$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem z Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).
UWAGA: W opisanym poniżej protokole opisana jest jedna replika zbierania, trenowania i testowania. W celu zbadania odtwarzalności wyników, kroki te należy powtarzać równolegle, przez wiele dni i z oddzielnymi grupami much (tabela 1). Protokół opiera się na 10-dniowym cyklu życia od jaja do dorosłego osobnika, co jest normalne, gdy muchy są hodowane w stałych warunkach 25 °C, wilgotności 70% i 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Wszystkie aspekty tego protokołu zakładają, że warunki są utrzymywane na stałym poziomie przez cały czas trwania testu. Godziny są wskazywane jako godziny przed włączeniem świateł (BLO) lub po włączeniu świateł (ALO) w inkubatorze, ponieważ można je wygodnie ustawić w zależności od preferowanej pory dnia przez badacza. Gaz CO2 należy stosować tylko do początkowego zbierania naiwnych samców much oraz do zbierania wstępnie pokrytych samic. Ten protokół warunkowania zalotów składa się z następujących kroków:
- Ustanowienie premowanych żeńskich kultur kolekcjonerskich
- Tworzenie kultur do zbierania samców badanych
- Przygotowanie bloków mieszkalnych
- Ustalanie fiolek do krycia do produkcji standaryzowanych wstępnie pokrytych samic
- Zbiór męskich obiektów testowych
- szkolenie
- testowanie
- Analiza danych wideo i statystyki
1. Ustanowienie hodowli premowanych żeńskich
kolekcji
- Przygotuj powerfood. Gotować 0,8% (m/v) agar, 8% (w/v) drożdży, 2% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 2% (w/v) peptonu, 3% (w/v) sacharozy, 6% (w/v) glukozy, 0,05% (w/v)MgSO4 i 0,05% (w/v) CaCl2 w wodzie przez 15 min. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 70 °C przed dodaniem 0,05% (m/v) metyloparenu (UWAGA: toksyczny) i 0,5% (v/v) kwasu propionowego (UWAGA: toksyczny). Dobrze wymieszać, mieszając, schładzając do temperatury 50 °C, aby uzyskać jednorodny roztwór.
- Zanim żywność stwardnieje w temperaturze pokojowej, dodaj ~50 ml powerfood do każdej plastikowej fiolki o pojemności 175 ml. Pozwól żywności jeszcze bardziej ostygnąć. Zamknąć fiolkę zatyczką.
UWAGA: Powerfood to specjalistyczna mieszanka pokarmowa opracowana specjalnie do produkcji dużej liczby much, prawdopodobnie poprzez indukowanie składania jaj. Powerfood nie jest używany do produkcji samców much, które zostaną wykorzystane do analizy zachowania (krok 2), ponieważ nietypowa dieta i potencjalne zatłoczenie mogą wpływać na rozwój.
- W dniu -11 (Tabela 1) rozpocznij 5-20 kultur typu dzikiego z około 60-100 muchami (mieszanką samców i samic) w fiolkach z pokarmem powerfood; zostaną one użyte w kroku 4 do produkcji standaryzowanych wstępnie pokrytych samic. Dodać bibułę filtracyjną do każdej fiolki, aby zwiększyć obszar, na którym larwy mogą się przepoczwarzać; Zwiększy to liczbę much, które mogą się zamknąć.
- Okresowo powtarzaj kroki 1.1-1.3 przez cały czas trwania eksperymentu, aby uzyskać wystarczającą liczbę nowo zamkniętych much jako dane wejściowe do "ustanowienia fiolek krytych do produkcji standaryzowanych samic przed kryciem" (krok 4).
2. Ustanawianie kultur do zbierania męskich obiektów testowych
- Przygotuj normalne jedzenie, wykonane z 0,5% (w/v) agaru, 2,75% (w/v) drożdży, 5,2% (w/v) mąki kukurydzianej, 11% (w/v) cukru, 0,05% (w/v) metyloparabenu i 0,5% (v/v) kwasu propionowego w wodzie, jak opisano w krokach 1.1 i 1.2. Zamknąć plastikowe fiolki o pojemności 175 ml zatyczką na muchę.
- W dniu -10 (Tabela 1) umieścić około 10-20 samców z około 30-75 dziewiczymi samicami (Tabela materiałów/sprzętu) w każdej fiolce o pojemności 175 ml zawierającej normalny pokarm. Dodaj bibułę filtracyjną, aby zwiększyć powierzchnię do przepoczwarzania i zmaksymalizować produktywność.
