Analiza poziomu aminacylacji (ładowania) tRNA w skali całego genomu z wykorzystaniem mikromacierzy

Podsumowanie

Opisujemy metodę analizy mikromacierzy służącą do określenia względnych poziomów aminoacylacji wszystkich tRNA z S. cerivisiae.

Streszczenie

Poziomy aminoacylacji tRNA, czyli ich ładowania, mogą gwałtownie zmieniać się wewnątrz komórki w odpowiedzi na środowisko[1]. Zmiany w poziomach ładowania tRNA w komórkach prokariontowych i eukariontowych prowadzą do regulacji translacji, która jest głównym komórkowym mechanizmem odpowiedzi na stres. Znane przykłady to odpowiedź rygorystyczna (stringent response) wE. colior szlak odpowiedzi stresowej Gcn2 u drożdży ([2-6]). Niedawne prace wE. coliiS. cerevisiaewykazali, że wzorce ładowania tRNA są wysoce dynamiczne i zależą od rodzaju stresu, jakiego poddane są komórki [1, 6, 7]. Wysoce dynamiczny i zmienny charakter ładowania tRNA sprawia, że kluczowe jest określenie zmian w poziomach ładowania tRNA w skali genomowej, aby w pełni wyjaśnić odpowiedź komórkową na zmienność środowiskową. W niniejszym przeglądzie przedstawiamy metodę jednoczesnego pomiaru względnych poziomów ładowania wszystkich tRNA wS. cerevisiae Chociaż przedstawiony tutaj protokół dotyczy drożdży, został on z sukcesem zastosowany do wyznaczania względnych poziomów ładowania w szerokim zakresie organizmów, w tymE. colioraz hodowle ludzkich komórek[7, 8].

Protokół

Część 1: Izolacja całkowitego naładowanego tRNA

1. Odwirować komórki w wirówce laboratoryjnej przy 2000 RFC przez 5 minut. Odpowiednik 1 OD₆₀₀ komórek powinien zapewnić co najmniej 1μg całkowitego RNA, a do przeprowadzenia procedury zaleca się minimum 30 μg.
2. Resuspender komórki w roztworze buforu do lizy składającego się z 0,3 M buforowanego octanu Na⁺ (pH 4,5) i 10 mM EDTA. Trzykrotnie mieszać na wortexie z równą objętością fenolu/chloroformu nasyconego octanem Na⁺ (pH 4,5), za każdym razem przez 30 s. Należy pamiętać, aby próbki zawsze przechowywać na lodzie pomiędzy etapami mieszania na wortexie. Buforowany octan można przygotować z NaOAC i HOAc, natomiast fenol/chloroform nasycony octanem można przygotować, mieszając 1 część 5 M buforowanego octanu (pH 4,5) z 9 częściami fenolu/chloroformu.
   Uwaga: izolację całkowitego RNA przeprowadza się w łagodnych warunkach kwasowych i na lodzie, aby uniknąć deacylacji naładowanego tRNA.
3. Wirować przy 18 600 RFC przez 15 minut w temperaturze 4°C. Zebrać warstwę wodną i przeprowadzić kolejną ekstrakcję fenolem/chloroformem nasyconym octanem.
4. Po drugiej ekstrakcji wytrącić RNA, dodając 2,7x objętości etanolu i wirując przy 18 600 RFC przez 30 minut w temperaturze 4°C.
5. Resuspender osad RNA w roztworze buforu do lizy, a następnie ponownie wytrącić etanolem.
6. Na koniec resuspender RNA w roztworze zawierającym 10 mM buforowanego octanu (pH 4,5) i 1 mM EDTA w celu dalszej obróbki. Próbkę można stabilnie przechowywać w temperaturze -80°C przez około dwa tygodnie. Dłuższe przechowywanie nie jest zalecane, ponieważ część naładowanego tRNA zacznie ulegać deacylacji.

