Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Podsumowanie

Ksenoprzeszczepy ludzkich guzów mózgu zmodyfikowane lucyferazą mogą być tworzone wewnątrzczaszkowo u myszy atymicznych, z późniejszym monitorowaniem wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W połączeniu z analizą przeżywalności, monitorowanie bioluminescencyjne stanowi niezbędne narzędzie badawcze w badaniach przedklinicznych terapii rozważanych w leczeniu guzów mózgu.

Streszczenie

Modele transplantacyjne z wykorzystaniem ludzkich komórek guzów mózgu pełnią od wielu lat kluczową funkcję w badaniach nad neuroonkologią. W przeszłości najczęściej stosowaną procedurą tworzenia ludzkich ksenograftów nowotworowych było pobieranie komórek z kolb hodowlanych, a następnie podskórne wstrzykiwanie zebranych komórek myszom z niedoborem odporności. Choć podejście to wciąż jest często stosowane w wielu laboratoriach, w ciągu ostatniej dekady nastąpiła istotna zmiana akcentów w kierunku tworzenia ksenograftów ortotopowych, co w przypadku guzów mózgu wymaga wstrzyknięcia komórek nowotworowych do odpowiednich struktur neuroanatomicznych. Ponieważ tworzenie ksenograftów wewnątrzczaszkowych uniemożliwia monitorowanie wzrostu guza poprzez bezpośredni pomiar, na przykład za pomocą suwmiarki, zmiana podejścia na rzecz ortotopowych modeli ksenograftów guzów mózgu wymusiła zastosowanie obrazowania nieinwazyjnego do oceny masy guza u zwierząt gospodarzy. spośród obecnie dostępnych metod obrazowania, monitorowanie bioluminescencyjne jest powszechnie uważane za oferujące najlepsze połączenie czułości, szybkości i kosztów. W niniejszym materiale zaprezentujemy procedury tworzenia ortotopowych guzów mózgu oraz monitorowania wzrostu nowotworu i odpowiedzi na leczenie podczas testowania terapii eksperymentalnych.

Protokół

1. Przygotowanie komórek nowotworowych.

Komórki do ksenoprzeszczepów guzów mózgu człowieka można pozyskać albo z guzów propagowanych jako wzrosty podskórne u myszy atypicznych, albo z hodowli komórkowych. Poniżej omówiono wykorzystanie obu źródeł komórek wraz z demonstracją metody implantacji komórek.

Aby przygotować komórki z guzów podskórnych do przeniesienia do przestrzeni wewnątrzczaszkowej, wycięte guzy z boku ciała umieszcza się w naczyniach hodowlanych, gdzie tkankę początkowo rozdrabnia się skalpelem, a następnie rozbija mechanicznie poprzez wielokrotne pipetowanie w celu utworzenia zawiesiny agregatów komórkowych¹. Zawiesinę agregatów komórkowych przepuszcza się następnie przez filtr z nylonowej siatki o oczkach 70 μM, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek odpowiednią do wstrzyknięcia do czaszki. Zawiesinę komórkową wiruje się z prędkością 10 rpm przez 10 minut w temperaturze 4°C, a następnie odsysa się supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu komórkowego w odpowiedniej objętości medium bezsurowiczego w celu uzyskania końcowego stężenia roboczego (patrz poniżej). W przypadku przygotowania ustalonych linii komórkowych do implantacji wewnątrzczaszkowej, komórki pozyskuje się poprzez trypsynizację monowarstw lub poprzez zbieranie kultur zawiesin neurosfer, a następnie wirując i resuspendując komórki zgodnie z powyższym opisem ². Liczba wstrzykiwanych komórek jest zmienna i zależy od neuroanatomicznego miejsca wstrzyknięcia. W przypadku wstrzyknięć nadnamiotowych rutynowo wstrzykujemy 3-5 x 10⁵ komórek w 3 μL medium bezsurowiczego (DMEM), natomiast w przypadku wstrzyknięć do pnia mózgu ³ wstrzykuje się już tylko 5 x 10⁴ komórek w 0,5 μL. Wstrzyknięcie objętości większych niż zalecane może doprowadzić do refluksu komórek nowotworowych przez kanał igły, co skutkuje egzofitycznym (Rysunek 1), a nie wewnątrzczaszkowym wzrostem guza. Po pobraniu próbki do wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego, pozostałą zawiesinę komórkową należy umieścić w lodzie, często mieszając zawartość, aby utrzymać odpowiednie stężenie podczas kończenia procesu wszczepiania guzów u kolejnych osobników w serii wstrzyknięć.

