR. W celu sporządzenia krzywej wzorcowej wartość Ct uzyskaną dla każdego rozcieńczenia naniesiono na wykres w funkcji logarytmu jego stężenia. Następnie wartości Ct dla próbek eksperymentalnych naniesiono na tę krzywą wzorcową serii rozcieńczeń. Ilości docelowe obliczono na podstawie oddzielnych krzywych wzorcowych wygenerowanych dla każdego eksperymentu, tj. ekspresji w tkankach i ekspresji rozwojowej. Wartości ekspresji względnej (REVs) określon...