Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w ludzkich plemnikach

Podsumowanie

Oceniono sygnały [Ca²⁺]i wywołane bodźcem w pojedynczych ludzkich plemnikach. Ruchome komórki obciążono fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na Ca²⁺ (metodą estru AM) i unieruchomiono w komorze przepływowej. Obrazowanie komórek przeprowadzono za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, a stymulację wykonano poprzez medium perfuzyjne. Odpowiedzi pojedynczych komórek (lub obszarów) przeanalizowano offline przy użyciu programu Excel.

Streszczenie

Mikroskopia fluorescencyjna komórek obciążonych fluorescencyjnym wskaźnikiem Ca²⁺²⁺barwniki wrażliwe na jony Ca²⁺ są stosowane do pomiaru aspektów przestrzennych i czasowych Ca²⁺²⁺sygnalizacja w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę stosowaną w naszych laboratoriach do obciążania zawiesin plemników ludzkich wskaźnikiem Ca²⁺-barwniki raportujące i pomiar sygnału fluorescencji podczas stymulacji fizjologicznej. Komórki ruchliwe są izolowane metodą bezpośredniego wypływania (swim-up) i inkubowane w warunkach kapacytacji przez 0-24 h, w zależności od eksperymentu. Przenikająca przez błony komórkowe forma estrowa AM (estry acetoksymetylowe) Ca²⁺Następnie do aliquoty komórek dodaje się barwnik raportujący i pozostawia na 1 h w celu wniknięcia barwnika do cytoplazmy. Stosujemy barwniki o długości fali w zakresie światła widzialnego, aby zminimalizować fotouszkodzenia komórek, co jednak uniemożliwia rejestrację ratiometryczną. Omówiono zalety i wady tego podejścia. W czasie ładowania komórki wprowadza się do komory obrazowania i pozwala im przywrzeć do szkiełka podstawowego pokrytego poli-D-lizyną. Po zakończeniu okresu ładowania nadmiar barwnika oraz luźne komórki są usuwane poprzez podłączenie komory do aparatu perfuzyjnego. Komorę perfunduje się w sposób ciągły, a następnie do głowicy perfuzyjnej dodaje się bodźce i zmodyfikowane sole fizjologiczne. Eksperymenty są rejestrowane poprzez akwizycję obrazów fluorescencyjnych w trybie time-lapse i analizowane szczegółowo offline poprzez ręczne wyznaczanie obszarów zainteresowania. Dane są normalizowane do poziomów przedbodźcowych w taki sposób, aby dla każdej komórki (lub części komórki) uzyskać wykres przedstawiający Ca²⁺wynik w postaci procentowej zmiany fluorescencji jest otrzymywany.

Protokół

Plemniki od zdrowych, płodnych mężczyzn z prawidłowym wynikiem analizy nasienia są zazwyczaj przygotowywane do obrazowania w następujący sposób.

