Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Podsumowanie

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Streszczenie

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion kręgowca jest możliwość obrazowania komórek z wysoką rozdzielczością. W embrionach danio pręgowanego wstrzyknięcie plazmidowego DNA skutkuje ekspresją mozaikową, co pozwala na wizualizację pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek¹Opisujemy, w jaki sposób wstrzyknięcie plazmidowego DNA kodującego skierowane do błony białko fluorescencyjne GFP (mGFP) pod kontrolą promotora wszechobecnego może być wykorzystane do obrazowania komórek podlegających neurulacji. Kluczowym elementem tego protokołu jest metodologia obrazowania znakowanych komórek w wysokiej rozdzielczości w przekrojach, a także w czasie rzeczywistym. Protokół ten obejmuje wstrzyknięcie DNA mGFP do młodych embrionów zebrafish. Następnie embriony są poddawane sekcjonowaniu za pomocą wibrotomu, znakowaniu przeciwciałami i obrazowaniu za pomocą mikroskopu konfokalnego. Alternatywnie, żywe embriony wykazujące ekspresję mGFP mogą być obrazowane przy użyciu konfokalnej mikroskopii poklatkowej. Wcześniej wykorzystaliśmy to proste podejście do analizy zachowań komórkowych, które napędzają tworzenie cewy nerwowej w regionie tylnego mózgu embrionów zebrafish.²Preparaty utrwalone pozwoliły na bezprecedensową wizualizację kształtów i organizacji komórek w rurce nerwowej, natomiast obrazowanie na żywo uzupełniło to podejście, umożliwiając lepsze zrozumienie dynamiki komórkowej zachodzącej podczas neurulacji.

Protokół

1.Mikroiniekcja

1. Rozcieńczyć plazmid kodujący skierowane do błony białko fluorescencyjne GFP (mGFP, courtesy of Richard Harland) do stężenia 40 ng/ml. DNA przygotowuje się poprzez linearyzację plazmidu (mGFP/PCS2+, courtesy of Richard Harland) oczyszczonego przy użyciu zestawu Qiagen Maxi Prep Kit. W celu wizualizacji roztworu zaleca się dodanie czerwieni fenolowej (rozcieńczonej 1/10 całkowitej objętości). Roztwór DNA przechowywać na lodzie.
2. Pod stereomikroskopem skalibrować igłę do iniekcji (kapilary szklane 90 mm firmy Narishinge Scientific; nr kat. NA-GD-1), ustawiając igłę na szkiełku pomiarowym i delikatnie uderzając w część igły o średnicy 1 μm za pomocą czystego ostrza brzytwy (aby uzyskać końcówkę o odpowiednim rozmiarze).
3. Aby skalibrować igłę do iniekcji znanej objętości (2 nl), podłączyć igłę do aparatury do mikroiniekcji (mikroinjektor PCI 10; Harvard Apparatus) i napełnić igłę od przodu 0,5 μl roztworu zawierającego czerwień fenolową i wodę umieszczoną na kawałku parafiny. Roztwór można wydzielać za pomocą pedału nożnego. Ustawić ciśnienie na 7 KPa i zmieniać czas (10 msec – 30 msec) tak, aby wydzielenie 0,5 μl roztworu wymagało 250 naciśnięć pedału.
4. Ostrożnie umieścić skalibrowaną igłę na pasku wosku w nawilżonej szalce Petriego o średnicy 10 mm. Aby nawilżyć szalkę, należy umieścić mokre chusteczki Kimwipes wokół krawędzi (zapobiega to odparowaniu roztworu z igły).
5. Za pomocą mikropipety wprowadzić 0,5-1 μl DNA do końca igły (końca, który nie był kalibrowany).
6. Gdy roztwór dotrze do końcówki igły, podłączyć koniec użyty do ładowania do aparatury do mikroiniekcji. Dostosować ustawienia mikroinjektora tak, aby za pomocą pedału nożnego podawać około 2 nl na jedną iniekcję.
7. Następnie umieścić embriony zebrafish w środku szalki Petriego wypełnionej pożywką do embrionów (Embryo Medium: 1,0 ml Hank's Stock #1, 0,1 ml Hank's Stock #2, 1,0 ml Hank's Stock #4, 95,9 ml ddH₂O, 1,0 ml Hank's Stock #5, 1,0 ml świeżego Hank's Stock #6; użyć około 10 kropli 1 M NaOH do uzyskania pH 7,2).
8. Gdy embriony osiągną pożądany stopień rozwoju, delikatnie uchwycić chorion cienkimi pęsetą i umieścić igłę w obszarze przeznaczonym do iniekcji. W celu uzyskania szerokiej ekspresji mGFP wstrzyknąć DNA do żółtka lub cytoplazmy w stadium 1 komórki. Aby ograniczyć ekspresję mGFP do mniejszego obszaru, wstrzyknąć DNA w stadium 4 (lub więcej) komórek do cytoplazmy pojedynczej komórki.
9. Nacisnąć pedał nożny aparatury do mikroiniekcji i podać około 2 nl, upewniając się, że roztwór (widoczny dzięki dodatkowi czerwieni fenolowej) został prawidłowo wstrzyknięty.
10. Ostrożnie wyciągnąć igłę z embrionu.
11. Powtórzyć procedurę dla wszystkich embrionów w szalce Petriego.
12. Pozostawić embriony do rozwoju w temperaturze 28,5°C do pożądanego stadium.
13. Przeprowadzić dechorionację embrionów, delikatnie zdejmując chorion za pomocą cienkiej pęsety (jeśli embriony mają mniej niż 24 hpf, dechorionacja w szklanej szalce Petriego zwiększa przeżywalność embrionów).
14. Usunąć pusty chorion z szalki Petriego za pomocą pipety szklanej.

