In-vivo wirowanie zarodków Drosophila

Podsumowanie

Opisujemy metodę rozdzielania organelli według gęstości w żywych embrionach Drosophila. Embriony są zatapiane w agarze i poddawane wirowaniu. Technika ta pozwala na powtarzalne rozdzielenie głównych organelli wzdłuż osi przednio-tylnej embrionu. Metoda ta ułatwia przeprowadzanie eksperymentów kolokalizacyjnych i pozwala na uzyskanie frakcji organelli do analizy biochemicznej oraz eksperymentów z transplantacją.

Streszczenie

Główną strategią oczyszczania i izolacji różnych typów organelli wewnątrzkomórkowych jest ich rozdzielanie na podstawie różnic w gęstości wyporności. Jednakże, gdy komórki zostaną rozbite przed wirowaniem, białka i organelle w tym nienatywnym środowisku często niewłaściwie przylegają do siebie. W niniejszej pracy opisujemy metodę rozdzielania organelli według gęstości w nienaruszonych, żywych embrionach Drosophila. Wczesne embriony przed cellularizacją są pobierane z klatek populacyjnych, a ich zewnętrzne skorupki jaj są usuwane poprzez traktowanie 50% wybielaczem. Następnie embriony są przenoszone na małą płytkę agarową i wstawiane, końcem tylnym do przodu, do małych pionowych otworów w agarze. Płytki z osadzonymi embrionami są wirowane przez 30 min przy 3000g. Agar podtrzymuje embriony i utrzymuje je w określonej orientacji. Następnie embriony są wydobywane z agaru za pomocą tępej igły.

Wirowanie rozdziela główne organella na oddzielne warstwy, tworząc stratyfikację łatwo widoczną w mikroskopii w świetle przechodzącym. Dostępnych jest wiele markerów fluorescencyjnych, które pozwalają potwierdzić prawidłową stratyfikację w żywych embrionach. Białka związane z określonymi organellami będą wzbogacone w konkretnej warstwie, co wykaże kolokalizację. Poszczególne warstwy można odzyskać do analizy biochemicznej lub transplantacji do jaj donorów. Technika ta znajduje zastosowanie w separacji organelli w innych dużych komórkach, w tym w jajach i oocytach różnych gatunków.

Protokół

1) Przygotowanie płytek z agarem

Przegląd: Niniejszy protokół wykorzystuje płytki agarowe w dwóch różnych celach. Po pierwsze, płytki agarowe służą jako powierzchnia do zbierania jaj; sok jabłkowy w agarze stymuluje składanie jaj. Po drugie, zarodki zatopione w agarze pozostają w stałej orientacji podczas wirowania płytek; wysokie stężenie agaru jest niezbędne, aby zapobiec rozpadowi płytek podczas wirowania. Dla uproszczenia do obu zastosowań wykorzystuje się jeden rodzaj agaru z sokiem jabłkowym.

Materiały

• Agar (25 g)
• Sacharoza (25 g)
• Sok jabłkowy (250 ml)
• Roztwór stokowy Nipaginu M (5 g metylopara-hydroksybenzoesanu w 50 ml etanolu), pełni funkcję konserwantu
• Szalki Petriego: do wirowania (60x15mm) oraz do zbierania jaj (60x15 mm lub 100x15 mm, w zależności od klatek dla much użytych w kroku 2)

Sprzęt

• Płyta grzejna
• Dwie kolby Erlenmeyera

1. W kolbie Erlenmeyera połączyć 25 g agaru i 750 ml dH₂O. Autoklawować przez 50 min w cyklu dla cieczy. W tym czasie przygotować roztwór soku jabłkowego (krok 1.2).
2. W drugiej kolbie Erlenmeyera połączyć 25 g sacharozy i 250 ml soku jabłkowego. Podgrzewać na płycie grzejnej (do ok. 55°C), aby rozpuścić sacharozę. Następnie dodać 15 ml roztworu Nipaginu M. Unikać wyższych temperatur, ponieważ spowodują one rozkład Nipaginu.
3. Gdy roztwór agaru ostygnie na tyle, aby można było bezpiecznie trzymać kolbę w dłoni, połączyć oba roztwory i dokładnie wymieszać. Mieszać na płycie grzejnej aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny.
4. Wlać roztwór do szalek Petriego (wysokość ~ 0,5 cm). 1 litr roztworu wystarcza na około 100 małych (średnica 60 mm) lub 40 dużych (średnica 100 mm) szalek.
5. Płytki agarowe powinny schnąć przez kilka godzin lub przez noc w temperaturze pokojowej; w przeciwnym razie będą zbyt wilgotne do użytku. Do długotrwałego przechowywania trzymać je zapakowane (w plastikowych pojemnikach lub etui na szalki Petriego) w temperaturze 4°C.

2) Pobieranie zarodków

Przegląd: W ciągu pierwszych 3 godzin rozwoju (w temperaturze pokojowej) zarodki Drosophila są pojedynczymi komórkami (nie licząc prekursorów linii zarodkowej, czyli położonych z tyłu komórek bieguna). Gdy prawidłowo zorientowane zarodki na tych etapach zostaną poddane wirowaniu, główne organelle rozdzielają się według gęstości wzdłuż długiej osi jaja. Na etapie cellularizacji ta duża pojedyncza komórka przekształca się w tysiące małych komórek; zastosowane siły odśrodkowe nie spowodują rozerwania tych komórek. Aby skutecznie wysegregować główne organelle, kluczowe jest zatem wirowanie zarodków, które nie zakończyły jeszcze procesu cellularizacji.