2. Implantacja komórek nowotworowych

Uwaga: wszystkie poniższe procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Use and Care Committee) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco.

1. Obszar chirurgiczny należy przygotować, spryskując wszystkie powierzchnie środkiem dezynfekcyjnym, takim jak 2% roztwór chlorheksydyny. Po zastosowaniu środka dezynfekcyjnego w obszarze chirurgicznym należy umieścić następujące materiały:
   • Mata grzewcza w celu utrzymania temperatury ciała myszy
   • Dwie małe płytki Petriego; jedna zawierająca 3% nadtlenek wodoru, a druga 2% chlorheksydynę
   • Sterylna gaza i patyczki higieniczne
   • Sterylne jednorazowe skalpele
   • Autoklawowany zszywacz chirurgiczny
2. Do znieczulenia należy użyć środka podawanego w zastrzyku; zazwyczaj jest to mieszanina ketaminy i ksylazyny.
3. Po znieczuleniu myszy skórę głowy przygotowuje się, przecierając ją kilkakrotnie kawałkiem sterylnej gazy nasączonej roztworem chlorheksydyny. Należy zastosować maść do oczu, aby utrzymać odpowiednią wilgotność podczas zabiegu. Za pomocą sterylnego skalpela wykonuje się nacięcie strzałkowe nad kością ciemieniowo-potyliczną o długości około 1 cm. Odsłoniętą powierzchnię czaszki oczyszcza się następnie patyczkiem higienicznym nasączonym 3% roztworem nadtlenku wodoru. Na tym etapie widoczna powinna być bregma (patrz wideo).
4. Współrzędne wstrzykiwania komórek nowotworowych różnią się w zależności od pożądanego miejsca powstawania guza. Poniżej przedstawiono procedurę, której używamy do wewnątrzczaszkowego wywoływania nowotworu² w lokalizacji neuroanatomicznej, w której u wielu pacjentów z guzami mózgu rozwija się nowotwór. Inne lokalizacje istotne w badaniach nad guzami mózgu obejmują most, do modelowania anatomicznego guzów pnia mózgu³, oraz wstrzyknięcia podtwardówkowe do modelowania lokalizacji guzów oponowych⁴. Przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych należy użyć sterylnej igły 25 G, aby nakłuć czaszkę 2 mm na prawo od bregmy i 1 mm przed szwem czołowym, tworząc w ten sposób otwór do wstrzyknięcia komórek nowotworowych (patrz wideo). Procedura ta sprawdza się zarówno u myszy, jak i szczurów (igła 2 G dla szczurów).