1. Próbki nasienia przechowuje się w temperaturze 37°C nie dłużej niż przez 30 min. Komórki izoluje się z osocza nasiennego metodą swim-up w suplementowanym zrównoważonym roztworze soli Earle'a (sEBSS; mM: 1,8 CaCl₂.2H₂O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO₄.7H₂O, 26,2 NaHCO₃, 1,0 NaH₂PO₄.2H₂O, 116,4 NaCl, 55,6 D-glukozy, 2,73 pirowinianu sodu, 41,8 mleczanu sodu) uzupełnionym o 0,3% BSA frakcji V odtłuszczonej węglem aktywnym/wolnej od kwasów tłuszczowych (jakość BSA jest kluczowa dla pomyślnej kapacytacji plemników). 1 ml sEBBS pipetuje się do każdej z serii probówek o objętości 5 ml i delikatnie podkłada 0,3 ml nasienia. Po inkubacji przez 1 godzinę (37°C; 6% CO₂) z każdej probówki delikatnie pobiera się górne 0,7 ml i łączy. 10 μl zawiesiny plemników rozcieńcza się 90 μl 1% (v/v) formaliny w celu unieruchomienia komórek, a następnie plemniki zlicza się w komorze Neubauera. Gęstość komórek w zawiesinie dostosowuje się następnie (za pomocą sEBSS) do poziomu 6 milionów komórek/ml.
2. Próbkę dzieli się następnie na alikwoty po 200 μl w probówkach z luźnymi nakrętkami i inkubuje (37°C; 6% CO₂) przez 5-6 h, aby umożliwić kapacytację.
3. Szkiełka nakrywkowe (22x50 mm) były wcześniej traktowane poli-D-lizyną. 10 μl roztworu poli-D-lizyny (10% w/v) nanosi się w postaci serii małych kropli na środek szkiełka nakrywkowego. Następnie pozwala się poli-D-lizynie wyschnąć na powietrzu. Może to odbywać się na podgrzewanym stole i powinno trwać do całkowitego wyschnięcia. Szkiełko nakrywkowe przytwierdza się smarem próżniowym do zamkniętej, specjalnie zaprojektowanej, przepływowej poliwęglanowej komory obrazowej (wymiary 35 mm x 20 mm x 5 mm; pojemność ≈ 180 μl) podobnej do komory Warner RC20. Szkiełko nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną stanowi podstawę komory podczas obserwacji komórek pod mikroskopem odwróconym, a okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm tworzy górną powierzchnię komory, umożliwiając przepuszczanie światła.
4. Do znakowania komórek używa się Oregon Green BAPTA1-AM (OGB) lub Calcium Green 1-AM. OGB przygotowuje się poprzez rozpuszczenie w DMSO. W DMSO dodaje się kwas Pluronic F127 (detergent), aby zapobiec „zbrylaniu się” barwnika. Można go przygotować w laboratorium (100 mg Pluronicu w 0,5 ml DMSO) bezpośrednio przed użyciem lub zakupić w formie gotowej. 20 μl dodaje się do alikwoty 50 μg OGB (2,5 mg/ml). Fiolkę można następnie przechowywać w zamrożeniu i rozmrażać do późniejszego użycia.
5. Po kapacytacji plemników (5-6 h w sEBBS, 37°C; 6% CO₂) wybiera się probówkę do obrazowania i dodaje 1,2 μl roztworu OGB, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM. Probówkę inkubuje się przez kolejne 40 min, po czym zawiesinę komórkową delikatnie wstrzykuje się do wlotu komory obrazowej za pomocą końcówki pipety p1000 (niebieskiej). Komorę umieszcza się w inkubatorze stroną ze szkiełkiem pokrytym poli-D-lizyną do dołu na 20 min. Komórki mają tendencję do pływania wzdłuż powierzchni komory i będą przylegać do obszaru pokrytego poli-D-lizyną.
6. Komorę montuje się teraz na mikroskopie, podłącza do aparatury perfuzyjnej i perfunduje z prędkością ok. 0,5 ml/min. Pompa perystaltyczna podaje sól fizjologiczną do komory, a nadmiar z portu wyjścia jest usuwany przez pompę ssącą z pułapką. Preparat pozostawia się w ciemności przez co najmniej 10 min, podczas gdy luźne komórki i pozakomórkowy barwnik są usuwane poprzez perfuzję komory. Stabilność temperatury jest niezwykle ważna, ponieważ niewielkie wahania mogą nie tylko wpływać na homeostazę Ca²⁺ w komórkach, ale mogą również wpływać na K_d barwnika. Eksperymenty zazwyczaj przeprowadza się w temperaturze 25°C, utrzymując temperaturę ciemni na tym poziomie. Stwierdzono, że utrzymanie temperatury pomieszczenia na wymaganym poziomie zapewnia większą stabilność temperatury i ostrości niż stosowanie stołu z kontrolą temperatury lub grzałki z termostatem na wlot soli fizjologicznej.