Materiały

• Szalki z agarem z soku jabłkowego
• Pasta drożdżowa (suche drożdże wymieszane z wodą do konsystencji masła orzechowego)

Sprzęt

• Klatki dla much: dostępne w handlu (patrz poniżej) lub wykonane samodzielnie ¹

1. Dorosłe muchy utrzymuje się w klatkach, do których od spodu przymocowane są płytki z agarem z sokiem jabłkowym. Należy użyć czarek Petri o rozmiarze odpowiednim dla stosowanych klatek.
2. Aby rozpocząć zbieranie jaj, należy przygotować świeżą płytkę z agarem z sokiem jabłkowym i pokryć jej fragment pastą drożdżową. Muszki owocówki żywią się drożdżami; w szczególności drożdże dostarczają składników odżywczych niezbędnych do produkcji jaj. Obecność drożdży i soku jabłkowego w agarze indukuje również składanie jaj.
3. Aby wymienić starą płytkę agarową na nową, klatkę z muchami odwraca się i kilka razy uderza o blat stołu. Muchy opadną na dno i zostaną na chwilę zdezorientowane. Daje to kilka sekund na szybkie usunięcie jednej płytki agarowej i zastąpienie jej nową. Wymiana ta wymaga pewnej wprawy, a szczegóły zależą od rodzaju zastosowanej klatki.
4. Samice much przechowują plemniki z poprzednich kopulacji w wewnętrznych woreczkach (spermatekach), z których plemniki są uwalniane w celu zapłodnienia jaj. Gdy samice są dobrze odżywione i niezakłócone, składają jaja krótko po zapłodnieniu, zatem czas składania jaj wyznacza moment zapłodnienia i początek rozwoju. W nieoptymalnych warunkach samice zatrzymują zapłodnione jaja na różny czas przed ich złożeniem. Aby zminimalizować liczbę tak błędnie etapowanych embrionów, zaleca się odrzucenie pierwszej kolekcji z dnia pracy (wystarczy „wstępne zbieranie” trwające od 30 do 60 min). Obecność świeżych drożdży indukuje samice do złożenia tych zatrzymanych jaj, a kolejne kolekcje jaj mają tendencję do dominacji jaj złożonych krótko po zapłodnieniu.
5. Zbierać jaja przez maksymalnie 3 godziny, w zależności od tego, jaki etap embrionalny jest pożądany. Ponieważ w temperaturze pokojowej celularyzacja kończy się po około 3,5 godzinach, dłuższe czasy zbierania nie są przydatne. Najbardziej spójne warstwy uzyskuje się w młodych embrionach, dlatego w rutynowych eksperymentach preferujemy krótszy czas zbierania (1 h lub krócej).
6. Czasami muchy przyklejają się do drożdży lub do powierzchni płytki agarowej. Należy je usunąć pęsetą.

3) Usuwanie skorupy jaj z embrionów

Przegląd: Zarodki Drosophila są pokryte dwiema warstwami ochronnymi: zewnętrzną warstwą (chorionem) zbudowaną z białka oraz wewnętrzną warstwą (błoną witelijną) składającą się głównie z wosku. Chronią one zarodek przed uszkodzeniami mechanicznymi i wysychaniem. Chorion posiada dwa wydłużenia (filamenty jaja lub wyrostki grzbietowe), które są łatwo widoczne jako odrębne struktury. W tym kroku usuniemy chorion poprzez namaczanie jaj w 50% wybielaczu. Po usunięciu chorionu zarodek staje się przezroczysty w świetle przechodzącym, co pozwala na wybór konkretnych stadiów embrionalnych do wirowania. Ponieważ chorion zakłócałby również wiele procedur po wirowaniu (np. fiksację w kroku 6), jego usunięcie na tym etapie umożliwi szybszą obróbkę w dalszej części protokołu.

Obróbka 50% roztworem wybielacza rozpuści chorion w ciągu kilku minut, nie szkodząc przy tym embrionowi. Błona żółtkowa zapobiega przenikaniu wybielacza do wnętrza. Kontynuujemy obróbkę wybielaczem do momentu, aż włókna jajowe przestaną być widoczne. Następnie oddzielimy embriony od wybielacza, przelewając zawiesinę embrionów i wybielacza przez małe sito (koszyczek wykonany z drucianej siatki). Krytyczne jest, aby nie przyspieszać etapu ekspozycji na wybielacz. Jeśli wybielacz zostanie wypłukany przedwcześnie, późniejsze etapy (np. usuwanie błony żółtkowej po utrwaleniu) mogą zostać zakłócone.