2. Obrazowanie przekrojów wykonanych wibratomem z etykietą mGFP

1. Za pomocą szklanej pipety przenieś embriony do utrwalacza (4% paraformaldehydu w 1X roztworze buforu fosforanowego (PBS)). Utrwalaj embriony przez noc w temperaturze 4°C.
2. Przepłucz embriony w 1X PBS 3 razy po 5 minut.
3. Umieść embriony w szalce Petriego i za pomocą precyzyjnej pęsety usuń żółtko, nie uszkadzając embrionu. Usuń jak najwięcej żółtka.
4. Przygotuj 4% niskotopliwą agarozę w H₂O.
5. Wlej roztopioną agarozę do plastikowej formy do sekcjowania.
6. Używając precyzyjnej pęsety, podnieś wstrzyknięty embrion z szalki Petriego, a następnie umieść go i zorientuj w agarozie. Embrion powinien być ustawiony w stronę jednego z końców formy.
7. Po stwardnieniu agarozy użyj narzędzia z płaską powierzchnią, np. szpatułki, aby wyjąć blok agarowy z formy.
8. Odetnij dolną krawędź bloku agarowego żyletką, aby wyrównać powierzchnię.
9. Nanieś kroplę superkleju na stolik wibrotomu i umieść na nim blok agarowy (strona bloku wyrównana żyletką powinna być skierowana w stronę kleju). W przypadku sekcjowania wielu embrionów, zamocuj na stoliku kilka okazów zatopionych w agarozie.
10. Przymocuj stolik do wibrotomu (Vibratome, Inc.).
11. Ustaw parametry wibrotomu (typowe ustawienia: prędkość-3; grubość-50μm). Przy sekcjowaniu wielu embrionów wyrównaj bloki agarowe na stoliku i upewnij się, że ostrze przechodzi przez cały embrion, ale nie przez całą szerokość bloków agarowych (tak, aby przekroje odpowiadające temu samemu embrionowi pozostały razem).
12. Wlej 1X PBS na stolik wibrotomu.
13. Wykonaj sekcjowanie.
14. Po zacięciu embrionów usuń bloki agarowe ze stolika wibrotomu.
15. Ostrożnie oddziel każdy przekrój, przecinając tył bloków agarowych.
16. Używając precyzyjnej pęsety, wybierz pożądane przekroje i umieść je w wielooddziałkowej szalce wypełnionej 1X PBS (użyj różnych oddziałków dla przekrojów pochodzących z różnych embrionów).
17. Powtórz czynność dla każdego embrionu.
18. Przejdź do znakowania przeciwciałami (kroki od 19 do 23), aby wzmocnić obrazowanie mGFP (ten etap może nie być konieczny, jeśli obrazowanie przekrojów odbywa się w ciągu jednego lub dwóch dni od przygotowania).
19. Inkubuj przekroje przez 30 minut w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym w 1X PBS, aby zablokować wiązania niespecyficzne.
20. Inkubuj przekroje z przeciwciałem pierwszorzędowym (rabbit a-GFP, Invitrogen Cat No. A112) rozcieńczonym 1:20 w roztworze blokującym na wytrząsarce przez 5 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C.
21. Przepłucz cztery razy (odpowiednio przez 10 min, 15 min, 30 min i 60 min) w roztworze 1% BSA/1X PBS/ 1% DMSO.
22. Traktuj przekroje odpowiednim przeciwciałem wtórnym w roztworze blokującym przez 5 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C.
23. Przepłucz cztery razy (odpowiednio przez 10 min, 15 min, 30 min i 60 min) w roztworze 1% BSA/1X PBS/ 1% DMSO.
24. Traktuj przekroje DAPI (0,1% DAPI w 50ml 1X PBS; Invitrogen Cat No. D1306) przez 30 min w celu barwienia jąder komórkowych.
25. Przepłucz trzy razy w 1X PBS po 5 minut.
26. Zamontuj na szkiełku.
27. Wykonaj obrazowanie przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

