Drosophila Schneider (S2) są coraz popularniejszym systemem służącym do odkrywania i analizy funkcjonalnej genów. Naszym celem jest opisanie niektórych technik mikroskopowych, które sprawiają, że komórki S2 stają się tak istotnym systemem eksperymentalnym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie komórek S2 Drosophila do mikroskopii świetlnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Idealny system eksperymentalny powinien być tani i łatwy w utrzymaniu, podatny na zastosowanie różnorodnych technik oraz wspierany przez obszerną literaturę i bazę danych sekwencji genomowych. Hodowane komórki Drosophila S2, będące produktem dysocjacji embrionów w wieku 20-24 godzin1, posiadają wszystkie te właściwości. W konsekwencji komórki S2 są niezwykle odpowiednie do analizy procesów komórkowych, w tym do odkrywania genów kodujących molekularne komponenty interesującego procesu lub mechanizmu. Cechami komórek S2, które w największym stopniu odpowiadają za ich użyteczność, są łatwość ich utrzymania, wyjątkowa wrażliwość na interferencję RNA (RNAi) opartą na dwuniciowym RNA (dsRNA) oraz podatność na badanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, zarówno w formie komórek żywych, jak i utrwalonych.
Komórki S2 mogą być hodowane w różnych pożywkach, w tym w wielu niedrogich, dostępnych komercyjnie, w pełni zdefiniowanych pożywkach bezsurowiczych2. Ponadto rosną one optymalnie i szybko w temperaturze 21-24°C i mogą być hodowane w różnych naczyniach. W przeciwieństwie do komórek ssaków, komórki S2 nie wymagają regulowanej atmosfery; dobrze rosną w zwykłym powietrzu i mogą być nawet utrzymywane w szczelnie zamkniętych kolbach.
Uzupełnieniem łatwości stosowania RNAi w komórkach S2 jest możliwość sprawnej analizy indukowanych eksperymentalnie fenotypów za pomocą mikroskopii fazowej lub fluorescencyjnej utrwalonych lub żywych komórek. Komórki S2 rosną w hodowli jako pojedyncza warstwa, jednak nie wykazują hamowania kontaktowego. Zamiast tego, w gęstych hodowlach komórki mają tendencję do wzrostu w koloniach. Przy niskiej gęstości hodowle S2 hodowane na szkle lub plastiku traktowanym do hodowli tkankowej są okrągłe i słabo przytwierdzone. Niemniej jednak, cytologię komórek S2 można znacznie poprawić, indukując ich rozprzestrzenienie poprzez krótkotrwałą hodowlę na powierzchni pokrytej lektyną, konkanawaliną A (ConA)3. Komórki S2 mogą być również stabilnie transfekowane markerami znakowanymi fluorescencyjnie w celu oznakowania interesujących struktur lub organelli w żywych lub utrwalonych komórkach. Zatem typowy przebieg analizy mikroskopowej komórek wygląda następująco: najpierw komórki S2 (które mogą posiadać transgeny do ekspresji znaczników) są poddawane RNAi w celu eliminacji białka (białek) docelowych. Czas trwania zabiegu RNAi można dostosować do różnic w kinetyce wymiany białek oraz w celu zminimalizowania urazów i śmierci komórek, jeśli białko docelowe jest istotne dla ich żywotności. Następnie potraktowane komórki przenosi się do naczynia zawierającego szkiełko podstawowe pokryte wcześniej conA, aby zaindukować rozprzestrzenienie się komórek i ich silne przyleganie do szkła. Na koniec komórki obrazuje się wybranymi przez badacza trybami mikroskopii. Komórki S2 są szczególnie przydatne w badaniach wymagających długotrwałej wizualizacji żywych komórek, ponieważ zachowują one żywotność w temperaturze pokojowej i w normalnych warunkach atmosferycznych.