7. Komórki obserwuje się pod obiektywem w kontraście fazowym (40x lub 60x imersyjnym) i wybiera obszar do obrazowania. Preferowany jest fragment obszaru pokrytego poli-D-lizyną znajdujący się w pobliżu portu wlotowego, gdzie przepływ soli fizjologicznej jest laminarny i jednolity. Ważne jest również wybranie obszaru o odpowiedniej gęstości komórek (nadmierna gęstość wpływa na jakość i wiarygodność danych poprzez pobieranie sygnału z sąsiednich komórek) oraz takiego, w którym komórki są odpowiednio przytwierdzone, ale aktywność wiciowata jest dostrzegalna. Zapisuje się obraz w kontraście fazowym. Następnie mikroskop przełącza się w tryb fluorescencji (pobudzenie 480 nm; emisja 540 nm) i skraca czas ekspozycji do minimum wymaganego do uzyskania wyraźnego obrazu fluorescencyjnego (zazwyczaj 50-200 ms).
8. Eksperyment rozpoczyna się poprzez aktywację oprogramowania do akwizycji obrazów w serii czasowej (IQ). Obrazy są zazwyczaj pobierane z częstotliwością 0,1 Hz, a oświetlenie jest ograniczone wyłącznie do okresów akwizycji obrazu za pomocą sterowanej programowo przesłony. Można stosować znacznie wyższe szybkości akwizycji obrazów, ale należy uwzględnić problemy z blaknięciem (bleaching) i generowaniem artefaktów z powodu uszkodzeń fotochemicznych komórek (patrz: dyskusja). IQ (oraz większość innych platform oprogramowania do akwizycji) umożliwia wykresy fluorescencji w czasie rzeczywistym podczas eksperymentu.
9. Po okresie kontrolnym trwającym od 3 do 5 minut manipulację składnikami soli fizjologicznej (takimi jak [Ca²⁺]_o) i aplikację leków przeprowadza się poprzez wymianę soli fizjologicznej w głowicy perfuzyjnej. Odnotowuje się czas dodania każdego bodźca, aby można było obliczyć czas jego dotarcia do komory obrazowej, co zapewnia wystarczającą dokładność do oceny wolnych reakcji opisanych tutaj (próbkowanych w 0,1 Hz). W przypadku szybszych reakcji większą dokładność można osiągnąć, dodając bodźce bezpośrednio do przepływu soli fizjologicznej poprzez drugi port wlotowy, taki jak w komorze Warner RC20.
10. Obrazy analizuje się offline za pomocą IQ. Regiony zainteresowania (ROI) wyznacza się wokół każdej komórki (lub części komórki), a także wybiera obszar wolny od komórek (do automatycznego odjęcia tła przez oprogramowanie). Następnie sprawdza się serię obrazów w celu usunięcia komórek, które obumarły lub przeszły reakcję akrosomalną (która objawia się dużym i szybkim wzrostem fluorescencji, a następnie utratą barwnika cytoplazmatycznego) w trakcie eksperymentu oraz tych, które wykazały ruch na tyle duży, by spowodować artefakty podczas analizy w serii czasowej.
11. Następnie uzyskuje się serię intensywności fluorescencji w czasie dla każdego ROI, a dane te analizuje się offline w programie Excel. Początkowo fluorescencję normalizuje się do wartości średniej uzyskanej w okresie kontrolnym, korzystając z równania R = [ (F - F_rest) / F_rest] x 100%, gdzie R jest procentową zmianą fluorescencji w porównaniu z okresem kontrolnym, F to intensywność fluorescencji w czasie t, a F_rest to średnia z co najmniej 30 pomiarów F uzyskanych w okresie kontrolnym.