Materiały:

• Butelka z rozpylaczem z 50% roztworem wybielacza (jedna objętość dH₂O na jedną objętość wybielacza handlowego)
• Butelka z rozpylaczem z dH₂O
• Ręcznik papierowy

Sprzęt:

• Własnej roboty koszyczki druciane wykonane z arkuszy stalowej siatki nierdzewnej. Aby przygotować koszyczki, należy wyciąć z płaskiego arkusza kwadraty o wymiarach ~ 2 x 2 cm, a następnie wgnieść je w środkowej części.
• Pęseta do trzymania koszyczków drucianych
• Mikroskop sekcyjny skonfigurowany do transiluminacji

1. Umieść płytkę agarową pod mikroskopem stereotypowym i obserwuj zarodki przy użyciu oświetlenia przechodzącego. Upewnij się, że zidentyfikowałeś nitki jajowe (patrz Rycina 2A).
2. Wlej 50% wybielacz na płytkę agarową, aby pokryć zarodki. Od czasu do czasu potrząsaj płytką agarową, aby zarodki przemieszczały się w wybielaczu.
3. Gdy nitki jajowe przestaną być widoczne (zwykle po 3-5 min, choć czas ten może się różnić), oznacza to, że chorion został skutecznie usunięty.
4. W następnym kroku koszyk z drucianej siatki zostanie użyty jako sito do oddzielenia zarodków od wybielacza. Chwyć koszyk pęsetą i przytrzymaj go nad odwróconą pokrywą płytki agarowej. Pokrywa posłuży jako zbiornik do zbierania wybielacza ściekającego przez drucianą siatkę.
5. Wlej zawiesinę wybielacza i zarodków z płytki agarowej przez drucianą siatkę.
6. Jeśli na płytce agarowej pozostała znaczna liczba zarodków, wlej dH₂O na płytkę, a następnie przelej zawiesinę dH₂O i zarodków przez drucianą siatkę. Jeśli znaczna liczba zarodków przedostanie się do zbiornika, przelej zawartość zbiornika przez drucianą siatkę.
7. Dotknij spodu drucianej siatki ręcznikiem papierowym, aby odsączyć nadmiar cieczy. Następnie wlej dH₂O na drucianą siatkę, aby wypłukać pozostały wybielacz. Jak opisano powyżej, pokrywę płytki można wykorzystać jako zbiornik do odzyskania zarodków, które zostały przypadkowo wypłukane. Można zminimalizować utratę zarodków, kierując strumień wody z butelki zraszającej wzdłuż obwodu drucianego koszyka. Często odsączaj nadmiar cieczy.
8. Powtórz ten etap płukania od pięciu do dziesięciu razy, aż do całkowitego usunięcia wybielacza. Jeśli z drucianego koszyka nadal wydobywa się zapach wybielacza, płukanie należy kontynuować.

4) Montowanie zarodków w agarze

Przegląd: Jaja Drosophila są znacznie dłuższe (~ 500 μm) niż szerokie (~180 μm). Aby uzyskać maksymalną i powtarzalną separację organelli podczas wirowania, orientujemy zarodki tak, aby ich końce przednie były skierowane w stronę centrum rotacji (Rysunek 1, 3). W ten sposób najlżejsze struktury wewnątrzkomórkowe (kropelki lipidowe) gromadzą się na końcu przednim we wszystkich zarodkach, natomiast struktury bardzo gęste (składniki żółtka) gromadzą się w pobliżu końca tylnego. Zarodki umieszcza się w małych pionowych otworach w agarze z soku jabłkowego, z końcami przednimi skierowanymi do góry. Agar utrzymuje zarodek w stałej orientacji podczas wirowania.

Sprzęt:

• Uchwyt do igieł
• Igły wolframowe; igły są zamontowane w uchwycie przeciwnie do typowej orientacji, tak aby tępy koniec wystawał i umożliwiał manipulowanie embrionami
• Pipeta P200
• Mikroskop sekcyjny z ustawionym oświetleniem przeświecającym
• Pędzelek do muszek (mały pędzelek malarski używany do sortowania dorosłych osobników Drosophila)

Materiały:

• Roztwór soli z Tritonem (TSS): 4g NaCl, 0.3 ml Triton X-100, uzupełnić ddH₂O do 1000 ml (można przygotować jako 10-krotny roztwór zapasu)