- Ustalić od trzech do sześciu fiolek po 175 ml na genotyp, aby uzyskać wymaganą liczbę badanych samców.
UWAGA: Może być potrzebnych więcej fiolek, w zależności od produktywności pożądanego genotypu.
3. Przygotowanie bloków mieszkalnych (Rysunek 2A)
- Rozpuść około 50 ml powerfood na blok mieszkalny w kuchence mikrofalowej lub przygotuj go na świeżo.
- Dodaj 500 μl powerfood do każdego dołka 96-dołkowego bloku z płaskim dnem za pomocą pipety z wieloma dozownikami.
- Pozwól żywności zestalić się w temperaturze pokojowej.
- Przykryj bloki folią samoprzylepną do PCR i użyj igły, aby zrobić co najmniej 4 otwory w studzience, aby zapewnić muchom świeże powietrze.
- Aby móc otworzyć każdą studzienkę, użyj żyletki, aby przeciąć folię samoprzylepną wzdłuż między każdym rzędem. Pozostaw folię nienaruszoną na jednym końcu bloku.
- Bloki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 dni.
UWAGA: Przed użyciem pozwól blokom ponownie zrównoważyć się do temperatury pokojowej.
4. Ustanowienie fiolek godowych do produkcji standaryzowanych samic premowanych
- W dniu -1 należy usunąć i wyrzucić wszystkie dorosłe muchy typu dzikiego z premowanych kultur żeńskich kolekcji po 2-5 godzinach BLO.
- Zbierz muchy za pomocą aspiratora (Rysunek 2B) z tych fiolek w odstępach od 2 do 3 godzin (np. po 30 minutach, 2,5 godzinach i 5 godzinach ALO) i umieść je w nowej fiolce powerfood uzupełnionej niewielką ilością pasty drożdżowej i bibuły filtracyjnej.
- Aby uniknąć zatłoczenia i zapewnić optymalną atmosferę godową, nie należy przenosić więcej niż 150-200 much do każdej nowej fiolki. Zapewnij krycie wszystkich samic, zapewniając co najmniej 25% samców. Upewnij się, że w fiolkach do krycia znajduje się wystarczająca ilość samic, aby dostosować się do wielkości eksperymentu.
UWAGA: Ponieważ jest to kluczowy krok w protokole, upewnij się, że do nowej fiolki godowej przenoszone są tylko świeżo zamknięte muchy i żadne stare muchy, larwy ani poczwarki.
- Inkubuj te "fiolki godowe" przez cztery dni, aby zapewnić wszystkim samicom wystarczająco dużo czasu na krycie.
5. Zbiór męskich obiektów testowych
- W dniu 1 (Tabela 1) po 2-3 godzinach BŁO użyj CO2 do usunięcia wszystkich dorosłych much z fiolek do pobierania samców (krok 2), ale pozwól, aby więcej much zamknęło się w ciągu następnych kilku godzin.
- Przez następne 5-6 godzin usuwaj nowo zamknięte muchy co 20-30 minut za pomocą CO2 i umieść każdego samca w osobnej studzience bloku mieszkalnego (krok 3) za pomocą aspiratora (Rysunek 2B).
- Ponownie uszczelnij studzienkę samoprzylepną folią PCR.
UWAGA: Jest to kluczowy krok w protokole. Samce powinny być często zbierane. Zebrane samce należy odizolować w bloku mieszkalnym w pobliżu momentu ekleksji, kiedy wykazują bladą pigmentację i obecność smółki w półprzezroczystym brzuchu.
UWAGA: Delikatne użycie aspiratora pozwala na przenoszenie much; jednak niewłaściwe użycie będzie stresować muchy, powodując różnice w teście (patrz Dyskusja).
- Staraj się zebrać do 48 samców na genotyp. Zapewnia to niewielki nadmiar w stosunku do maksymalnej liczby samców potrzebnych do analizy zarówno warunków naiwnych, jak i wytrenowanych, co pozwala na pewną stratę podczas późniejszych etapów transferu.
6. Szkolenie
- Usunąć muchy z fiolki do krycia (krok 4.2) za pomocą CO2 i oddzielić wstępnie pokryte samice od samców.
- Za pomocą aspiratora dodaj pojedynczą znieczuloną, wstępnie pokrytą samicę do każdej studzienki w jednym rzędzie nowego bloku mieszkalnego.