5. Przed nabraniem komórek do strzykawki należy wymieszać zawiesinę komórkową, opukując naczynie palcem. Należy napełnić strzykawkę pożądaną ilością zawiesiny komórkowej, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Zewnętrzna część strzykawki powinna zostać oczyszczona za pomocą gazika z alkoholem, aby usunąć z powierzchni wszelkie przylegające komórki, co zapobiegnie powstawaniu i wzrostowi guzów poza czaszką (Rysunek 1A). Aby zapewnić odpowiednią głębokość wstrzyknięcia, należy użyć skalpela do odcięcia 3 mm z ostrego końca końcówki do pipety P20. Ten fragment końcówki można nasunąć na strzykawkę, co ograniczy głębokość wstrzyknięcia i dodatkowo zapewni, że końcówka igły strzykawki znajdzie się 3 mm od strony spodniej czaszki. Należy ustawić strzykawkę prostopadle do czaszki w uprzednio wykonanym otworze i powoli wstrzyknąć zawiesinę komórkową (zawiesinę o objętości 3 µL należy wstrzykiwać w ciągu 1 minuty). Nieprawidłowy kąt włożenia strzykawki może doprowadzić do wstrzyknięcia komórek do komór mózgu i następującego po tym rozsiewu do rdzenia kręgowego (Rys. 1B: Prawa strona). Po zakończeniu wstrzykiwania należy pozostawić igłę w miejscu przez kolejną minutę, a następnie powoli ją wycofać (patrz wideo): kroki te pomogą zmniejszyć cofanie się komórek nowotworowych.
6. Jako alternatywę dla podejścia bez wspomagania lub „z wolnej ręki” do wewnątrzczaszkowej implantacji komórek nowotworowych⁵, można zastosować stereotaktyczną ramę dla małych zwierząt (panel F na schemacie przekrojowym), co zazwyczaj sprzyja bardziej spójnej lokalizacji wstrzyknięcia, ale kosztem znacznego wydłużenia czasu procedury. W naszym doświadczeniu dwóch pracowników chirurgicznych może wstrzyknąć do 60 myszy na godzinę przy zastosowaniu metody z wolnej ręki, podczas gdy maksymalne tempo wstrzykiwania przy użyciu ramy stereotaktycznej dla małych zwierząt wynosi około 15 myszy na godzinę. Sprawność procedury jest ważnym elementem przy wstrzykiwaniu dużych serii myszy i pomaga skrócić czas, przez który komórki nowotworowe przeznaczone do wstrzyknięcia pozostają w lodzie.
7. Czaszkę należy oczyścić 3% nadtlenkiem wodoru i osuszyć sterylnym suchym patyczkiem higienicznym. W otwór należy wprowadzić sterylny wosk kostny. Za pomocą pęsety należy zbliżyć brzegi skóry głowy nad czaszką i zamknąć ranę zszywaczem. Dla optymalnego gojenia skóra głowy powinna zostać zszyta tak, aby warstwy skóry właściwej z każdej strony stykały się ze sobą (spodem do spodu). Zszytą skórę głowy należy oczyścić roztworem chlorheksydyny, a następnie podać buprenorfinę w zastrzyku podskórnym w celu pooperacyjnego uśmierzenia bólu.
8. Wszystkie myszy należy monitorować po operacji aż do momentu, gdy odzyskają zdolność poruszania się i normalną aktywność. Zazwyczaj czas rekonwalescencji wynosi około 30 minut.

