Synchronizacja nicieni: metoda uzyskiwania populacji robaków w identycznych stadiach rozwoju

Streszczenie

Źródło: Sarasija, S. i Norman, K. R. Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).

W tym filmie pokazujemy metodę wytwarzania rozwojowo zsynchronizowanej populacji bezpłodnych dorosłych C. elegans. Przykładowy protokół synchronizuje robaki w celu zbadania wskaźników zużycia tlenu u żywych zwierząt.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem Sarasija i Norman, Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Wzrost i synchronizacja populacji nicieni

Te zwierzęta osiągną stadium larwalne L4 po ~42 godzinach. W tym czasie przenieś larwy L4 za pomocą platynowego kilofa na płytki NGM z nasionami OP50 zawierające 0,5 mg/ml 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUdR), aby zapobiec wytwarzaniu przez nie potomstwa.
UWAGA Upewnij się, że w ramach eksperymentu wszystkie szczepy są synchronizowane przez podobny czas. Zabieg FUdR sterylizuje zwierzęta i zapobiega składaniu jaj i produkcji potomstwa, co może mieć wpływ na OCR. Te wysterylizowane zwierzęta zostaną przeanalizowane następnego dnia (dzień 1 dorosłe zwierzęta po ~66 godzinach) do testu. Doniesiono, że FUdR wpływa na fizjologię i długość życia niektórych zmutowanych robaków. Dlatego należy to wziąć pod uwagę, gdy lek jest używany do sterylizacji. Robaki można również sterylizować za pomocą mutacji feminizujących, takich jak fem-1 (hc17) lub fem-3 (e2006). Jednak mutacje te mogą wpływać na funkcję mitochondriów.

1. Przenieść larwy L4 o pożądanym tle genetycznym (np. N2 [typ dziki] i zwierzęta sel-12) na płytki pożywki hodowlanej nicieni (NGM) (patrz tabela 1 dla przepisu) świeżo wysiane trawnikiem Escherichia coli (OP50). Użyć co najmniej dwóch płytek 100 mm lub trzech płytek 60 mm dla każdego odkształcenia. Inkubować robaki w odpowiedniej temperaturze wzrostu (między 15–25 °C) przez 3–4 dni lub do momentu, gdy płytki zostaną zagęszczone dużą liczbą jaj i grawitacyjnych robaków.
2. Zmyć jaja i robaki z płytek za pomocą około 6 ml buforu M9 (przepis znajduje się w tabeli 1) na 100 mm płytkę nicieni i przenieść je za pomocą szklanych pipet Pasteura do oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml dla każdego szczepu. Obracaj te probówki przez 3 minuty przy 6,180 x g i odessaj bufor M9, zatrzymując tylko osady zwierząt i jaj.
3. Dodać 3-4 ml roztworu wybielacza (przepis znajduje się w Tabeli 1) do każdej probówki i z przerwami wirować przez 6 minut. Dodać bufor M9, aby napełnić każdą probówkę i wirować przy 6,180 x g przez 1 minutę i odsysać supernatant. Powtórzyć to płukanie M9 trzy razy i przenieść granulki jaj do świeżej probówki o pojemności 15 ml zawierającej około 9 ml buforu M9.
4. Zsynchronizuj świeżo wyklute robaki, nutując w temperaturze 20 °C przez 16–48 godzin. Obracaj te rurki w temperaturze 6 180 x g przez 1,5 minuty i połóż zsynchronizowane zwierzęta L1 na indywidualnych płytkach NGM, świeżo obsianych trawnikiem OP50 (około 6 000–10 000 zwierząt na płytkę 100 mm) i utrzymuj w temperaturze 20 °C.

Wyniki

Tabela 1: Przepisy na płytki NGM, bufor M9 i roztwór wybielacza.

powiedział: ...

Bufor M9 (1 L)
dH2O	1 000 ml
Zawartość NaCl	5 gramów
KH2PO4	3 gramów

Materiały

100 mm; szalki Petriego 60 mm

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kord-Valmark Produkty laboratoryjne	2900; 2901
15 ml	Corning	430791
50 ml	Corning	430829
agar	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1423-2
pepton Bacto	Bd; Bakto	211677
Bacto trypton	Bd; Bakto	211705
Ekstrakt z drożdży baktonowych	Bd; Bakto	212705
Wybielacz	rodzajowy
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2·2H2O)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał C79-500
Cholesterol	Fisher Naukowy	Zobacz materiał C314-500
Woda dejonizowana (dH2O)
Szklane pipety Pasteura	Krackeler Scientific	Numer katalogowy: 6-72050-900
Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4·7H2O)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP213-1
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP363-1
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał P285-500
Chlorek sodu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP358-10
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP359-500
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny (Na2HPO4)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP332-1

Probówki stożkowe Probówki stożkowe