- Za pomocą aspiratora i bez znieczulenia przenieś indywidualnego naiwnego samca z bloku mieszkalnego ustawionego w kroku 5.2 do studni, w której znajduje się wstępnie pokryta samica. Po umieszczeniu samca w studni należy natychmiast ponownie uszczelnić folią samoprzylepną; Nie pozwól samcowi uciec.
UWAGA: Przenieś samce much z aspiratora do bloku mieszkalnego, wykorzystując ich naturalne zachowanie "negatywnej geotaksji".
- Powtarzaj kroki 6.2-6.3, aż utworzy się wystarczająca liczba par samiec-samica. Najlepiej ustalić 24 pary, dwa pełne rzędy bloku mieszkalnego, na genotyp. Pozostaw pozostałych naiwnych samców w oryginalnym bloku mieszkalnym ustawionym w kroku 5.2.
- Pozostaw pary męsko-żeńskie w spokoju podczas okresu treningu (Tabela 2, Rysunek 1B).
UWAGA: W tym czasie samiec będzie zalecał się i zostanie odrzucony przez samicę przed kryciem. Dla nauki i STM okres szkolenia wynosi 1 h, a dla LTM okres szkolenia wynosi 7-9 godzin.
- Zakończ trening (Tabela 2, Rysunek 1B) za pomocą aspiratora, aby delikatnie oddzielić samca od samicy w parze; nie stosuj znieczulenia. Umieść oddzielonego samca w nowym bloku mieszkalnym.
- Za pomocą aspiratora delikatnie i bez znieczulenia przenieś wszystkich naiwnych samców z bloku mieszkalnego ustawionego w kroku 5.2 do nowego bloku mieszkaniowego.
UWAGA: Ten krok jest opcjonalny dla STM i nauki, ale jest bardzo ważny dla LTM, ponieważ muchy są trzymane przez dodatkowe 24 godziny w celu przetestowania LTM.
- W przypadku STM i LTM pozwól samcom odpocząć odpowiednio przez 1 godzinę i ~24 godziny (Tabela 2, Rysunek 1B) przed badaniem (krok 7).
- Aby się nauczyć, natychmiast przetestuj wyszkolonych i naiwnych mężczyzn (krok 7).
7. Testowanie
- Zebrać muchy z fiolek kryjących (krok 4.2) za pomocą CO2 i oddzielić wstępnie kryte samice od samców.
- Pozwól samicom dojść do siebie po znieczuleniu przez co najmniej 1 godzinę w fiolce zawierającej normalny pokarm.
- Zamontuj magnetowidy z wyprzedzeniem (Rysunek 2C), aby mieć gotowy cały sprzęt przed rozpoczęciem testów.
- Rozpocznij testowanie zgodnie z różnymi harmonogramami uczenia się, STM i LTM (Tabela 2, Rysunek 1B). Testy wykonuj bezpośrednio po treningu do nauki, 1 godzinę po treningu na STM i 24 godziny po treningu na LTM.
- Za pomocą aspiratora delikatnie przenieś pojedynczego samca z bloku mieszkalnego w stanie spoczynku lub z bloku mieszkalnego treningowego, jeśli testowane jest uczenie się (krok 6.7, trenowany; krok 6.8, naiwny) na połowę areny zalotów z zamkniętą przegrodą (Rysunek 2D; zobacz plik S1, aby zapoznać się z planem budynku).
UWAGA: Użycie naturalnego zachowania "negatywnej geotaksji" powinno wystarczyć do przeniesienia samców much z aspiratora na arenę zalotów.
- Szybko, ale delikatnie przesuń otwór wejściowy na następną arenę i powtarzaj krok 7.5, aż na wszystkich 18 arenach pojawi się jeden samiec.
- Używając aspiratora i bez CO2 dodaj jedną wstępnie pokrytą samicę (zebraną w kroku 7.2) do drugiej połowy wszystkich 18 aren.
- Ostrożnie umieść komorę zalotów pod kamerą, tak aby otwory studni były skierowane w dół (Rysunek 2C).
- Usuń przegrodę aren, aby umożliwić bezpośrednią interakcję między samcami a samicami.
- Natychmiast rozpocznij nagrywanie zachowania przez co najmniej 10 minut.
UWAGA: W przypadku korzystania z konfiguracji z dwiema kamerami, równoległe nagrywanie dwóch płyt zalotów może odbywać się w nakładających się na siebie ramach czasowych, aby zmaksymalizować wydajność.
