Wizualizacja elektrofuzyjnej fuzji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Podsumowanie

W niniejszym filmie prezentujemy efektywną elektrofuzję komórek in vitro za pomocą zmodyfikowanej metody adhezyjnej z wykorzystaniem elektroporacji oraz późniejszą detekcję i wizualizację sfuzowanych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Elektrofuzja komórek jest bezpieczną, niewirusową i niechemiczną metodą, która może być stosowana do przygotowywania komórek hybrydalnych do terapii ludzi. Elektrofuzja polega na przyłożeniu krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu do komórek znajdujących się w bliskim kontakcie. Zastosowanie krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu powoduje destabilizację błon plazmatycznych komórek. Zdestabilizowane błony stają się bardziej przepuszczalne dla różnych cząsteczek, a także bardziej podatne na fuzję z sąsiednimi, zdestabilizowanymi błonami. Elektrofuzja jest zatem wygodną metodą umożliwiającą niespecyficzną fuzję bardzo różnych typów komórek.in vitroAby uzyskać fuzję, błony komórkowe, zdestabilizowane przez pole elektryczne, muszą znajdować się w bliskim kontakcie, co umożliwia połączenie ich dwuwarstw lipidowych, a w konsekwencji ich cytoplazmy. W tym filmie prezentujemy efektywną elektrofuzję komórekin vitroza pomocą zmodyfikowanej metody adhezyjnej. W tej metodzie komórkom pozwala się jedynie na słabsze przytwierdzenie do powierzchni dołka, tak aby możliwe było wymienienie medium przy jednoczesnym zachowaniu przez komórki ich sferycznego kształtu. Wizualizację fuzji ocenia się poprzez wstępne znakowanie cytoplazmy komórek różnymi fluorescencyjnymi barwnikami typu cell tracker; połowę komórek znakuje się pomarańczowym CMRA, a drugą połowę zielonym CMFDA. Wydajność fuzji określa się jako liczbę komórek dwubarwnych podzieloną przez całkowitą liczbę komórek i pomnożoną przez dwa.

Protokół

I. Obciążanie komórek markerami komórkowymi CMFDA i CMRA

1. Doświadczenia przeprowadzono na wcześniej przygotowanych komórkach linii czerniaka mysiego (B16-F1). Komórki hodowano w dwóch oddzielnych kolbach hodowlanych o powierzchni 25 cm² (TPP, ZDA) do osiągnięcia 70-80 % konfluencji w pożywce DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) uzupełnionej o 10 % płodowej surowicy bydlęcej, 0,15 mg/ml L-glutaminy, 16 mg/ml gentamycyny (wszystkie od Sigma-Aldrich, Niemcy) oraz 20 jednostek/ml krystacyliny (Pliva, Chorwacja), inkubując je w 5% CO₂ w temperaturze 37°C.
2. Przygotować dwa roztwory stokowe Cell trackers (Invitrogen, USA) o stężeniu 10 mM, dodając 10,76 μl oraz 9 μl (odpowiednio dla Green CMFDA i Orange CMRA) DMSO (Sigma-Aldrich, Niemcy) do 50 μg barwnika w oryginalnej fiolce Invitrogen. Roztwór stokowy można przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C przez kilka miesięcy. Przed rozpoczęciem doświadczeń należy ogrzać roztwór do czasu rozpuszczenia kryształów DMSO.
3. Przygotować bezwęglanowy bufor Krebsa-Hepesa (130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO₄, 1,2 mM KH₂PO₄, 11,7 mM D-glukozy, 1,3 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, pH 7,4). W dwóch probówkach Eppendorf o pojemności 15 ml oddzielnie zmieszać 2,1 μl każdego roztworu stokowego (odpowiednio 10 mM CMFDA lub CMRA) w 3 ml bezwęglanowego buforu Krebsa-Hepesa. W ten sposób otrzymuje się „roztwór ładujący” zawierający około 7 μM CMFDA (lub CMRA).
4. Przepłukać komórki dwukrotnie bezwęglanowym buforem Krebsa-Hepesa, a następnie wprowadzić roztwory ładujące do kolb. Inkubować komórki przez 30 minut w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Podczas tej pierwszej inkubacji odczynniki swobodnie przenikają przez błony komórkowe, lecz po dostaniu się do wnętrza komórki są przekształcane w nieprzenikające przez błony fluorescencyjne produkty reakcji.
5. Po pierwszej inkubacji przepłukać komórki i inkubować je w pożywce hodowlanej przez kolejne dwie godziny w 5% CO₂ w temperaturze 37°C.
6. Ztrypsynizować komórki w obu kolbach (załadowane CMFDA i CMRA) i zmieszać komórki czerwone i zielone w stosunku 1:1 w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (TPP, ZDA). Dostosować stężenie komórek do 5 x 10⁶ komórek/ml poprzez rozcieńczenie pożywką DMEM lub zagęszczenie za pomocą wirówki. Nanieść kroplę 20 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 24-dołkowej (TPP, ZDA). Inkubować komórki w 5 % CO₂ w temperaturze 37 °C przez 20 min, aby pozwolić im lekko przytwierdzić się do powierzchni dołka i nawiązać kontakty międzykomórkowe.