1. Wypłucz embriony z koszyka drucianego za pomocą TSS do pustej szalki Petriego. Embriony powinny opaść na dno. Przenieś szalkę Petriego z embrionami w TSS pod stereomikroskop i obserwuj za pomocą oświetlenia przeświecającego (embriony będą wyglądać podobnie do tych przedstawionych na Rysunku 4).
2. Używając pipety P200, wybierz embriony na pożądanych etapach rozwoju i przenieś je na małą płytkę agarową. Poszczególne etapy można łatwo rozpoznać wizualnie (Rysunek 4; więcej szczegółów w ¹). Pracuj szybko, ponieważ embriony starzeją się, a przedłużone zanurzenie (dłuższe niż 30 min) w TSS może wpłynąć na ich rozwój.
3. Usuń większość TSS za pomocą pipety i chusteczki Kimwipe. Powierzchnia agaru powinna być lekko wilgotna, co ułatwia przesuwanie embrionów. Nie powinny jednak pozostać żadne kałuże cieczy na płytce, ponieważ nadmiar cieczy podczas wirowania spowoduje wysunięcie się embrionów z otworów.
4. Za pomocą igły wykonaj pionowe otwory w agarze w pobliżu miejsca, w którym znajduje się embrion. Trudno jest wykonać idealnie pionowe otwory, ponieważ igłę trzeba trzymać pod kątem, aby jednocześnie móc obserwować preparat pod mikroskopem. Lekkie nachylenie igły jest w rzeczywistości korzystne, ponieważ tworzy ono niewielkie wgłębienie/rowek po jednej stronie otworu, dzięki czemu embrion łatwo wślizgnie się wzdłuż niego do otworu. Wystarczy przebić powierzchnię agaru, ponieważ jest on na tyle miękki, że po częściowym włożeniu embrionu do otworu można go wcisnąć głębiej bez powodowania uszkodzeń.
5. Upewnij się, że rozpoznajesz koniec przedni i tylny embrionów, ponieważ powinny być one wpychane do otworów w spójnej orientacji, zazwyczaj końcem przednim do góry. Błona witelinowa na końcu przednim charakteryzuje się wyspecjalizowaną strukturą, mikropylem (Rysunek 2), przez który podczas zapłodnienia wnika plemnik.
6. Używając tępego końca igły, można naciskać na embrion, aby przesuwać go po agarze i orientować/manewrować jego końcem tylnym w stronę wykonanego otworu. Następnie naciśnij koniec przedni w kierunku otworu. Powinno to łatwo wsunąć embrion do otworu wzdłuż niewielkiego wgłębienia powstałego podczas nakłuwania. Gdy embrion pochyli się do góry, wciśnij go głębiej do otworu.
7. Po całkowitym wciśnięciu embrion zazwyczaj znajduje się już w pozycji niemal pionowej. Jeśli nie, można go wyrównać, naciskając go z boku. Jeśli otwór nie jest zbyt duży, pozycja embrionu będzie stabilnie utrzymywana przez agar podczas wirowania.
8. Wraz z praktyką możliwe jest osadzenie 100–250 embrionów na jednej płytce. Liczba potrzebnych embrionów zależy od konkretnego zastosowania: jeśli embriony są używane do obrazowania na żywo lub jako donory w eksperymentach transplantacyjnych, wymaganych jest tylko kilka. Jeśli embriony mają zostać utrwalone i poddane immunostainingowi, część z nich zostanie utracona podczas obróbki po wirowaniu, dlatego należy zacząć od większej liczby. Pamiętaj, że embriony nadal się rozwijają podczas montowania, więc jeśli wymagany jest wąski etap rozwoju, całkowity czas montowania musi być jak najkrótszy.
9. Jeśli pozostały jakiekolwiek embriony, które nie zostały osadzone, usuń je z płytki za pomocą zwilżonego pędzelka entomologicznego. Zanurz pędzelek w cieczy (np. 1xTSS), ostrożnie przesuń nim po górnej części płytki (obserwując pod stereomikroskopem), aby zebrać pozostałe embriony, a następnie wypłucz embriony z pędzelka, zanurzając go ponownie w cieczy.

5) Centryfugowanie i odzyskiwanie embrionów

Przegląd: Płytki przenosi się do ruchomych koszy wirówki Sorvall RT7 Plus i wiruje przez 30 min przy 4000 rpm, co odpowiada ~3000 g. Po wirowaniu płytki pokrywa się TSS. Za pomocą igły zarodki wydobywa się z otworów w agarze i przenosi do odpowiednich naczyń przy użyciu pipetora.

Sprzęt:

• Uchwyt do igieł z igłą (jak wcześniej)
• Wirówka Sorvall RT7 Plus z rotorem RTH750 i koszykami wahadłowymi lub odpowiednik ²
• Mikroskop stereoskopowy przystosowany do oświetlenia przechodzącego
• Pipeta P200

Materiały:

• TSS

1. Przenieś płytki do koszy wirowych wirówki, stroną z agarem do dołu. Upewnij się, że wirówka jest odpowiednio wyważona.
2. Parametry wirowania: temperatura = 4-10°C, prędkość = 4000 rpm, czas = 30 min.
3. Po wirowaniu ponownie umieść płytkę z agarem pod mikroskopem sekcyjnym i pokryj ją warstwą TSS.
4. Za pomocą tępego końca igły wygrzeb zarodki z otworów. Będą one unosić się w TSS, pozostając jednak zanurzone.
5. Zarodki będą wykazywać wyraźne warstwowanie, z brązową czapeczką na końcu przednim, przeźroczystym regionem środkowym i ciemną, szarą strefą na końcu tylnym (Rysunek 2, 5A). Odrzuć zarodki, które nie wykazują wyraźnego warstwowania.
6. Używając pipety P200, przenieś odpowiednio uwarstwione zarodki w TSS do nowego naczynia, np. fiolki scyntylacyjnej lub probówki do mikrocentryfugi, w zależności od zastosowania.

6) Dalsza obróbka

W zależności od zastosowania, embriony będą następnie poddawane różnym zabiegom.