3. Monitorowanie wzrostu guza za pomocą bioluminescencji

1. Wstęp. Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) opiera się na utlenianiu lucyferyny [kwas d-(-)-2-(60-hydroksy-20-benzotiazolyl)-tiazon-4-karboksylowy] w obecności tlenu i trifosforanu adenozyny (ATP). Reakcja ta jest katalizowana przez enzym lucyferazę, która przekształca energię chemiczną w fotony, co skutkuje emisją światła. Komórki ludzkie mogą zostać zmodyfikowane tak, aby ekspresowały lucyferazę (patrz poniżej), przy czym tylko komórki ekspresujące lucyferazę są zdolne do emisji światła w obecności substratu, jakim jest lucyferyna. Bioluminescencja tła organizmów gospodarzy poddanych działaniu lucyferyny jest minimalna, co zapewnia bardzo korzystny stosunek sygnału do szumu podczas detekcji emisji luminescencji z komórek nowotworowych zmodyfikowanych lucyferazą, umożliwiając wysokoczułe monitorowanie wzrostu guza i odpowiedzi na terapię in vivo. Ponadto wykazano, że lucyferaza i jej substrat, lucyferyna, nie są toksyczne dla komórek ssaków, a nie zaobserwowano różnic funkcjonalnych między komórkami ekspresującymi lucyferazę a odpowiadającymi im komórkami niemodyfikowanymi. Lucyferyna łatwo przenika przez błony komórkowe i barierę krew-mózg po wstrzyknięciu doszpikowym (i.p.) lub dożylnym (i.v.) u myszy, co pozwala na obrazowanie każdego przedziału zawierającego komórki zmodyfikowane lucyferazą. Poziom emisji fotonów i widmo emitowanego światła z komórek zmodyfikowanych lucyferazą są wystarczające, aby przeniknąć przez tkanki małych zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy i szczury, i mogą być wykrywane zewnętrznie za pomocą kamer do obrazowania słabego światła. Nieinwazyjny charakter obrazowania bioluminescencyjnego pozwala na wielokrotne monitorowanie wzrostu guza i odpowiedzi na terapię u poszczególnych osobników zwierząt.
2. Implantowane źródła komórek powinny być stabilnie zmodyfikowane pod kątem ekspresji lucyferazy świetlikowej. Takie źródła komórek można zakupić lub wytworzyć w poszczególnych laboratoriach przy użyciu lentiwirusów skonstruowanych do konstytutywnej ekspresji lucyferazy. Zdecydowanie zalecamy stosowanie komórek zmodyfikowanych lentiwirusem kodującym lucyferazę, a nie plazmidem, aby zapewnić stabilną komórkową ekspresję lucyferazy in vivo, co jest niezbędne do ilościowego obrazowania luminescencji w celu dokładnego wskazania zmian w obciążeniu nowotworowym u poszczególnych osobników zwierząt, które są wielokrotnie obrazowane w trakcie eksperymentu.
3. Monitorowanie BLI. Zalecamy przeprowadzanie ilościowego obrazowania bioluminescencyjnego (qBLI) 1–2 razy w tygodniu, zaczynając tydzień po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Nasze qBLI jest przeprowadzane przy użyciu stacji obrazowania IVIS Lumina (Caliper Life Sciences), a nasze wyniki wskazują, że podobne dane uzyskuje się przy użyciu stacji obrazowania IVIS Lumina, IVIS 150 lub IVIS 20. W ramach przygotowania do obrazowania myszy są jednocześnie znieczulane ketaminą/ksylazyną i otrzymują lucyferynę (sól potasowa D-lucyferyny, 150 mg/kg, Caliper Life Sciences) poprzez wstrzyknięcie doszpikowe, a obrazowanie myszy odbywa się 12 minut po wstrzyknięciu. Farmakokinetyka lucyferyny wskazuje, że czas między podaniem lucyferyny a oznaczeniem luminescencji komórek powinien wynosić od 10 do 15 minut po wstrzyknięciu lucyferyny, aby uzyskać maksymalną emisję luminescencji i największą czułość detekcji. Wybrany czas w przedziale 10–15 minut powinien pozostać stały dla wszystkich obrazowanych zwierząt. Niezwykle ważne jest zachowanie spójności czasu pomiędzy wstrzyknięciem lucyferyny a odczytem BLI. Obszary zainteresowania obejmujące wewnątrzczaszkowy obszar sygnału są definiowane za pomocą oprogramowania Living Image (Rysunek 2), a całkowita liczba fotonów/s/sr/cm2 (fotonów na sekundę na steradian na centymetr kwadratowy) jest rejestrowana (patrz wideo).
4. Analiza danych. Ponieważ wzrost guza i odpowiedź na terapię są monitorowane u poszczególnych zwierząt, zdecydowanie zalecamy grupy terapeutyczne liczące co najmniej 8 osobników, aby zwiększyć pewność statystyczną wniosków dotyczących odpowiedzi nowotworu na terapię lub jej braku. W odniesieniu do prezentacji wyników qBLI, odczyty luminescencji są przeliczane na wartości znormalizowane poprzez podzielenie luminescencji każdej myszy, uzyskanej w trakcie i po zakończeniu schematu terapeutycznego, przez odpowiadający jej maksymalny odczyt luminescencji przed leczeniem^6,7. Do analizy przeżywalności stosuje się estymator Kaplana-Meiera⁸, na podstawie którego generowane są krzywe przeżywalności i wyznaczane mediany czasu przeżycia. Różnice między krzywymi przeżywalności są porównywane za pomocą testu log-rank⁹.
5. Pobieranie mózgu do późniejszej analizy guza leczonego i nieleczonego. Po eutanazji zwierzęcia mózg myszy należy szybko wyciąć (patrz wideo) i umieścić w formalinie w celu późniejszej analizy morfologii guza i immunohistochemii lub zamontować w OCT w celu zamrożenia preparatu.