II. Elektrofuzyjna

1. Przygotować izoosmolarny bufor fosforanowo-potasowy (10 mM KH2PO4, 10 mM K₂HPO₄, 1mM MgCl₂, 250 mM sacharozy) oraz hipoosmolarny bufor fosforanowo-potasowy (10 mM KH2PO4, 10 mM K₂HPO₄, 1mM MgCl₂, 75 mM sacharozy).
2. Umieścić wielodołek z komórkami na stole mikroskopu, wypozycjonować elektrody na dnie dołka i podłączyć je do generatora impulsów.
3. Przemyć komórki 1 ml izoosmolarnego buforu fosforanowo-potasowego. Dodać 350 μl hipoosmolarnego buforu fosforanowo-potasowego w celu wywołania pęcznienia komórek. Bufor powinien zakrywać elektrody.
4. Pozostawić komórki w buforze hipoosmolarnym przez 2 minuty przed zastosowaniem impulsów elektrycznych. W tym czasie napływ cząsteczek wody do wnętrza komórek, wynikający z niezrównoważenia osmotycznego między wnętrzem a zewnętrzem komórek, powoduje zwiększenie ich objętości. Impulsy elektryczne należy zastosować, gdy komórki osiągną objętość bliską maksymalnej, przed rozpoczęciem regulacyjnego zmniejszenia objętości.
5. Aby uzyskać optymalną elektrofuzję i zachować żywotność komórek, należy zastosować optymalne parametry impulsów elektrycznych. Zależą one od użytej linii komórkowej [1]. W tym doświadczeniu do każdej próbki przyłożono serię 8 impulsów prostokątnych (każdy o czasie trwania 10 μs przy 1 Hz), korzystając z urządzenia do elektroporacji (w naszym przypadku Cliniporator, IGEA, Włochy). Impulsy są dostarczane do dwóch równoległych elektrod z drutu Pt/Ir o średnicy 0,8 mm i odległości 5 mm między nimi, co tworzy pole elektryczne o natężeniu około 1200 V/cm między elektrodami w każdym dołku, z wyjątkiem dołka kontrolnego.
6. Pozostawić komórki w spokoju przez 10 minut po dostarczeniu impulsów. Ustalić wydajność fuzji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i fazokontrastowej.

III. Pozyskiwanie obrazów i wyznaczanie wydajności fuzji

1. Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (w naszym przypadku Zeiss AxioVert 20, Zeiss, Niemcy) wyposażonego w obiektyw (x20) oraz chłodzoną kamerę CCD (VisiCam 1280, Visitron, Niemcy). Obrazy są pozyskiwane przy użyciu oprogramowania MetaMorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA), lecz można zastosować inne podobne oprogramowanie do akwizycji. CMFDA jest wzbudzany monochromatorem (Polychrome IV, Visitron, Niemcy) przy 492 nm, a CMRA przy 548 nm. Fluorescencję CMFDA i CMRA rejestruje się za pomocą dwóch filtrów emisyjnych, jeden wycentrowany na 535 nm (HQ535/30m, dla CMFDA), a drugi na 510 nm (D605/5m, dla CMRA, oba Chroma, USA). Zastosowanie lustra dichroicznego (Q515LP) zapobiega przenikaniu sygnału między kanałami.
2. Należy pozyskać trzy obrazy (kontrast fazowy, fluorescencja czerwona i zielona) dla pięciu losowo wybranych pól w każdej studience. Z każdej tripletu obrazów należy stworzyć obrazy trójkanałowe. Na takim obrazie można zaobserwować fluorescencyjną cytoplazmę wraz z błonami komórkowymi. Dzięki temu można łatwo zidentyfikować zfuzowane komórki [Rysunek 1].
3. Należy policzyć wszystkie trzy typy komórek (czerwone, zielone i podwójnie fluorescencyjne) na każdym obrazie trójkanałowym. Procent komórek podwójnie fluorescencyjnych wyznacza się, dzieląc liczbę komórek podwójnie fluorescencyjnych przez całkowitą liczbę komórek na każdym obrazie. Wydajność fuzji definiuje się jako procent komórek podwójnie fluorescencyjnych pomnożony przez 2, ponieważ połowa zfuzowanych komórek nie jest wykrywana (w przypadku fuzji komórek o tym samym kolorze).

Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Trójkanałowy obraz mikroskopowy komórek B16F1 po elektrofuzyjnym łączeniu: kontrast fazowy, fluorescencja CMRA (wzbudzenie przy 548 nm) oraz fluorescencja CMFDA (wzbudzenie przy 492 nm), powiększenie obiektywu 20x

Dyskusja

Zdolność błon komórkowych do nieswoistej fuzji, np. pod wpływem zewnętrznych pól elektrycznych, jest istotna dla biotechnologii, medycyny i badań biologicznych. Taka nieswoista fuzja umożliwia otrzymywanie niezwykle cennych hybryd komórkowych oraz ich produktów, takich jak przeciwciała monoklonalne, a także dostarcza informacji o fundamentalnych mechanizmach fuzji [2]. Elektrofuzja jest potencjalnie bardzo skuteczną metodą, ponieważ można ją odpowiednio dostosować do różnych typów komórek. Elektrofuzja zachodzi, gdy komórki w bliskim kontakcie fizycznym zostają wprowadzone w stan fusogenny (podatny na fuzję) za pomocą impulsów elektrycznych o wysokim napięciu. Efektywność elektrofuzji zależy od różnych parametrów wpływających na dwie etapy procesu. Pierwszym etapem procesu elektrofuzji jest uzyskanie bliskiego kontaktu fizycznego między komórkami, co można osiągnąć różnymi metodami [3-8]. Metodę adhezyjną (hodowlę komórek do osiągnięcia konfluencji) można stosować efektywnie dzięki spontanicznemu nawiązywaniu kontaktów komórkowych w rozległych strefach między komórkami; prowadzi ona jednak do powstania bardzo dużych fuzowanych komórek z wieloma jądrami. Stosujemy zmodyfikowaną metodę adhezyjną, w której otrzymuje się mniejsze komórki (z 2 do 5 jąder), które mają większą szansę na przeżycie i proliferację (Rycina 1). Kontakt między komórkami jest dodatkowo wspomagany przez osmotyczne pęcznienie komórek, wynikające z zastosowanej w eksperymencie obróbki osmotycznej [9]. Drugim etapem procesu elektrofuzji jest wprowadzenie błon komórkowych w stan fusogenny. Stan fusogenny ściśle koreluje ze stanem elektroprepermeabilizacji błony (komórki stają się nieswoiście przepuszczalne dla cząsteczek, które normalnie nie mogą przenikać przez nienaruszoną błonę) i jest sterowany przez te same parametry impulsów elektrycznych (amplitudę, czas trwania, liczbę i częstotliwość) [10]. Wartości parametrów elektrycznych niezbędne do optymalnej elektroporacji [1] i elektrofuzji różnią się w zależności od rodzaju komórek oraz zależą od ich wielkości i właściwości biologicznych. Parametry elektryczne muszą zatem zostać zoptymalizowane dla różnych linii komórkowych wykorzystywanych jako partnerzy fuzji, aby uzyskać skuteczną fuzję.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CMRA	Odczynnik	Invitrogen	C34551	Cytosolowy barwnik fluorescencyjny
CMFDA	Odczynnik	Invitrogen	C7025	Cytosolowy barwnik fluorescencyjny
DMSO	Odczynnik	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM	Odczynnik	Sigma-Aldrich	D5671	Pożywka Eagle modyfikowana przez Dulbecco’’
Płodowa surowica bydlęca	Odczynnik	Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamina	Odczynnik	Sigma-Aldrich	G7513
krystacylina	Odczynnik	Pliva	625110	antybiotyk
gentamycyna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	G1397	antybiotyk
Hepes	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H0887
KH2PO4	Odczynnik	Merck & Co., Inc.	A124873 927
KH2PO4	Odczynnik	Sigma-Aldrich	4248
MgCl2	Odczynnik	Sigma-Aldrich	M-8266
NaCl	Odczynnik	Fluka	71382
KCl	Odczynnik	Merck & Co., Inc.	A154336 908
MgSO4	Odczynnik	Sigma-Aldrich	M2643
D-glukoza	Odczynnik	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Odczynnik	Sigma-Aldrich	C4901
sukroza	Odczynnik	Sigma-Aldrich	16104
Generator impulsów elektrycznych	Narzędzie	IGEA		Cliniporator VITAE
Płytka wielodołkowa	Narzędzie	Techno Plastic Products	92424
Probetka wirówkowa 50 ml	Narzędzie	Techno Plastic Products	91050
Probetka wirówkowa 15 ml	Narzędzie	Techno Plastic Products	91015
Kolba hodowlana 25 cm2	Narzędzie	Techno Plastic Products	90026
Elektrody	Narzędzie	Wykonane na zamówienie		Pt/Ir