Protokół
1. Przygotowanie komórek S2 do mikroskopii
Komórki Schneidera S2 pochodzą z trypsynizowanych późnych embrionów muszki owocówki Drosophila szczepu Oregon R. Pierwotna hodowla Schneidera składała się z mieszaniny typów komórek, lecz stawała się bardziej jednorodna wraz z kolejnymi pasażami1. Opisano je jako komórki przypominające makrofagi (posiadają zdolność do fagocytozy) z ekspresją genów charakterystyczną dla hemocytów. Komórki S2 można nabyć z ATCC, DGRC lub Invitrogen.
A. Wybór pożywki wzrostowej
Do hodowli komórek S2 wykorzystywano szereg różnych pożywek. Żadna z wymienionych poniżej pożywek nie wymaga atmosfery z 5% CO2.
- Schneider pierwotnie stosowała swoją zdefiniowaną pożywkę (pożywka Schneidera dla Drosophila) uzupełnioną o 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Choć zastosowanie FBS sprawia, że pożywka ta jest droższa niż wspomniane poniżej pożywki bezsurowicze, charakteryzuje się ona stosunkowo niską autofluorescencją, co czyni ją dobrym wyborem do mikroskopii epifluorescencyjnej żywych komórek. Zawiera ona jednak wystarczającą ilość metali, aby stymulować niski poziom ekspresji transgenów pod kontrolą indukowalnego promotora metalotioneiny (np. genów subklonowanych do wektora pMT firmy Invitrogen), co powoduje „przeciekową” ekspresję genu przed indukcją.
- Dostępnych jest komercyjnie kilka rodzajów pożywek bezsurowiczych (np. Sf900 II, HyClone SFX-Insect oraz Insect-Xpress). Pożywki te są stosunkowo tanie, ale zazwyczaj stymulują wyższe poziomy ekspresji w przypadku stosowania transgenów regulowanych promotorem metalotioneiny w porównaniu z pożywką Schneidera. Co więcej, pożywki te wykazują znaczną autofluorescencję w porównaniu z pożywką Schneidera/FBS (istotny aspekt podczas wykonywania mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek).
- Opcjonalnie do pożywki można dodać antybiotyki; zazwyczaj są to penicylina G i siarczan streptomycyny (ostateczne stężenia odpowiednio 50-100 units/mL i 50-100 μg/mL). Można również dodać środek przeciwgrzybiczy, amfoterycynę B, w stężeniu 250 ng/mL (stężenie ostateczne).
B. Warunki hodowli
Komórki S2 są łatwe w utrzymaniu w normalnej temperaturze laboratoryjnej i warunkach atmosferycznych. Podczas obrazowania żywych komórek S2 przez dłuższy czas, głównymi przyczynami śmierci komórek są odwodnienie oraz fototoksyczność. Odwodnieniu można łatwo zapobiec, utrzymując odpowiednią ilość pożywki w naczyniu na mikroskopie. Fototoksyczność jest trudniejszym problemem, który wymaga zminimalizowania skumulowanej ekspozycji komórek na światło o wysokim natężeniu i wysokiej energii, przy jednoczesnym obrazowaniu z częstotliwością wystarczającą do zarejestrowania interesujących zdarzeń z odpowiednią rozdzielczością przestrzenną i czasową.
- Komórki S2 hodowane na plastiku do kultur tkankowych są zazwyczaj okrągłe i słabo przylegające. Komórki konfluentne rosną w postaci gęstej monowarstwy, a następnie coraz więcej z nich odrywa się i rośnie w zawiesinie. W przypadku mikroskopii zarówno komórek utrwalonych, jak i żywych, jakość obrazowania znacznie wzrasta, jeśli komórki zostaną pobudzone do spłaszczenia się na szkiełku nakrywkowym. Sposób wykonania tej procedury opisano poniżej (2. A. 2.).
2. Mikroskopia komórek S2
A. Mikroskopia żywych komórek
Używamy mikroskopów odwróconych do wizualizacji żywych komórek S2 wysianych na szalkach z szklanym dnem. Opisane poniżej szalki z szklanym dnem pozwalają utrzymać komórki w warunkach bardzo zbliżonych do ich standardowych warunków hodowli, a także umożliwiają badanie żywych komórek przez szkło o jakości mikroskopowej.