4. Reprezentatywne wyniki

W przykładzie przedstawionym na rysunku 3A myszy, którym wykonano wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek nowotworowych, monitorowano pod kątem luminescencji wewnątrzczaszkowej do momentu, gdy kolejne średnie wartości luminescencji wskazały na postępujący wzrost guza; w tym czasie rozpoczęto terapię (szara strzałka rozpoczynająca się w 34. dniu: erlotynib podawany codziennie w dawce 150 mg/kg aż do wymaganej eutanazji). Wartości luminescencji dla każdej myszy zostały ustawione na znormalizowaną wartość 1 w momencie rozpoczęcia terapii, a kolejne odczyty luminescencji dla każdej myszy znormalizowano do jej końcowej wartości obrazowania przed leczeniem. Na przykład mysz z końcowym odczytem luminescencji przed leczeniem wynoszącym 2,0 x 10⁷ fotonów/s w 34. dniu, której luminescencja wzrosła do 6,0 x 10⁷ fotonów/s w 38. dniu, miałaby w 38. dniu znormalizowaną wartość luminescencji równą 3,0. Dla każdego punktu czasowego obrazowania wykreślono średnią znormalizowaną bioluminescencję oraz odpowiadający jej błąd standardowy dla grup kontrolnej i leczonej. W tym przykładzie istotna różnica w średniej znormalizowanej luminescencji jest widoczna w pierwszym punkcie czasowym obrazowania po rozpoczęciu terapii (dzień 38), przy czym różnica w średniej luminescencji grup wykazuje dalszy wzrost w kolejnych punktach czasowych. W większości przypadków działanie przeciwnowotworowe terapii, wykazane przez qBLI, wiąże się z odpowiadającą mu istotną różnicą w przeżywalności (t.j. p < 0,05), co ma miejsce również w tym przypadku (rysunek 3B). Panele 3C i 3D przedstawiają sąsiednie przekroje mózgu myszy barwione hematoksyliną i eozyną oraz przeciwciałem anty-EGFR, pobrane w momencie eutanazji po umieszczeniu wyciśniętego mózgu w formalinie i późniejszym zatopieniu w parafinie w celu wykonania skrawków.

Rysunek 1. Objawy błędów podczas wstrzykiwania wewnątrzczaszkowego. A) Egzofityczny wzrost guza (poza czaszką) (czerwone koło) może być spowodowany zbyt dużą objętością wstrzykiwanej zawiesiny, pozostałościami zawiesiny komórkowej przyczepionymi do strzykawki lub zbyt szybkim wycofaniem strzykawki po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. B) Wstrzyknięcie komórek nowotworowych do komór mózgu może spowodować rozsiew nowotworu do rdzenia kręgowego (mysz po prawej stronie), w przeciwieństwie do prawidłowo wstrzykniętych komórek nowotworowych, których sygnał pozostaje zlokalizowany w miejscu wstrzyknięcia (mysz po lewej stronie).