1. Do bezpośredniej obserwacji za pomocą mikroskopii w polu jasnym lub epifluorescencyjnej embriony przenosi się w buforze na szkiełko przedmiotowe i montuje pod szkiełkiem zakrywowym o wymiarach 22x22 mm (grubość #1.5), używając szkiełek zakrywowych 18x18 mm (grubość #1) jako dystansów. W przypadku obserwacji długoterminowych może być konieczne zastąpienie buforu olejem halokarbonowym 27.
2. Jeśli embriony mają zostać utrwalone, należy je przenieść w kroku 5.6 do fiolki scyntylacyjnej. Można je następnie utrwalić, stosując standardowe techniki utrwalania¹. Techniki te zazwyczaj wykorzystują wytrząsanie w emulsji heptan-metanol w celu usunięcia błony witellinowej. Należy zauważyć, że w przypadku embrionów centryfugowanych wydajność tego etapu dewitellinizacji jest niska. Zaleca się zatem rozpoczęcie procedury z jak największą, praktyczną liczbą embrionów lub ręczne usunięcie błony witellinowej ¹.
3. Jeśli embriony mają być wykorzystane w eksperymentach z transplantacją (np. w celu usunięcia konkretnej warstwy organelli z embrionów centryfugowanych), przenosi się je na płytki agarowe i montuje na szkiełkach zakrywowych, stosując standardowe procedury analogiczne do tych dla embrionów niecentryfugowanych ³. Warstwowanie wywołane wirowaniem jest stabilne przez kilkanaście minut.

7) Reprezentatywne wyniki

Jeśli wirowanie przebiegło zgodnie z oczekiwaniami, główne organelle embrionalne zostaną rozdzielone według gęstości ². Na przykład krople lipidów o niskiej gęstości zgromadzą się na przednim końcu, a pęcherzyki żółtkowe o wysokiej gęstości na końcu tylnym (Rycina 1, 2). Krople lipidów i pęcherzyki żółtkowe są organellami magazynującymi lipidy oraz białka.

Potwierdzenie stratyfikacji zależnej od gęstości odbywa się poprzez wizualną inspekcję żywych embrionów za pomocą transiluminacji pod mikroskopem stereoskopowym lub złożonym. Embriony powinny wyglądać jak na Rysunku 5A: kropelki lipidów utworzą zwartą brązową warstwę na samym przednim końcu („czapeczka lipidowa”); akumulacja żółtka spowoduje powstanie ciemnoszarej strefy na końcu tylnym. Te dwie ciemne warstwy są oddzielone szeroką, przeźroczystą strefą, która reprezentuje pozostałe organelle i cytoplazmę. Jeśli embriony zostaną odwirowane po celularyzacji, warstwowanie będzie minimalne (Rysunek 5C).

Jeśli dostępny jest mikroskop epifluorescencyjny, te żywe, odwirowane embriony można badać przy wzbudzeniu UV. W tych warunkach żółtko wykazuje intensywną niebieską autofluorescencję (Rycina 5B). Zwarta warstwa materiału autofluorescencyjnego na biegunie tylnym świadczy o pomyślnym odwirowaniu i służy jako marker końca tylnego.

Należy zauważyć, że wygląd tych warstw ulegnie drastycznej zmianie, jeśli embriony zostaną utrwalone. Na przykład, gdy embriony są utrwalane standardową metodą termiczną lub formaldehydową z następującą po niej dewitellinizacją w heptanie i metanolu ¹, krople lipidowe stają się przezroczyste, a warstwa lipidowa w mikroskopii światła białego wydaje się białawą i puszystą, zamiast ciemnobrązowej (Rysunek 5D). Autofluorescencja żółtka zostaje częściowo lub całkowicie zniesiona w wyniku utrwalania, stając się znacznie mniej intensywną lub nawet niewykrywalną.

Jeśli w celu uwydatnienia konkretnego organellum stosowana jest wirowanie in-vivo, pomocne jest oznakowanie tego organellum markerem fluorescencyjnym w celu potwierdzenia. Na przykład opisano białka fuzyjne YFP skierowane do mitochondriów, ER lub aparatu Golgiego ⁴. W wirowanych embrionach markery te gromadzą się w charakterystycznych pozycjach wzdłuż osi przednio-tylnej (Rycina 1). Wreszcie, niektóre białka fuzyjne histonów lokalizują się zarówno w kropelkach lipidowych, jak i w jądrach ², a zatem mogą być używane do znakowania tych przedziałów komórkowych (Rycina 5 E, F) oraz do monitorowania stadium rozwoju embrionu (na podstawie liczby oznakowanych jąder). Linie much wyrażające markery wspomniane w tym akapicie są dostępne w Bloomington Drosophila stock center (http://flystocks.bio.indiana.edu/). Dla histonu H2Av dostępne są warianty GFP oraz mRFP ^{5, 6}

Rysunek 1. Rozdział organelli poprzez wirowanie (modyfikacja na podstawie ²). Wirowanie zorientowanych zarodków prowadzi do wyraźnego rozwarstwienia (światło białe). Główne organelle gromadzą się w charakterystycznych pozycjach wzdłuż osi przedniej (góra) – tylnej (dół): kropelki lipidowe (wykryte w utrwalonych zarodkach za pomocą barwienia Nile Red); retikulum endoplazmatyczne, aparat Golgiego i mitochondria (wykryte w żywych zarodkach za pomocą markerów YFP opisanych w tekście głównym); żółtko (wykryte za pomocą autofluorescencji). Obrazy fluorescencyjne uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Rycina 2. Schematyczne przedstawienie embrionów.

A. Jajo z skorupką i wyraźnymi filamentami jajowymi (wyrostkami grzbietowymi). Ponieważ skorupka jaja nie jest przezroczysta, jajo wydaje się jednolicie ciemne.