- Przygotowanie szalek z szklanym dnem
Komponenty:- Zestaw elastomeru silikonowego Sylgard 184
Jest to klej służący do mocowania szkiełek podstawkowych do szalek. Zestaw składa się z dwóch części: bazy żywicznej oraz utwardzacza, które miesza się w stosunku wagowym 10:1 (żywica : utwardzacz) bezpośrednio przed użyciem.
Aby przygotować mieszaninę żywicy i utwardzacza:- Odważyć około 5 g żywicy do plastikowej łódki wagowej. Zanotować wagę żywicy.
- Obliczyć ilość potrzebnego utwardzacza, mnożąc wagę żywicy przez 0,1. Dodać tę ilość utwardzacza do tej samej łódki wagowej za pomocą nowej pipety transferowej.
- Mieszać, aby dokładnie połączyć komponenty. Nie należy przejmować się pojawiającymi się pęcherzykami powietrza; powoli znikną one samoistnie.
- Klej jest teraz gotowy. Ma konsystencję miodu i będzie zdatny do użycia przez co najmniej godzinę. 5,5 g kleju wystarcza do przygotowania około 75 szalek, ale zależy to od oszczędności podczas nakładania kleju.
- Plastikowe szalki Petriego 35 mm
Nie używamy szalek klasy do hodowli komórkowych, ponieważ zależy nam jedynie na tym, aby komórki przytwierdziły się do szklanego dna (a nie do plastiku) – dlatego stosujemy tańsze, standardowe szalki Petriego. Niektóre stoliki mikroskopowe posiadają okrągłe zaciski do mocowania szalek 35 mm; jeśli takie posiadasz, upewnij się, że Twoje szalki pasują do zacisku. Co zaskakujące, nie wszystkie szalki 35 mm mają taką samą średnicę zewnętrzną. - Szkiełka podstawkowe
Należy dobrać szkiełka odpowiednie do posiadanego mikroskopu i potrzeb. Można zastosować zarówno drogie szkło specjalistyczne z trawionymi fotochemicznie siatkami (np. Electron Microscopy Sciences, okrągłe 23x23 mm, z siatką, nr 2, kat. nr 72264-23), jak i znacznie tańsze seryjne szkiełka podstawkowe (np. VWR, kwadratowe 22x22 mm, nr 1,5, kat. nr 48366-227). Uwaga: Szkło musi być nieco większe (o co najmniej ok. 1 mm) niż otwór, który zostanie wykonany w szalce Petriego, a jednocześnie mniejsze niż średnica szalki. W przypadku zakupu szkiełek kwadratowych należy upewnić się, że szkło całkowicie zakryje (i nieco wystanie poza) okrągły otwór, ale nie będzie dotykać ścianek szalki. Jeśli preferujesz czyszczenie szkiełek, należy to zrobić przed ich przyklejeniem do szalek. - Wiertarka elektryczna
Używamy wiertarki ręcznej z regulacją obrotów i przyciskiem blokady do pracy ciągłej. Wiercenie w szalkach jest znacznie łatwiejsze przy użyciu wiertarki stołowej, jednak produkcja szalek z szklanym dnem na małą skalę nie uzasadnia zakupu takiego urządzenia. - Wiertło
Należy użyć wiertła łopatkowego o średnicy ¾ cala (wiertło łopatkowe przedstawiono na stronie: http://en.wikipedia.org/wiki/Drill_bit). Oczywiście średnica wiertła determinuje średnicę otworu w dnie szalki. - Stożkowe wiertło szlifujące
Należy użyć stożkowego wiertła szlifującego o grubym ziarnie i średnicy zbliżonej do wiertła łopatkowego. Po wywierceniu wszystkich otworów należy użyć tego wiertła do usunięcia fragmentów plastiku na krawędzi otworu wystających z dna szalki. Fragmenty plastiku na zewnętrznej powierzchni szalki uniemożliwią przyleganie szkiełka podstawkowego do szalki. Nie należy przejmować się małymi kawałkami plastiku wystającymi do wnętrza szalki: nie wpłyną one na szkiełko ani na komórki. - Pudełko styropianowe z grubymi ściankami
Służy ono jako powierzchnia do wiercenia. Jedną z zewnętrznych stron pudełka styropianowego należy pokryć paskami taśmy uszczelniającej (używamy taśmy Scotch 1,5 cala); taśma minimalizuje wydostawanie się drobin styropianu podczas wiercenia.