Rysunek 2. Obrazy w formie map ciepła przedstawiające intensywność bioluminescencji dla reprezentatywnych myszy z grup kontrolnej (po lewej) i badawczej (po prawej) w eksperymencie oceniającym odpowiedź na terapię. Oprogramowanie Living Image można skonfigurować tak, aby automatycznie definiowało obszary zainteresowania (czerwone okręgi), lub operator urządzenia może zdefiniować obszary zainteresowania ręcznie. W przypadku wykorzystania takich obrazów do przygotowania ryciny zaleca się, aby operator urządzenia wyświetlał mapy ciepła przy użyciu tego samego zakresu intensywności bioluminescencji (górna część ryciny), co pozwala na wizualne przedstawienie zakresu różnic w bioluminescencji między badanymi zwierzętami.

Rycina 3. Bioluminescencja, przeżywalność oraz analiza tkanki nowotworowej w eksperymencie, w którym widoczna jest odpowiedź terapeutyczna. A) Wykres średnich odczytów bioluminescencji dla myszy z grupy kontrolnej i grupy leczonej, z zaznaczonym błędem standardowym dla każdego punktu obrazowania. B) Wykres przeżywalności dla tych samych myszy; wartość p wyznaczona za pomocą testu log-rank ⁷. C) H&E Barwiony przekrój mózgu myszy z guzem. D) Przekrój barwiony pod kątem EGFR. E i F) Powiększenia zaznaczonych obszarów odpowiednio z paneli C i D, przy czym panel E wykazuje negatywne barwienie dla białka supresorowego guza PTEN.

Dyskusja

Ustanowienie ortotopowego (wewnątrzczaszkowego) ksenoprzeszczepu guza mózgu zapewnia odpowiednie mikrośrodowisko¹⁰ do modelowania nowotworów OUN w celu przetestowania odpowiedzi terapeutycznej. Ten rodzaj modelowania dostarcza dodatkowo informacji na temat dostępu terapeutycznego do mózgu i guza mózgu, co jest krytycznie ważne dla określenia, czy eksperymentalny środek powinien zostać przekazany do oceny w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów. Ponieważ wielkość wewnątrzczaszkowego ksenoprzeszczepu guza nie może być mierzona bezpośrednio, na przykład za pomocą suwmiarki, podłużne monitorowanie wzrostu guza wewnątrzczaszkowego i odpowiedzi na terapię wymaga obrazowania nieinwazyjnego; nasze doświadczenie wskazuje na obrazowanie bioluminescencyjne jako najbardziej praktyczne podejście w eksperymentach, których głównym celem jest ocena zakresu odpowiedzi guza na terapię. Gdy wyniki obrazowania bioluminescencyjnego zostaną połączone z analizą przeżywalności zwierząt, te dwa zestawy danych stanowią potężne i niezawodne podejście do oceny skuteczności eksperymentalnej terapii.

Na koniec, niezwykle ważne jest, aby ksenoprzeszczepy guzów mózgu wewnątrzczaszkowych pobierać od uśpionych zwierząt w celu oceny morfologicznych i molekularnych efektów terapii; w tym celu zaleca się całkowitą resekcję mózgu w momencie eutanazji, z zachowaniem wyciętego organu do dalszych analiz.

Podczas gdy poprzednia prezentacja odnosiła się konkretnie do badań nad guzami mózgu, przedstawione koncepcje można z pewnością uogólnić na inne nowotwory u ludzi, które nadają się do modelowania ortotopowego u gryzoni.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Skalpele jednorazowe	Feather Safety Razor Co, Ltd.	2975	Nr 21
Podkładka grzewcza	Dunlap	HP950
Gaza	Fisher Scientific	22028563
Patyczki bawełniane	Fisher Scientific	23-400-100
2% chlorheksydyna	Fisher Scientific	NC975695
3% nadtlenek wodoru	Fisher Scientific	H312P-4
Igła 25G	BD Biosciences	305122
mikrostrzykawka Hamilton Sharp 10 µl	Hamilton Co	20734
Zszywacz skórny i zszywki	Stoelting Co.	59020
Steryotaksyczny stelaż	Stoelting Co.	51725
Oprogramowanie Living Image	Caliper Life Sciences
D-lucyferyna	Biotechnologia złota	LUCK-1G	Sól potasu
Xenogen Lumina	Caliper Life Sciences