Reprezentatywne wyniki

Rycina 1 przedstawia serię obrazów z eksperymentu, w którym komórki stymulowano 3 μM progesteronem. Górny rząd oraz film 1 prezentują obrazy fluorescencyjne w skali szarości, a te same obrazy przedstawione są poniżej (oraz w filmie 2) w pseudokolorach (tabela lookup '16_colors' w Image J), gdzie kolory „chłodne” wskazują niską intensywność fluorescencji, a kolory „ciepłe” wysoką intensywność fluorescencji. Komórki można obserwować w pseudokolorach podczas eksperymentu, korzystając z tabel lookup w IQ, jednak skala szarości jest zazwyczaj bardziej informatywna przy ocenie, czy komórki zostały prawidłowo oznakowane. Dwa pierwsze obrazy zostały zarejestrowane w 0 s i 100 s po rozpoczęciu rejestracji. Fluorescencja powinna być stabilna i zazwyczaj jest najsilniejsza w obszarze pozaakrozomalnym oraz w szyjce plemnika. Progesteron wprowadzono do komory obrazowania w około 175 s, a 3.^rd i 4.^th obrazy (180 s i 220 s) wykazują szybki wzrost [Ca²⁺]ⁱ (fluorescencji), rozpoczynający się w tylnej części głowy i obszarze szyjki komórki. Kolejne obrazy wykonano w 290, 360, 740, 990 i 1440 s, co pokazuje zanik początkowego przejściowego wzrostu [Ca²⁺]i oraz rozwój wtórnego, trwałego podwyższenia stężenia. Rycina 2 przedstawia analizę w arkuszu kalkulacyjnym, przekształcającą surowe wartości fluorescencji dla każdego ROI na znormalizowaną fluorescencję (% zmiany fluorescencji w porównaniu z okresem kontrolnym). Rycina 3 przedstawia wykresy fluorescencji znormalizowane w czasie dla 3 komórek, wykazujące „typowe” reakcje na 3 μM progesteronu.

Rycina 1. Przykład danych z komórki stymulowanej progesteronem. Przedstawiono serię obrazów fluorescencyjnych w skali szarości (górny rząd) i w pseudokolorach (dolny rząd). Punkty czasowe to 0, 180, 220, 290, 360 i 990 s. 3 μM progesteronu wprowadzono do komory obrazowania w 175 s. ROI pokazano na pierwszym panelu.

Rysunek 2. Analiza danych fluorescencji pojedynczych komórek w programie Excel. Wartości zaznaczone na czarno to serie czasowe danych fluorescencji, ułożone pionowo. Wartości zaznaczone na czerwono (poniżej) to dane znormalizowane, uzyskane przy użyciu równania podanego w tekście. Wykres przedstawia znormalizowany przebieg fluorescencji w czasie dla komórki 64 w tym doświadczeniu, która po stymulacji wykazuje przejściowy wzrost fluorescencji, po którym następuje powolny wzrost oraz seria niewielkich oscylacji.

Rycina 3. Przebiegi fluorescencji w czasie dla 3 pojedynczych komórek, wyrażone jako % zmiany względem wartości kontrolnej. W czasie wskazanym przez strzałkę dodano 3 μM progesteronu. Linia przerywana przedstawia średnią fluorescencję kontrolną.

Dyskusja

Prawidłowo przeprowadzona technika ta pozwala na rejestrację rozkładu i kinetyki spontanicznych oraz indukowanych sygnałów Ca²⁺ w ludzkich plemnikach. Odpowiedzi można uzyskać od dużej liczby komórek (do 200), co jest istotne, ponieważ ludzkie plemniki mogą wykazywać znaczną zmienność w zakresie spontanicznych i stymulowanych sygnałów Ca²⁺. Pomyślne znakowanie oraz przeżywalność komórek podczas rejestracji są w wysokim stopniu zależne od jakości próbki. Próbki słabej jakości skutkują niewłaściwym znakowaniem, słabymi odpowiedziami, a komórki mogą obumrzeć w trakcie rejestracji.