B. Jajo z usuniętym chorionem. Na końcu przednim (po lewej) widoczny jest mikropyla. W zależności od stadium rozwoju, zarodek wewnątrz błony żółtkowej będzie wydawał się jednolicie ciemnobrązowy lub wykaże obecność różnych struktur. Przykłady przedstawiono na Ryc. 4.

C. Centryfugowany zarodek, zorientowany zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym opracowaniu. Krople lipidów gromadzą się w postaci brązowej „czapeczki” na końcu z mikropylą; żółtko tworzy szarą warstwę na przeciwnym końcu lub w jego pobliżu.

Rycina 3. Schematyczny opis procedury. Lewo: Zarodki bez błony chorionowej są umieszczane na powierzchni płytki z agarem i wprowadzane igłą do otworów w agarze. Taki montaż zapewnia spójną orientację wszystkich zarodków, z końcami przednimi skierowanymi do góry. Prawo: Po wirowaniu zarodki ulegają rozwarstwieniu. Agar zostaje przykryty TSS (kolor niebieski), a zarodki są wydobywane z agaru za pomocą igły. Po zawieszeniu w TSS zarodki można pobrać za pomocą pipetora.

Rycina 4. Obrazy w świetle przechodzącym żywych zarodków Drosophila, podobne do tych, które będą widoczne w kroku 4.1. Zarodki przedstawiono w standardowej orientacji: koniec przedni po lewej stronie, koniec tylny po prawej, strona grzbietowa u góry, a strona brzuszna u dołu. Film z zapisem czasu (time-lapse) wczesnej embriogenezy jest dostępny jako część materiału wideo towarzyszącego temu protokołowi.

A. Zarodki w stadium podziałów mają jednolity brązowy kolor. Stadia te są idealne do wirowania in-vivo.

B. Zarodki z blastodermą mają wyraźny obrzeż antypodowy, który wygląda podobnie z każdej strony. Ta przejrzysta peryferia wynika częściowo z gromadzenia się jąder przy błonie plazmatycznej, a częściowo z transportu pęcherzyków żółtkowych i kropel lipidowych do wnętrza ⁷. Ta przejrzysta peryferia rozszerza się aż do niemal końca cellularizacji ¹. Zarodki można nadal skutecznie warstwować poprzez wirowanie aż do końca cellularizacji ⁸, choć warstwowanie żółtka i jąder nie jest tak spójne jak w stadiach podziałów.

C. Po cellularizacji zarodki stają się asymetryczne; strony grzbietowa i brzuszna stają się wyraźne, a rozwijają się różne fałdy. Przedstawiony zarodek znajduje się w fazie wczesnego wydłużania pasma zarodkowego. W tych stadiach wirowanie nie jest już skuteczne w warstwowaniu głównych organelli.

Rysunek 5. Odwirowane zarodki. Wszystkie zarodki na tym rysunku zostały odwirowane z końcem przednim skierowanym do góry i są przedstawione w tej orientacji.

A. Obraz w świetle przechodzącym poprawnie odwirowanego zarodka. Brązowa warstwa na samym przednim końcu wynika z gromadzenia się kropli lipidowych. Szeroka szara warstwa w pobliżu końca tylnego wynika z obecności pęcherzyków żółtka. Poniżej warstwy żółtka często występuje przezroczysta strefa o nieznanym pochodzeniu. Powyżej warstwy żółtka często widoczna jest żółtawa strefa; prawdopodobnie reprezentuje ona mitochondria. Białka rozpuszczalne znajdują się w całej przezroczystej warstwie między kroplami lipidowymi a żółtkiem ².

B. Zarodek z punktu A oglądany za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej przy wzbudzeniu UV. Niebieska autofluorescencja charakterystyczna dla żółtka pomaga zidentyfikować koniec tylny.

C. Zarodek odwirowany podczas elongacji pasma zarodkowego, t.j. po celularyzacji. Żółtko może nadal gromadzić się na końcu tylnym, ale poza tym warstwowanie jest minimalne.

D. Poprawnie uwarstwiony zarodek po fiksacji termicznej. Warstwa kropli lipidowych wydaje się biała i puszysta, a nie ciemnobrązowa jak w przypadku zarodków niefiksowanych (A).

E. & F. Zarodki wykazujące ekspresję His2Av-GFP obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej (zmodyfikowane na podstawie ²). E: odwirowane na etapach podziałów; His2Av-GFP wydaje się znakować tylko warstwę kropli lipidowych, ponieważ do tego czasu utworzyło się niewiele jąder. W zależności od płaszczyzny ogniskowania, jądra mogą być widoczne tuż pod warstwą kropli (nie pokazano tutaj). F: odwirowane na etapach blastodermy; His2Av-GFP znakuje zarówno warstwę kropli lipidowych (góra), jak i jądra (w szerokiej strefie poniżej warstwy kropli).

Dyskusja

Kluczowe etapy

Należy upewnić się, że stężenie agaru jest odpowiednio wysokie. Jeśli będzie ono zbyt niskie, agar ulegnie dezintegracji podczas wirowania, a zarodki pękną lub zostaną rozłożone w sposób przypadkowy. Jeżeli stężenie agaru będzie tylko nieznacznie zbyt niskie lub jeśli agar będzie wilgotny (niedostatecznie wysuszony lub z niewystarczająco usuniętym nadmiarem TSS w kroku 4.3), zarodki wypłyną z otworów podczas wirowania i zostaną nieprawidłowo zorientowane. Jeśli agar zostanie nalany zbyt cienką warstwą, może on również zapaść się lub pęknąć podczas wirowania.

