Elektrooporyzacja komórek uwidoczniona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Summary

W tym filmie demonstrujemy efektywną elektrofuzję komórek in vitro za pomocą zmodyfikowanej metody adherencji z wykorzystaniem elektroporacji i późniejszej wizualizacji zrośniętych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Abstract

Elektrooporowość komórek jest bezpieczną, niewirusową i niechemiczną metodą, która może być stosowana do przygotowania komórek hybrydowych do terapii u ludzi. Elektrooporowość polega na zastosowaniu krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu do ogniw, które są w bliskim kontakcie. Zastosowanie krótkich, wysokonapięciowych impulsów elektrycznych powoduje destabilizację błon plazmatycznych komórek. Zdestabilizowane membrany są bardziej przepuszczalne dla różnych cząsteczek, a także podatne na fuzję z sąsiednimi zdestabilizowanymi membranami. Elektrooporyzacja jest zatem wygodną metodą uzyskania niespecyficznego zespolenia bardzo różnych komórek in vitro. Aby uzyskać fuzję, błony komórkowe, zdestabilizowane przez pole elektryczne, muszą być w bliskim kontakcie, aby umożliwić połączenie ich dwuwarstw lipidowych, a w konsekwencji ich cytoplazmy. W tym filmie pokazujemy skuteczne elektrooporowanie komórek in vitro za pomocą zmodyfikowanej metody adherencji. W tej metodzie komórki mogą przyczepiać się tylko nieznacznie do powierzchni studzienki, dzięki czemu można wymieniać podłoże, a komórki nadal zachowują swój kulisty kształt. Wizualizację fuzji ocenia się poprzez wstępne znakowanie cytoplazmy komórek różnymi fluorescencyjnymi barwnikami śledzącymi komórki; połowa komórek jest oznaczona pomarańczowym CMRA, a druga połowa zielonym CMFDA. Wydajność fuzji określa się jako liczbę komórek dwufluorescencyjnych podzieloną przez liczbę wszystkich komórek pomnożoną przez dwa.

Protocol

I. Wczytywanie komórek za pomocą modułów śledzących komórki CMFDA i CMRA

1. Doświadczenia przeprowadzono na wcześniej przygotowanych komórkach mysiej linii komórkowej czerniaka (B16-F1). Komórki hoduje się w dwóch oddzielnych kolbach hodowlanych o średnicy 25^cm2 (TPP, ZDA) do 70-80% konfluencji w pożywce hodowlanej DMEM (zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 0,15 mg/ml L-glutaminy, 16 mg/ml gentamycyny (wszystkie z Sigma-Aldrich, Niemcy), 200 jednostek/ml krystycyliny (Pliva, Chorwacja) i inkubuje w 5% CO₂ w temperaturze 37°C.
2. Przygotować dwa 10 mM roztwory podstawowe trackerów komórkowych (Invitrogen, USA), dodając 10,76 μl i 9 μl (odpowiednio dla Green CMFDA i Orange CMRA) DMSO (Sigma-Aldrich, Niemcy) do 50 μg barwnika w oryginalnej fiolce Invitrogen. Roztwór podstawowy można przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C przez kilka miesięcy. Przed rozpoczęciem eksperymentów należy podgrzać roztwór, aż kryształy DMSO się rozpuszczą.
3. Przygotować bezwodorowęglanowy bufor Krebsa-Hepesa (130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM_MgSO4 , 1,2 mM KH₂PO₄, 11,7 mM D-glukozy, 1,3 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, pH 7,4). W dwóch probówkach Eppendorfa o pojemności 15 ml oddzielnie wymieszać 2,1 μl każdego roztworu podstawowego (odpowiednio 10 mM CMFDA lub CMRA) w 3 ml wolnego od wodorowęglanów buforu Krebsa-Hepesa. W ten sposób uzyskuje się "roztwór ładujący" zawierający około 7 μM CMFDA (lub CMRA).
4. Przepłukać komórki dwukrotnie bezwęglanowym buforem Krebsa-Hepesa, a następnie wlać roztwory ładujące do kolb. Inkubować komórki przez 30 minut w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Podczas tej pierwszej inkubacji odczynniki swobodnie przechodzą przez błony komórkowe, ale po wejściu do komórki odczynniki są przekształcane w nieprzepuszczalne dla komórek produkty reakcji fluorescencyjnej.
5. Po pierwszej inkubacji przepłukać i inkubować komórki z pożywką hodowlaną przez kolejne dwie godziny w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
6. Trypsynizować komórki w obu kolbach (załadowanych CMFDA i CMRA) i mieszać czerwone i zielone komórki w stosunku 1:1 w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (TPP, ZDA). Dostosować stężenie komórek do 5 x 10⁶ komórek/ml przez rozcieńczenie pożywką DMEM lub przez zagęszczenie za pomocą wirówki. Umieść 20 μl kropli zawiesiny komórek w każdym dołku z 24 płytkami wielodołkowymi (TPP, ZDA). Inkubować komórki w 5 % CO₂ w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby umożliwić im lekkie przyczepienie się do powierzchni studzienki i nawiązanie kontaktu komórkowego.