3. Obrazowanie na żywo

1. Przeprowadź dechorionację żywych, wstrzykniętych zarodków na 30 minut przed osiągnięciem przez nie pożądanego stopnia rozwoju. Umieść zarodki w roztworze sedatywnym (0,01% tricainy w medium dla zarodków) na 15 min.
2. Nanieś kroplę 1% agarozy na szalkę hodowlaną z szklanym dnem o średnicy 35 mm (MatTek; nr kat. P35G-o-20-C).
3. Pozostawić agarozę do stężenia.
4. Podgrzej kapilarę nad płomieniem, aby wykonać 3 otwory w agarozie (do wykonania otworów można użyć innych przedmiotów, np. końcówek do mikropipet). Upewnij się, że na dnie otworów nie pozostały resztki agarozy.
5. Napełnić szalkę Petriego pożywką dla embrionów.
6. Za pomocą szklanej pipety umieść embrion w otworze.
7. Następnie, za pomocą pęsety precyzyjnej, ustaw zarodek tak, aby obszar przeznaczony do obrazowania (grzbietowa część głowy) stykał się ze szkłem.
8. Ostrożnie przenieś szalkę Petriego na stolik mikroskopu (na szalce powinna znajdować się pokrywka, aby zapobiec parowaniu).
9. Podczas obrazowania należy upewnić się, że embriony znajdują się w 28.5°C.

4. Wyniki

Opisujemy tutaj prostą metodę obrazowania pojedynczych komórek w cewie nerwowej danio pręgowanego z wykorzystaniem ekspresji mozaikowej. Pomimo przeźroczystości optycznej zarodka danio pręgowanego, stwierdziliśmy, że wizualizacja komórek nerwowych jest znacznie lepsza w przekrojach wykonanych za pomocą wibratomu. Przekroje te są grube (50 mm), co umożliwia obrazowanie wypustek komórkowych danej komórki w różnych płaszczyznach ogniskowania przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Wyniki uzyskane za pomocą tej metodologii zostały opublikowane w innym opracowaniu ², jednak przedstawiono reprezentatywne obrazy komórek w cewie nerwowej zarodka typu WT (Rysunek 1) oraz mutanta N-kadheryny (N-cad) (Rysunek 2). Te drugie wykazują, że komórki w obszarach bocznych płytki nerwowej u mutantów N-cad nie orientują się prawidłowo w stronę linii środkowej (Rysunek 2). W przeciwieństwie do tego znakowania mozaikowego, immunobarwienie neuroepithelium ogólnym markerem powierzchni komórkowej, takim jak beta-katenina, nie pozwala na wizualizację morfologii poszczególnych komórek (Rysunek 3).

Obrazowanie typu time-lapse żywych embrionów uzupełniło mozaikowe znakowanie utrwalonych preparatów, co pozwoliło na lepsze zrozumienie dynamiki komórkowej zachodzącej podczas neurulacji. Film 1 wykazał, że komórki WT aktywnie migrują w kierunku linii środkowej, wysuwając zorientowane medialnie wypustki błonowe.

Rycina 1. ekspresja mGFP w rurze nerwowej zarodka zebry WT.

Rysunek 2. ekspresja mGFP w rurze neuronalnej zarodka ryby danio-ostroskrzelnej N-cadherin.

Rysunek 3. immunobarwienie $\beta$-kateniny w neuroepitelium.

Dyskusja

Podsumowując, opisane tutaj techniki znakowania umożliwiają analizę pojedynczych komórek w procesach morfogenetycznych zarodka danio pręgowanego. Głównym celem niniejszego protokołu są metody obrazowania znakowanych komórek w cewce nerwowej z wykorzystaniem mGFP pod kontrolą promotora powszechnego. W celu zapoznania się z dodatkowymi zastosowaniami tej metody przejściowej ekspresji czytelnicy powinni odnieść się do niedawnej publikacji Andersen et al.³.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwory
Roztwór zapasowy Hank'a nr 1: 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl w 100 ml dd H2O Roztwór zapasowy Hank'a nr 2: 0,358 g bezwodnego Na2HPO4, 0,60 g KH2PO4 w 100 ml ddH2O Roztwór zapasowy Hank'a nr 4: 0,72 g CaCl2 w 50 ml ddH2O Roztwór zapasowy Hank'a nr 5: 1,23 g MgSO4x7H2O w 50 ml dd H2O Bufor fosforanowy 1X: 0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,02 M PO4, pH 7,3 Roztwór blokujący: 2% normalne surowica kozia, 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1% dimetylosulfotlenku (DMSO)