Należy upewnić się, że embriony nie przekroczyły stadium cellularizacji. W przeciwnym razie rozdzielenie organelli nie będzie skuteczne (Rys. 5C), ponieważ organelle zostaną uwięzione w tysiącach poszczególnych komórek. W młodszych embrionach na stadium jednej komórki organelle mogą swobodnie migrować na duże odległości i gromadzić się zgodnie ze swoją charakterystyczną gęstością. Aby uniknąć analizy zbyt starych embrionów, należy: (i) przeprowadzić wstępne zbieranie, aby samice zniosły stare jaja (krok 2.4), (ii) zbierać embriony przez maksymalnie 3 godziny (krok 2.5), (iii) wizualnie wybrać embriony przed stadium cellularizacji do zatopienia w agarze (krok 4.2), (iv) skrócić czas zatapiania, aby zapobiec rozwojowi do końca cellularizacji (krok 4.6) oraz (v) odrzucić embriony, które nie ułożyły się prawidłowo w warstwach (krok 5.6).

Nie należy skracać czasu wirowania. Chociaż w niektórych embrionach wyraźne warstwowanie będzie widoczne już po 10 minutach wirowania, stopień separacji jest niespójny w zależności od embrionu. Wirowanie przez 30 min zapewnia wysoce powtarzalne wyniki. Ponadto, im dłuższy czas wirowania, tym dłużej warstwy pozostają stabilne po zakończeniu procesu. Jest to istotne w przypadku zastosowań, w których dalsza obróbka embrionów przed użyciem zajmuje więcej czasu (np. jeśli muszą zostać przygotowane do eksperymentów z transplantacją lub zamontowane do analizy konfokalnej).

Możliwe modyfikacje

Zbiór jaj i usuwanie chorionuIstnieje wiele różnych protokołów dla kroków 2 i 3 ^{1, 3, 9}, które będą równie skuteczne jak opisane tutaj, pod warunkiem, że użyte embriony są młode, wydajność jaj jest wysoka, a odsetek embrionów o błędnie określonym stadium rozwoju jest zminimalizowany.

Wyrównanie w osi przednio-tylnej Protokół orientuje wszystkie embriony w taki sposób, aby koniec tylny był zatopiony w agarze, a koniec przedni skierowany ku górze (Rys. 3). Taka orientacja zapewnia spójność, dzięki czemu możliwe jest wykorzystanie mikropylu jako punktu orientacyjnego wskazującego, który koniec był skierowany do góry podczas wirowania (Rys. 1, 5). Jednak wraz z praktyką łatwo jest określić orientację wirowanych embrionów po charakterystycznym wyglądzie kropel lipidowych i warstw żółtka w mikroskopii w świetle przechodzącym. Dzięki temu możliwe staje się montowanie embrionów dowolnym końcem do góry; taka elastyczność przyspiesza proces montażu.

Wirowanie nieukierunkowane Najbardziej czasochłonnym i wymagającym technicznie etapem protokołu jest osadzanie embrionów w agarze (krok 4). Wymaga ono dwukrotnego dotknięcia każdego embrionu (raz w celu umieszczenia go w otworze i raz w celu jego odzyskania po wirowaniu). Alternatywnie, w kroku 4.1 embriony można przenieść do probówek do mikrocentryfugi wypełnionych TSS. Podczas wirowania tych probówek w mikrocentryfudze (13,000 rpm, 10-30 min), embriony zazwyczaj również ulegają wyraźnemu rozwarstwieniu ^10-13. Ta modyfikacja pozwala na bardzo szybkie przetworzenie setek embrionów jednocześnie. Jednakże rozwarstwienie nie jest tak spójne; u części embrionów nie powstają wyraźne warstwy pomimo znacznie wyższych sił odśrodkowych (~16,000 g) niż stosowane w powyższym protokole. Bardziej problematycznym aspektem jest fakt, że orientacja embrionów jest zmienna i można zaobserwować separację pod różnymi kątami względem głównej osi embrionu. Ta zmienność wymaga od eksperymentatora ustalenia po wirowaniu, w jaki sposób dany embrion był ułożony w probówce wirówki. Przy wykorzystaniu autofluorescencji żółtka jako markera najgęstszej części embrionu jest to często możliwe, choć wymaga to wprawy i większej oceny w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Jeśli w próbce znajduje się wystarczająca liczba embrionów, można wyselekcjonować te przypadki, w których embriony zostały ułożone analogicznie do Fig. 1.