- Opróżnij areny zalotów za pomocą ręcznego odkurzacza i pozwól komnacie zalotów przewietrzyć się przed ponownym użyciem.
- Powtarzaj kroki 7.4-7.11 aż do zakończenia testowania wszystkich genotypów i warunków (tj. naiwnych i wyszkolonych).
8. Analiza i statystyki danych wideo
- Oblicz wskaźnik zalotów (CI), zdefiniowany jako procent czasu, w którym samiec zabiega w ciągu pierwszych 10 minut okresu testowego, dla każdego pojedynczego samca muchy.
UWAGA: Można to zrobić ręcznie, obserwując stereotypowe zachowania związane z zalotami (Rysunek 1A) lub używając oprogramowania komputerowego do automatycznego ilościowego określania zachowań związanych z zalotami.
UWAGA: Zaleca się analizę 40-60 mężczyzn na stan w ciągu trzech dni w celu uzyskania wystarczającej mocy statystycznej i oceny spójności danych CI.
- Oblicz wskaźnik uczenia się (LI), zdefiniowany jako procentowe zmniejszenie średniego CI wyszkolonych mężczyzn w porównaniu z mężczyznami naiwnymi (LI = (CI naiwny –CI wyszkolony) / CInaiwny). Oceń LI dla każdego dnia badania i porównaj go ze skumulowanym LI obliczonym na podstawie wszystkich dni testowych łącznie.
- Utwórz osobny dwukolumnowy plik danych z zakładkami "Genotype" i "CI" jako nagłówkami.
UWAGA: W tych nagłówkach rozróżniana jest wielkość liter. Nazwa genotypu dla każdego CI musi składać się z opisu genotypu, po którym następuje podkreślenie i warunek wytrenowania (np. genotype_N i genotype_LTM itd., gdzie N = naiwny, a LTM = pamięć długotrwała; patrz plik uzupełniający S2 dla przykładu). Ta adnotacja jest niezbędna, ponieważ funkcja analearn zidentyfikuje wyszkolone i naiwne muchy na podstawie znaków obecnych po pierwszym podkreśleniu w kolumnie "Genotyp".
- Użyj skryptu analearn R (plik uzupełniający S3), aby wykonać test randomizacji w celu oceny istotności statystycznej różnic między wartościami LI z różnych genotypów.
- Uźródłow skrypt (plik uzupełniający S3) do języka R, który definiuje funkcję o nazwie "analearn."
UWAGA: Definicja funkcji to: analearn <- function(nboot = 10 000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
- Uruchom funkcję, wpisując "analearn()" w wierszu poleceń języka R i wybierając plik danych do analizy (utworzony w kroku 8.3) za pomocą wyskakującego okienka.
- Wybierz mutację referencyjną, którą jest genotyp kontrolny, wpisując odpowiedni numer i naciskając enter.
UWAGA: Po wybraniu genotypu referencyjnego skrypt potrzebuje kilku sekund, aby wykonać 10 000 replikacji bootstrap .
- Przestrzegać tabeli wyników (Tabela 3), która zawiera genotyp, warunek uczenia się (tj. uczenie się, STM lub LTM), średnią CI niezałożoną, średnią CI wytrenowaną, LI, różnicę między LI w grupie kontrolnej w porównaniu z warunkami doświadczalnymi (LI dif), dolną granicę (LL) i górną granicę (UL) 95% przedziału ufności LI dif, oraz wartość p wskazująca prawdopodobieństwo, że nie ma istotnej różnicy.
UWAGA: analearn zapisze wyjściowy plik tekstowy w katalogu, w którym znajduje się plik z danymi. Jednak tabela wyjściowa pojawia się również w konsoli R-Studio. Nazwa domyślna jest tworzona na podstawie nazwy podanego pliku danych.
- W funkcji analearn znajduje się kilka argumentów, których można użyć do zmiany domyślnych ustawień funkcji w celu dostosowania parametrów bootstrapping.
UWAGA: "nboot" definiuje liczbę replik bootstrap i domyślnie jest ustawiona na 10 000. Tę wartość można zmienić na dowolną liczbę całkowitą większą od zera. W tabeli 5 wymieniono kilka argumentów, których można użyć do zmiany domyślnych ustawień funkcji. Nie zaleca się jednak używania danych utworzonych przy użyciu małej liczby replik bootstrap.