Montaż- Położyć dolną część szalki Petriego 35 mm na oklejonej powierzchni pudełka styropianowego; szalkę należy ułożyć tak, aby jej dno stykało się ze styropianem. Trzymając mocno boki szalki, wywiercić w niej otwór. Uwaga: Palce trzymające szalkę będą znajdować się w odległości ułamka cala od obracającego się wiertła. Jest to naturalnie niebezpieczne. Należy przerwać wiercenie, jeśli szalka zacznie wirować. W przypadku posiadania wiertarki stołowej i/lub sprytnego sposobu na stabilne trzymanie szalki, należy z nich skorzystać. Nigdy nie mieliśmy wypadku, ale należy zrobić wszystko, co konieczne, aby ta procedura była bezpieczna.
- Po wywierceniu wszystkich szalek, wygładzić zewnętrzną krawędź otworów za pomocą wiertła szlifującego. Kładziemy wiertarkę elektryczną na boku, tak aby wiertło wystawało poza krawędź blatu. Wiertarkę unieruchamia się, kładąc na niej coś ciężkiego, lecz elastycznego (używamy wytrzymałej plastikowej torby zawierającej 10 kg piasku). Należy użyć przycisku blokady, aby wiertarka pracowała w sposób ciągły, a następnie wygładzić krawędzie wszystkich szalek, trzymając każdą z nich i przesuwając ją przeciwko wiertłu szlifującemu w celu usunięcia szorstkiej krawędzi nowego otworu.
- Włożyć wszystkie dna szalek do dużego zlewki i kilkakrotnie opłukać je wodą destylowaną, aby usunąć małe, luźne kawałki plastiku lub styropianu (które będą wypływać na powierzchnię). Następnie rozłożyć dna szalek do wyschnięcia.
- Po wyschnięciu szalek przygotować klej Sylgard 184. Nanieść niewielki okrąg kleju wokół wywierconego otworu na zewnętrznej powierzchni każdej szalki. Nie potrzeba dużo kleju; w rzeczywistości nadmiar kleju spowoduje zabrudzenia. Położyć szkiełko podstawkowe nad otworem, tak aby stykało się z klejem. Szkiełko powinno przylegać do szalki gładko i równomiernie. Jeśli klej nie został idealnie rozłożony wokół otworu, mogą powstać niewielkie szczeliny bez kleju między szkiełkiem a dnem szalki. Początkowo nie należy się nimi przejmować; zazwyczaj klej sam wpłynie w te szczeliny, wypełniając je.
- Po przyklejeniu wszystkich szkiełek sprawdzić ponownie szalki pod kątem szczelin, których klej nie wypełnił. W każdej takiej szczelinie nanieść małą kropelkę kleju na krawędź szkiełka obok szczeliny; klej zostanie wciągnięty do środka.
- Odstawić szalki dnem do góry do wyschnięcia. W temperaturze pokojowej może to zająć dzień lub więcej, ale tempo utwardzania można przyspieszyć, umieszczając szalki w ciepłym inkubatorze.
- Jeśli potrzebne są sterylne szalki, należy umieścić dna szalek i pokrywki w dygestorium do hodowli tkanek i rozłożyć je. Nie należy nakładać pokrywek na dna szalek. Zamiast tego należy obrócić elementy tak, aby ich wewnętrzne powierzchnie były skierowane bezpośrednio w stronę żarówki UV. Włączyć sterylizujące światło UV na co najmniej 45 min. Jeśli planuje się pokrycie szalek ConA (patrz poniżej), nie należy ich sterylizować przed nałożeniem powłoki.
- Szalki są teraz gotowe do użycia.