Wirowanie embrionów w skorupce jajowejMożliwe jest osadzenie embrionów w agarze do kroku 4 bez uprzedniego usuwania chorionu ². W tym podejściu embriony na płytce zbierającej są pokryte olejem halowęglowym zamiast 50% wybielacza w kroku 3.2 (olej halowęglowy sprawia, że chorion staje się półprzezroczysty). Wybierane są embriony na odpowiednich stadiach rozwoju, które następnie przenosi się pęsetą na nową płytkę z agarem; aby uniknąć uszkodzenia samego embrionu, pęsetą chwyta się wyłącznie włókna jajowe. Embriony są osadzane zgodnie z krokami 4.4–4.8, tak aby przednie włókna jajowe wystawały z otworu w agarze. Skorupka jajowa jest usuwana poprzez traktowanie 50% wybielaczem po tym, jak embriony zostały odwirowane i wyjęte z agaru zgodnie z krokiem 5.4. Wirowanie w obecności skorupki jajowej może poprawić stopień dewitelinizacji po utrwaleniu (krok 6.2), jednak dobór odpowiednich stadiów do wirowania (krok 4.2) jest trudniejszy.

Zastosowania

Wirowanie zarodków jest szczególnie użyteczne w eksperymentach dotyczących kolokalizacji, t.j. w celu sprawdzenia, czy konkretne białko lokalizuje się w określonym głównym organellum. Na przykład białko Klar występuje w wczesnych embrionalnych kropelkach lipidowych, jednak wykazanie tej lokalizacji w nienaruszonych zarodkach jest trudne. Wynika to częściowo z faktu, że zarówno punkty Klar, jak i kropelki lipidowe są obficie rozmieszczone na obwodzie zarodka ¹⁰, co sprawia, że trudno wykluczyć pozorną kolokalizację. Wirowanie koncentruje jednak kropelki lipidowe w wyraźnej warstwie, dzięki czemu kolokalizacja z sygnałem Klar staje się oczywista ¹⁰.

Podobna analiza jednoznacznie wykazała lokalizację innych białek w kroplach lipidowych ^{8, 13-15}, w tym zaskakujące przykłady, takie jak niektóre histony ², a także przypadki, w których białko występuje powszechnie, ale jest wzbogacone w kroplach lipidowych ⁸. Ponieważ embriony można selekcjonować wizualnie według stadium rozwoju (krok 4.2), możliwe jest nawet wykrycie regulowanej rozwojowo rekrutacji białek do kropli lipidowych ^{8, 15}. Badanie kolokalizacji z kroplami lipidowymi jest szczególnie łatwe, ponieważ krople lipidowe gromadzą się w wizualnie wyraźnej „czapeczce”, zatem do zidentyfikowania tej warstwy nie jest wymagany żaden dodatkowy marker ani barwienie. W rzeczywistości, ze względu na prostotę i potencjalnie uderzające wyniki wizualne (Ryc. 1, Ryc. 5 D, E), nasze laboratorium stosuje obecnie tę technikę rutynowo jako pierwszy test sprawdzający, czy kandydujące białko lokalizuje się w kroplach lipidowych. W zasadzie podobne badania kolokalizacji powinny sprawdzić się w przypadku innych organelli przedstawionych na Ryc. 1, a prawdopodobnie także innych (w tym pasożytów wewnątrzkomórkowych), których rozmieszczenie w odwirowanych embrionach nie zostało jeszcze udokumentowane.

Ponieważ wirowanie koncentruje organelle w wąskich pasmach, ułatwia ono izolację frakcji wzbogaconej w te organelle. Podejście to zostało już wykorzystane do odzyskiwania kropel lipidowych w celu ich transplantacji do embrionów dawców ². Możliwa może być również analiza biochemiczna wzbogaconej frakcji (np. poprzez wycinanie warstw z embrionów po utrwaleniu ¹⁵).

Opisana tutaj metoda znajduje zastosowanie nie tylko w przypadku embrionów Drosophila, ponieważ wirowanie można wykorzystać do stratyfikacji jaj wielu różnych gatunków (w tym żab, nicieni, tunegatów, pierścienic, jeżowców, mięczaków i parzydełkowców) ¹⁶. W naszym laboratorium powyższy protokół zastosowaliśmy dla embrionów muchy domowej Musca domestica ², a wirowanie nieorientowane wykorzystaliśmy w analizie embrionów ziemiórki Sciara coprophila ¹⁷ oraz ślimaka Ilyanassa obsoleta ¹⁷. Co więcej, metoda ta nie ogranicza się wyłącznie do embrionów: wirowanie może być również przydatne do stratyfikacji innych dużych komórek, takich jak oocyty (np. u Drosophila ^{2, 18} oraz pluskwiaka Oncopeltus fasciatus ¹⁷). Dla różnych okazów należy zoptymalizować dokładne warunki wirowania: na przykład 10 minut przy 3000 g jest wystarczające do efektywnej stratyfikacji embrionów Musca domestica ², a przy znacznie dłuższym wirowaniu embriony mają tendencję do rozpadania się podczas fiksacji i immunobarwienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki Petriego 60x15 mm	BD Biosciences	#35-1007	Od Falcon
Sito z drutu	Small Parts, Inc.	CX-0150	stal nierdzewna typ 304; rozmiar oczka #150 x150, średnica drutu: 0.0026 inches
Igły wolframowe	Fine Science Tools	10130-10	0.25 mm
Niklowany uchwyt do pinów/igieł Moria	Fine Science Tools	26016-12
Klatki dla muszek	Genesee Scientific	59-100 lub 59-101	Odpowiednio do szalek Petriego o średnicy 65 mm lub 100 mm
Olej Halocarbon 27	Sigma-Aldrich	H8773