Ludzkie plemniki są bardzo wrażliwe na uszkodzenia wywołane światłem, dlatego stosujemy minimalnie niezbędne oświetlenie (zarówno pod kątem natężenia, jak i czasu ekspozycji), aby zmaksymalizować przeżywalność komórek i zminimalizować artefakty wynikające z ich obumarcia. Dużą zaletą jest zastosowanie kamery o wysokiej czułości (umożliwiającej korzystanie z oświetlenia o niskim natężeniu), ponieważ pozwala ona na zarejestrowanie słabej fluorescencji. Szczególnie odpowiednie są kamery EM-CCD z podświetleniem tylnym, choć są one bardzo kosztowne. Oświetlenie LED (zamiast lampy ksenonowej lub rtęciowej z filtrem wzbudzenia) również poprawia przeżywalność komórek (Nishigaki et al, 2006).

Nie używamy Fura-2, pomimo oczywistych zalet obrazowania ratiometrycznego, ponieważ Fura wymaga wzbudzenia światłem UV oraz konieczności wykonania dwóch obrazów dla każdego stosunku. W przypadku danych uzyskanych przy użyciu barwników widzialnego światła o pojedynczej długości fali, normalizacja intensywności fluorescencji w dużej mierze rekompensuje różnice w stopniu załadowania barwnika między komórkami, ale nie niweluje różnic w rozkładzie barwnika w obrębie pojedynczej komórki, co należy mieć na uwadze. Choć barwniki o pojedynczej długości fali mogą w zasadzie podlegać kalibracji, dokładność tej techniki jest niska, dlatego nie podejmujemy takiej próby.

Podczas gdy dane dotyczące stosunku uzyskane za pomocą Fura-2 (lub barwnika emisyjnego indo), nawet bez kalibracji, dają akceptowalnie wierny obraz względnych zmian [Ca²⁺]i, intensywność fluorescencji barwników jednofalowych nie jest liniowo powiązana z [Ca²⁺]i. W najbardziej użytecznej części krzywej nasycenia zależność dla barwników jednofalowych zazwyczaj ma charakter zbliżony do logarytmicznego. Obecnie stosujemy Oregon Green BAPTA-1 (Rysunek 4), ponieważ jest on czuły na niewielkie zmiany [Ca²⁺]i bliskie poziomom spoczynkowym (50-100 nM). Gdy [Ca²⁺]i wzrośnie powyżej 1 μM, odpowiedzi będą niedoszacowane pod względem zmiany fluorescencji, a barwnik może ulec nasyceniu. Opcją ulepszenia techniki bez uciekania się do wzbudzania promieniami UV jest podwójne obciążenie komórek barwnikami takimi jak Fluo-3 i Fura red. Oba mogą być wzbudzane przy 488 nM, jednak ich jednoczesne odpowiedzi są bardzo odmienne. Rejestracja emisji przy 540 i 650 nM dostarcza stosunku, który może stanowić lepszą metodę dokładnego monitorowania [Ca²⁺]i (Haughland, 2002) i może mieć zastosowanie w przypadku plemników (Nisigaki et al, 2006).

Rycina 4. Zależność między wolnym [Ca²⁺] (nM) a emisją fluorescencji przy maksymalnej długości fali (ok. 525 nm) dla Oregon Green BAPTA-1 i Oregon Green BAPTA-2. OGB1 wykazuje wyższą fluorescencję przy spoczynkowym [Ca²⁺], ale nasyca się przy niższych poziomach, przez co ma mniejszy zakres użyteczności. Dane do tych wykresów pobrano z podręcznika Molecular Probes (Haughland, 2002).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kamera do niskich poziomów światła	QImaging	Rolera XR
Oregon Green BAPTA-1	Invitrogen	06807
Oprogramowanie do obrazowania	Andor	IQ
Oprogramowanie do obrazowania	National Institutes of Health	Image J	Oprogramowanie z domeny publicznej
System oświetlenia LED	Cairn Research	Opto LED
Pluronic F-127 (20% roztwór w DMSO)	Invitrogen	P3000MP