- Zestaw elastomeru silikonowego Sylgard 184
- Stosowanie konkanawaliny A
Wykazano, że lektyna, konkanawalina A (ConA), stymuluje komórki S2 do spłaszczania się na powierzchni pokrytej ConA3. Gdy komórki S2 są wysiewane na szkiełka podstawkowe pokryte ConA, rozprzestrzeniają się i stają się doskonałymi preparatami do mikroskopii.- Aby pokryć zwykłe szkiełka podstawkowe ConA, należy rozłożyć oczyszczone szkiełka na kawałku Parafilmu przyklejonego taśmą do blatu. Nanieść 10 μL roztworu ConA o stężeniu 0,5 mg/mL (w sterylnej wodzie) na powierzchnię każdego szkiełka, a następnie rozprowadzić materiał po całej górnej powierzchni szkiełka. Po wyschnięciu przechowywać szkiełka w czystym, suchym pojemniku. Pokryte szkło można wysterylizować światłem UV w dygestorium do hodowli tkanek.
- Aby pokryć szalki z szklanym dnem ConA, analogicznie nanieść 10 μL roztworu ConA na górną stronę szkła (tę skierowaną w stronę pokrywki). Po wyschnięciu szalki można wysterylizować zgodnie z powyższym opisem. Szalki lub szkiełka pokryte ConA przechowuje się w temperaturze pokojowej i można ich używać przez wiele miesięcy po przygotowaniu.
- Obrazowanie
- Delikatnie resuspendować komórki S2 poddane działaniu RNAi i przenieść je do pokrytej ConA szalki z szklanym dnem zawierającej 2 mL medium. Zdrowe komórki, które zetkną się z pokrytym ConA szkiełkiem, ściśle do niego przytwierdzą i zaczną się rozpłaszczać. Proces ten powinien stać się widoczny po około 15 min i zakończyć się w czasie od 45 min do 1 h. Należy pamiętać, że przytwierdzone komórki nie mogą przeprowadzać cytokinezy ze względu na silne przyleganie do powierzchni pokrytej ConA i z czasem staną się poliploidalne. Komórki wysiane do szalek pokrytych ConA pozostaną zdrowe przez dłuższy czas, ale nie będą w nich proliferować.
- Po przytwierdzeniu komórek można wymienić medium, jeśli stare medium wykazuje autofluorescencję. Może to być zbędne w badaniach z wykorzystaniem mikroskopów konfokalnych, mikroskopów dekonwolucyjnych lub mikroskopów szerokopolowych z obiektywami o małej głębokości ostrości.
- Ponieważ komórki S2 są zdrowe w temperaturze pokojowej i w normalnej atmosferze, podczas ich obserwacji pod mikroskopem nie są wymagane żadne specjalne warunki ani sprzęt. Często wykonujemy długie filmy time-lapse z żywych komórek S2. W praktyce czas trwania tych eksperymentów jest ograniczony przez typowe problemy z fotoblaknięciem i fototoksycznością.
B. Mikroskopia utrwalonych komórek
- Naczynia z szklanym dnem a zwykłe szkiełka nakrywki: Do utrwalania komórek można użyć każdego z tych elementów. W przypadku użycia zwykłych szkiełek nakrywek, należy umieścić pojedyncze szkiełko nakrywkę pokryte ConA w osobnej szalce 35mm (która nie musi być przeznaczona do hodowli tkanek), dodać 2 mL pożywki, a następnie przenieść komórki poddane RNAi do szalki. Po przytwierdzeniu się komórek do szkiełka nakrywki, należy usunąć pożywkę, krótko przemyć komórki odpowiednim buforem (dobrze sprawdza się PBS) i dodać do szalki utrwalacz (patrz poniżej). Następnie szkiełko nakrywkę można wyjąć z szalki i poddać dalszej obróbce, na przykład poprzez immunobarwienie.
- Utrwalanie: Do utrwalania komórek S2 stosowano różne metody. Najlepsza metoda utrwalania zależy od tego, jak dobrze utrwalacz zachowuje interesujące cechy, nie niszcząc i nie powodując utraty epitopów lub białek znakowanych. Niektóre procedury wymagają etapu ekstrakcji przed utrwalaniem, aby odsłonić epitopy niektórych białek znajdujących się w gęstych lub zwartych strukturach. Ponieważ literatura dotycząca komórek S2 jest dość obszerna, zazwyczaj możliwe jest znalezienie opublikowanej metody optymalnego utrwalania interesującej struktury komórek S2.