II. Elektrooporowość

1. Przygotować izoosomolowy bufor fosforanu potasu (10 mM KH2PO4, 10 mM K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 250 mM sacharozy) i hipoosmolarny bufor fosforanu potasu (10 mM KH2PO4, 10 mM K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 75 mM sacharozy).
2. Umieść studzienkę z komórkami na stoliku mikroskopu, umieść elektrody na dnie studzienki i podłącz je do generatora impulsów.
3. Przemyć komórki 1 ml izosomolowego buforu fosforanu potasu. Dodać 350 μl hipoosmolarnego buforu fosforanu potasu w celu wywołania obrzęku komórek. Bufor powinien zakrywać elektrody.
4. Pozostaw komórki w buforze hipoosmolarnym na 2 minuty przed zastosowaniem impulsów elektrycznych. W tym czasie napływ cząsteczek wody do komórek spowodowany brakiem równowagi osmotycznej między wnętrzem a zewnętrzem komórek powoduje wzrost objętości komórek. Impulsy elektryczne powinny być stosowane, gdy ogniwa są bliskie swojej maksymalnej objętości, przed rozpoczęciem regulacyjnego zmniejszania objętości.
5. Aby uzyskać optymalną elektrooporowość i utrzymać żywotność ogniwa, należy stosować optymalne parametry impulsów elektrycznych. Zależą one od użytej linii komórkowej [1]. W tym eksperymencie ciąg 8 prostokątnych impulsów (każdy o czasie trwania 100 μs przy 1 Hz) jest nakładany na każdą próbkę za pomocą urządzenia do elektroporacji (w naszym przypadku Cliniporator, IGEA, Włochy). Impulsy są dostarczane do dwóch równoległych elektrod drutowych Pt/Ir o średnicy 0,8 mm i odległości między nimi 5 mm, tworząc pole elektryczne o napięciu około 1200 V/cm między elektrodami w każdej studzience, z wyjątkiem studzienki kontrolnej.
6. Pozostaw komórki w spokoju przez 10 minut po podaniu impulsu. Określić wydajność fuzji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii z kontrastem fazowym.

III. Akwizycja obrazu i określenie wydajności fuzji

1. Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (w naszym przypadku Zeiss AxioVert 200, Zeiss, Niemcy) wyposażonego w obiektyw (x20) i chłodzoną kamerę CCD (VisiCam 1280, Visitron, Niemcy). Obrazy są pozyskiwane w MetaMorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA), ale można również użyć innego podobnego oprogramowania do akwizycji. CMFDA jest wzbudzana monochromatorem (Polychrome IV, Visitron, Niemcy) przy 492 nm i CMRA przy 548 nm. Fluorescencja CMFDA i CMRA jest uzyskiwana za pomocą dwóch filtrów emisyjnych, jednego wyśrodkowanego na 535 nm (HQ535/30m, dla CMFDA), a drugiego wyśrodkowanego na 510 nm (D605/55m, dla CMRA, oba Chroma, USA). Zastosowanie lustra dichroicznego (Q515LP) zapobiegło przesłuchom kanałów.
2. Uzyskaj trzy obrazy (kontrast fazowy, czerwona i zielona fluorescencja) dla pięciu losowo wybranych pól w każdym dołku. Utwórz trzy obrazy kanałów z każdej trójki obrazów. Na takim obrazie można zobaczyć fluoryzującą cytoplazmę wraz z błonami komórkowymi. W ten sposób można łatwo określić połączone komórki [Rysunek 1].
3. Policz wszystkie trzy typy komórek (czerwone, zielone i podwójnie fluorescencyjne) na każdym trzykanałowym obrazie. Określ procent komórek dwufluorescencyjnych, dzieląc liczbę komórek dwufluorescencyjnych przez liczbę wszystkich komórek na każdym obrazie. Wydajność fuzji definiuje się jako procent komórek dwufluorescencyjnych pomnożony przez 2, ponieważ połowa połączonych komórek nie jest wykrywana (gdy komórki o tym samym kolorze łączą się).

Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Obraz z mikroskopii trójkanałowej komórek B16F1 po elektrooporowaniu: kontrast fazowy, fluorescencja CMRA (wzbudzenie przy 548 nm) i fluorescencja CMFDA (wzbudzenie przy 492 nm), powiększenie obiektywu 20x

Discussion

Zdolność błon komórkowych do niespecyficznego łączenia się, np. przez zewnętrzne pola elektryczne, jest ważna dla biotechnologii, medycyny i badań w biologii. Taka nieswoista fuzja umożliwia wytwarzanie bardzo cennych komórek hybrydowych i ich produktów, takich jak przeciwciała monoklonalne, a także dostarcza informacji o podstawowych mechanizmach fuzji [2]. Oporowo elektrooporowe jest potencjalnie bardzo skuteczną metodą, ponieważ można ją odpowiednio dostosować do różnych typów ogniw. Elektrooporowość uzyskuje się, gdy ogniwa w bliskim kontakcie fizycznym są wprowadzane w stan fuzogeniczny (podatny na fuzję) za pomocą impulsów elektrycznych o wysokim napięciu. Skuteczność elektrooporu zależy od różnych parametrów, które wpływają na dwie części procesu elektrooporowego. Pierwszym etapem procesu elektrooporowego jest uzyskanie bliskiego kontaktu fizycznego między ogniwami, który można uzyskać różnymi metodami [3-8]. Metoda adherencji (hodowla komórek do konfluencji) może być skutecznie stosowana dzięki spontanicznie nawiązywanym kontaktom komórkowym w dużych strefach między komórkami; Wytwarza jednak bardzo duże połączone komórki z wieloma jądrami. Używamy zmodyfikowanej metody adherencji, w której uzyskuje się mniejsze komórki (z 2 do 5 jądrami), które mają większe szanse na przeżycie i proliferację (ryc. 1). Kontakt między komórkami również korzystnie wpływa na pęcznienie osmotyczne komórek, spowodowane leczeniem osmotycznym zastosowanym w eksperymencie [9]. Drugą częścią procesu elektrooporowego jest osiągnięcie stanu fuzogennego błon komórkowych. Stan fusogeniczny dobrze koreluje ze stanem elektropermeabilizacji błony (komórki są niespecyficznie przepuszczalne dla cząsteczek, które normalnie nie mogą przejść przez nienaruszoną błonę) i rządzą nim te same parametry impulsów elektrycznych (amplituda, długość, liczba i częstotliwość) [10]. Wartości parametrów elektrycznych potrzebnych do optymalnej elektroporacji [1] i elektrooporu różnią się w zależności od ogniwa i zależą od wielkości ogniw oraz ich właściwości biologicznych. W związku z tym parametry elektryczne muszą być zoptymalizowane dla różnych linii komórkowych, które są wykorzystywane jako partnerzy w fuzji, aby uzyskać fuzję.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik	CMRA	Invitrogen	C34551	Cytozolowy barwnik fluorescencyjny
Odczynnik CMFDA		Invitrogen	C7025	Cytozolowy barwnik fluorescencyjny
Odczynnik DMSO		Sigma-Aldrich	D2650
Odczynnik	DMEM	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium
Odczynnik do surowicy cielęcej płodu		Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamina	Odczynnik	Sigma-Aldrich	G7513
odczynnik krystacyliny		Pliva	625110	antybiotyk
gentamycyna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	G1397	antybiotyk
Hepes	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H0887
KH2PO4	Reagent	Merck & Co., Inc.	A124873 927
KH2PO4	Odczynnik	Sigma-Aldrich	4248
MgCl2	Odczynnik	Sigma-Aldrich	M-8266
NaCl		Fluka	71382
Odczynnik KCl		Merck & Co., Inc.	A154336 908
MgSO4	Odczynnik	Sigma-Aldrich	M2643
D-glukoza		Odczynnik Sigma-Aldrich	G8270
Odczynnik CaCl2Reagent		Sigma-Aldrich	C4901
sacharoza	Odczynnik	Sigma-Aldrich	16104
Impuls elektryczny generator	Narzędzie	IGEA		Cliniporator VITAE
Płytka wielodołkowa	Narzędzie	Techno Plastic Products	92424
50 ml probówka wirówkowa	Narzędzie	Techno Plastic Products	91050
15 ml probówka wirówkowa		Narzędzie Techno Plastic Products	91015
25 cm2 kolba hodowlana	Narzędzie	Techno Plastic Products	90026
Elektrody	Narzędzie	Wykonane		Pt / IR