$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem Sarasija i Norman, Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Wzrost i synchronizacja populacji nicieni
Te zwierzęta osiągną stadium larwalne L4 po ~42 godzinach. W tym czasie przenieś larwy L4 za pomocą platynowego kilofa na płytki NGM z nasionami OP50 zawierające 0,5 mg/ml 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUdR), aby zapobiec wytwarzaniu przez nie potomstwa.
UWAGA Upewnij się, że w ramach eksperymentu wszystkie szczepy są synchronizowane przez podobny czas. Zabieg FUdR sterylizuje zwierzęta i zapobiega składaniu jaj i produkcji potomstwa, co może mieć wpływ na OCR. Te wysterylizowane zwierzęta zostaną przeanalizowane następnego dnia (dzień 1 dorosłe zwierzęta po ~66 godzinach) do testu. Doniesiono, że FUdR wpływa na fizjologię i długość życia niektórych zmutowanych robaków. Dlatego należy to wziąć pod uwagę, gdy lek jest używany do sterylizacji. Robaki można również sterylizować za pomocą mutacji feminizujących, takich jak fem-1 (hc17) lub fem-3 (e2006). Jednak mutacje te mogą wpływać na funkcję mitochondriów.
- Przenieść larwy L4 o pożądanym tle genetycznym (np. N2 [typ dziki] i zwierzęta sel-12) na płytki pożywki hodowlanej nicieni (NGM) (patrz tabela 1 dla przepisu) świeżo wysiane trawnikiem Escherichia coli (OP50). Użyć co najmniej dwóch płytek 100 mm lub trzech płytek 60 mm dla każdego odkształcenia. Inkubować robaki w odpowiedniej temperaturze wzrostu (między 15–25 °C) przez 3–4 dni lub do momentu, gdy płytki zostaną zagęszczone dużą liczbą jaj i grawitacyjnych robaków.
- Zmyć jaja i robaki z płytek za pomocą około 6 ml buforu M9 (przepis znajduje się w tabeli 1) na 100 mm płytkę nicieni i przenieść je za pomocą szklanych pipet Pasteura do oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml dla każdego szczepu. Obracaj te probówki przez 3 minuty przy 6,180 x g i odessaj bufor M9, zatrzymując tylko osady zwierząt i jaj.
- Dodać 3-4 ml roztworu wybielacza (przepis znajduje się w Tabeli 1) do każdej probówki i z przerwami wirować przez 6 minut. Dodać bufor M9, aby napełnić każdą probówkę i wirować przy 6,180 x g przez 1 minutę i odsysać supernatant. Powtórzyć to płukanie M9 trzy razy i przenieść granulki jaj do świeżej probówki o pojemności 15 ml zawierającej około 9 ml buforu M9.
- Zsynchronizuj świeżo wyklute robaki, nutując w temperaturze 20 °C przez 16–48 godzin. Obracaj te rurki w temperaturze 6 180 x g przez 1,5 minuty i połóż zsynchronizowane zwierzęta L1 na indywidualnych płytkach NGM, świeżo obsianych trawnikiem OP50 (około 6 000–10 000 zwierząt na płytkę 100 mm) i utrzymuj w temperaturze 20 °C.