- Metanol jest powszechnie stosowanym utrwalaczem. Metanol powinien być zimny (co najmniej -20°C) i bezwodny (do metanolu można dodać sita molekularne [typ 3A] w celu usunięcia wody). Chłodzimy około 300 mL bezwodnego metanolu w przykrytym szklanym zlewce 1L w mroźniku przeciwwybuchowym o temperaturze -20°C. Gdy metanol będzie zimny, wyjmujemy go z mroźnika, szybko usuwamy pożywkę z naczynia z szklanym dnem (lub szalki zawierającej szkiełko nakrywkowe), a następnie gwałtownie zanurzamy naczynie w metanolu i pozostawiamy w nim. Zlewka z metanolem zazwyczaj mieści około tuzina naczyń. Należy pracować szybko i jak najszybciej zwrócić zlewkę (zawierającą naczynia) do mroźnika. Utrwalanie kończy się w ciągu 10-15 min. Następnie wyjmujemy naczynia ze zlewki, wylewamy pozostały w nich metanol i rehydratujemy je, dodając PBS / 0,1% Triton X-100. Są one teraz gotowe do standardowych procedur barwienia.
- Formaldehyd jest innym powszechnie stosowanym utrwalaczem. Używamy 10% formaldehydu w buforze (PBS jest dopuszczalny, ale należy użyć buforu najbardziej odpowiedniego do własnych potrzeb). Stosujemy to stosunkowo wysokie stężenie formaldehydu, ponieważ komórki S2 nie posiadają cytoplazmatycznych filamentów pośrednich, które w przeciwnym razie pomagałyby utrzymać morfologię i organizację komórki podczas procesu utrwalania.
- Wylewamy utrwalacz do zlewki z odpadami i przemywamy utrwalone komórki trzykrotnie, krótko, za pomocą PBST (PBS + 0,1% TritonX-100).
- Następnie dodajemy do komórek 1ml roztworu blokującego na 15 minut. Rutynowo stosujemy 5% normalne surowicę kozią w PBST.
- Wylewamy roztwór blokujący i dodajemy przeciwciało pierwszorzędowe (rozcieńczone w roztworze blokującym) bezpośrednio na komórki. 100 μl roztworu przeciwciał powinno całkowicie pokryć komórki. Nakładamy ponownie pokrywkę Petriego na szalkę, aby zapobiec odparowaniu roztworu przeciwciał. Pozostawiamy przeciwciała do inkubacji z komórkami przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Usuwamy roztwór przeciwciał i wykonujemy trzy przemycia PBST. Używając pipety transferowej, dodajemy do szalki 2 ml PBST. Odczekujemy 5 minut między każdym przemyciem (nie ma potrzeby obracania szalki).
- Wylewamy ostatnią porcję przemycia i dodajemy 100 μl przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczonego w roztworze blokującym) bezpośrednio na komórki. Nakładamy ponownie pokrywkę Petriego na szalkę, aby zapobiec odparowaniu roztworu przeciwciał. Pozostawiamy przeciwciała do inkubacji z komórkami przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Usuwamy przeciwciało drugorzędowe i wykonujemy trzy 5-minutowe przemycia PBST. Po wylaniu ostatniego przemycia, dodajemy kilka kropli wybranego medium montażowego bezpośrednio na komórki. Stosujemy 0,1 M galian propylu rozpuszczony w roztworze glicerolu:PBS (9:1) i przechowywany w temperaturze -20°C. Zakładamy pokrywkę Petriego i przechowujemy szalkę w ciemności.
3. Ograniczenia/problemy
Jak w przypadku każdego systemu eksperymentalnego, stosowanie komórek S2 wiąże się z pewnymi ograniczeniami. Po pierwsze, hodowlane komórki S2 zazwyczaj wykazują niski indeks mitotyczny (około 1% w pożywkach bezsurowiczych), podczas gdy indeksy mitotyczne dla wielu transformowanych linii komórkowych ssaków są nawet 10 razy wyższe. W związku z tym, w badaniach nad fenotypami mitotycznymi, hodowle komórek S2 wymagają dłuższych poszukiwań w celu znalezienia komórek na odpowiednim etapie mitozy. Po drugie, w badaniach cyklu komórkowego traktowanie lekami jest bardzo skuteczne w zatrzymywaniu komórek S2 w określonych fazach cyklu. Jednak związki, które wykazują odwracalne działanie zatrzymujące cykl komórkowy w hodowlanych komórkach ssaków, nie są łatwo usuwane z komórek S2 poprzez wypłukiwanie. W konsekwencji nie opracowano protokołów synchronizacji proliferujących komórek S2. Po trzecie, komórki S2 nie wykazują zdolności do migracji ani cech nabłonkowych.
4. Oczekiwane wyniki
Największą zaletą komórek S2 jest ich użyteczność jako systemu modelowego. Są one szczególnie przydatne do oceny funkcji komórkowych badanego białka: komórki S2 poddaje się działaniu RNAi przy użyciu dsRNA, które można łatwo (i stosunkowo tanio) zsyntezować w laboratorium, a ponadto świetnie nadają się do analizy żywych komórek oraz do immunofluorescencji komórek utrwalonych. Dodatkową kluczową korzyścią z wykorzystania komórek S2 jest łatwość ich utrzymania w laboratorium przy użyciu stosunkowo taniego medium beztaliowego oraz bez konieczności stosowania inkubatora do hodowli tkanek.
Typowy eksperyment polegałby na wysianiu komórek S2 w odpowiednim naczyniu do hodowli tkanek (np. na płytce 6- lub 96-dołkowej), dodaniu do dołków własnoręcznie przygotowanego dsRNA, a następnie utrzymywaniu kultur w czasie, gdy docelowe białka są stopniowo usuwane w wyniku RNAi. W zależności od usuwanych białek docelowych, komórki mogą wykazywać zmiany morfologiczne i/lub behawioralne w wyniku wyciszenia białka docelowego. Czas wymagany do zredukowania ekspresji białka docelowego do minimum jest specyficzny dla danego białka i powinien zostać określony za pomocą techniki Western blotting.
Zazwyczaj komórki S2 nie przylegają ściśle do plastiku lub szkła, co stanowiłoby problem w eksperymentach wymagających badania mikroskopowego potraktowanych komórek. Jednakże można wywołać rozplaszczenie komórek S2 poprzez ich wysianie na powierzchnię pokrytą lektyną, konkanawaliną A (ConA). W ciągu godziny od wysiania na ConA większość komórek traci swój zaokrąglony wygląd w wyniku rozprzestrzeniania się na powierzchni ConA (Rycina 1). Komórki są teraz gotowe do dalszej obróbki (np. poprzez fiksację i immunostaining) lub do mikroskopowej obserwacji żywych komórek.
Komórki S2 można również transfekować (wykorzystując różne odczynniki chemiczne lub elektroporację), aby uzyskać przejściową ekspresję egzogennego genu lub trwale włączyć gen do genomu (tworząc w ten sposób linię komórkową, która zachowuje gen egzogenny podczas wielokrotnych podziałów). Transfekcje mogą służyć wielu celom, takim jak ekspresja białek znakowanych fluorescencyjnie, które wyznaczają interesujące struktury w komórkach utrwalonych lub żywych (Rysunek 2), lub są wykorzystywane jako przynęta w eksperymentach in vivo pull-down lub immunoprecypitacji itp.
Metoda analizy zależy oczywiście od pytania biologicznego, na które ma odpowiedzieć eksperyment. Powszechną metodą analizy komórek S2 poddanych RNAi jest immunofluorescencja utrwalonych komórek (Rycina 3). Na przykład immunofluorescencję stosuje się zazwyczaj w badaniach przesiewowych całego genomu bibliotek genów Drosophila, aby szybko zidentyfikować białka o interesującej aktywności in vivo. Analizę można rozszerzyć poprzez jednoczesne wyciszenie wielu białek docelowych w komórkach S2 w celu zbadania potencjalnych interakcji funkcjonalnych między tymi białkami. Analizę można również przeprowadzić na żywych komórkach, aby zaobserwować wpływ RNAi na procesy dynamiczne. Ponownie, komórki S2 są szczególnie odpowiednie do tego rodzaju analizy, ponieważ można je wysiać na szalkach z dna szklanego pokrytego ConA i obserwować przez wiele godzin za pomocą mikroskopu odwróconego bez konieczności stosowania komory inkubacyjnej.
Rycina 1. Obrazy w kontraście fazowym (powiększenie 20x) komórek S2 po wysianiu na szkiełko z dnem szklanym pokryte konkanawalną A. Liczby wskazują minuty po wysianiu. Zauważalny jest fakt, że komórki stają się ciemne w kontraście fazowym w miarę spłaszczania się na pokrytym szkiełku. Spłaszczanie się komórek jest widoczne do 15 min (strzałki) i jest w zasadzie zakończone do 60 min. Panel prawy: Powiększony obraz przytwierdzonych komórek; ich rozszerzone i spłaszczone krawędzie są wyraźnie widoczne (grot strzałki). Pasek skali (dla czterech lewych paneli), 20 μm.
Rysunek 2. Komórki S2 przejściowo transfektowane konstruktem fuzyjnym składającym się z nukleofosminy (marker jądra komórkowego) połączonej z fluoroforem eGFP (zielony). Komórki te wysiano na szklaną płytkę z dnem powleczonym ConA, a następnie obrazowano za pomocą DIC i epifluorescencji. Pasek skali, 15 μm.
Rycina 3. Utrwalone komórki S2 poddane immunostynacji na PLP (zielony; marker centriol), mikrotubule (czerwony) oraz barwione Hoechst (niebieski) w celu uwidocznienia chromosomów. Przed utrwaleniem i immunostynacją komórki poddano 4-dniowej inkubacji z kontrolnym RNAi lub RNAi w celu wyciszenia Ncd, białka podobnego do kinezyny, które promuje „ogniskowanie” biegunów wrzeciona4. Zwróć uwagę na rozczłonkowane bieguny wrzeciona i zdezorganizowane wrzeciona w komórkach traktowanych Ncd RNAi. Pasek skali, 2.5 μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W dziedzinie biologii komórki idealny system powinien być tani w utrzymaniu, łatwy w manipulacji i podatny na zastosowanie różnych technik. Komórki S2 Drosophila spełniają te wymagania, dlatego szybko stały się preferowanym systemem dla coraz większej liczby laboratoriów biologii komórki.
Przedstawiliśmy krótki przegląd metod przygotowania komórek S2 do mikroskopii. Wyjątkową zaletą komórek S2 jest fakt, że dobrze rosną w normalnej atmosferze i temperaturze pokojowej; dzięki temu mog...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była częściowo finansowana przez National Cancer Institute P30 CA23074, American Cancer Society Institutional Research Grant 74-001-31 oraz Univ. of Arizona GI SPORE (NCI/NIH CA9506O).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komórki S2 | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ |
| Komórki S2 | DGRC | numer seryjny 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ |
| Komórki S2 | Invitrogen | R690-07 | |
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | podłoże bezsurowicze |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30278 | podłoże bezsurowicze |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | podłoże bezsurowicze |
| Podłoże Schneider’s S2 | Invitrogen | 11720-034 | Dodać 10% (stężenie końcowe) inaktywowanego termicznie FBS, aby przygotować podłoże kompletne. |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Invitrogen | 10438026 | inaktywowana termicznie |
| 100x roztwór antybiotyków | MP Biomedicals | 91674049 | zawiera penicylinę (10000 U/mL), streptomycynę (10000 μg/mL) oraz amfoterycynę B (25 μg/mL) |
| Konkanawalina A | MP Biomedicals | 195283 | |
| Formaldehyd | Electron Microscopy Sciences | 15714 | roztwór 32% |
| Metanol | Mallinckrodt Baker Inc. | 9049 | bezwodny, stopień czystości ACS |
| Sita molekularne | Acros Organics | 19724 | typ 3A |
Bibliografia
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