Część 2: Przygotowanie standardów tRNA

1. Podgrzać standardy tRNA E. coli o stężeniu 10,5 μM do 85°C w 45 mM Tris-Cl pH 7,5 przez 2 minuty. Wyjąć probówkę i pozostawić w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
2. Dodać MgCl₂ do stężenia końcowego 20 mM i inkubować w 37°C przez 5 minut.
3. Dodać mieszaninę reakcyjną syntetazy tak, aby końcowa reakcja zawierała 5 μM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 3 mM ditiotreitol, 1,5 mM ATP, 1 mM sperminy, 1 mM odpowiedniego aminokwasu oraz 4,2 jednostki/μl mieszaniny aminoacylo-tRNA syntetazy E. coli. Inkubować w 37°C przez 15 minut.
4. Dodać taką samą objętość 0,5 M buforu octanowego (pH 4,5) i przeprowadzić ekstrakcję fenolem/CHCl₃ nasyconym octanem przy pH 4,5.
5. Wytrącić standardy tRNA, dodając 2,7-krotność objętości etanolu, a następnie wirować przy 18 600 RFC przez 30 minut w 4°C.
6. Resuspender standardy w 50 mM buforze octanowym (pH 4,5) z 1 mM EDTA i przechowywać w −80°C do jednego miesiąca.

Część 3: Znakowanie tRNA za pomocą Cy3/Cy5

1. W przypadku próbki naładowanego tRNA inkubuj całkowite RNA o stężeniu 0,1 μg/μl z wzorcami tRNA z E. coli w stężeniu 0,066 μM każdego z nich (tj. 0,67 pmole każdego wzorca na μg całkowitego RNA) oraz w 100 mM buforze octanowym (pH 4,5) w obecności 50 mM NaIO4 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dla kontrolnej próbki całkowitego tRNA zamiast NaIO4 użyj 50 mM NaCl. Pamiętaj, aby RNA rozcieńczać wyłącznie roztworami buforowymi, aby zachować stopień naładowania.
2. Aby zatrzymać reakcję, dodaj glukozę do stężenia 100 mM i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
3. W celu usunięcia pozostałego w próbce NaIO4 przeprowadź wymianę buforu za pomocą kolumny wirówkowej G25. Dla uzyskania najlepszych wyników najpierw zrównoważ kolumnę, przepuszczając przez nią 200 mM bufor octanowy (pH 4,5) przed nałożeniem próbki.
4. Wytrąć próbkę, dodając bufor octanowy (pH 4,5) do końcowego stężenia 133 mM, NaCl do końcowego stężenia 66 mM oraz 2,7-krotność objętości etanolu. Czasami w przypadku próbek utlenionych może być koniejne drugie wytrącanie. Jest to niezbędne tylko wtedy, gdy osad wygląda znacząco inaczej niż osad kontrolny z tej samej próbki, na przykład jest znacznie większy lub bardziej rozproszony. Jeśli wymagane jest ponowne wytrącanie etanolem, przed dodaniem etanolu resuspenduj osad w 50 mM buforze octanowym pH 4,5 i 200 mM NaCl.
5. W celu deacylacji próbki tRNA resuspenduj w 50 mM Tris-HCl (pH 9) i inkubuj w 37 °C przez 30 min. Reakcję neutralizuje się poprzez dodanie równiej objętości 50 mM buforu octanowego (pH 4,5) i 100 mM NaCl. Wytrąć za pomocą 2,7-krotności objętości etanolu. Po wytrąceniu RNA resuspenduj w wodzie do stężenia ~1 μg/μl. Zarówno próbki kontrolne, jak i utlenione, należy poddać elektroforezie na żelach agarozy w celu sprawdzenia jakości RNA.
6. Aby przyłączyć fluorescencyjne tagi oligonukleotydowe do tRNA, 0,1 μg/μl deacylowanego RNA inkubuj w 1x buforze ligazy, 15% DMSO, 4 μM oligonukleotydach zawierających Cy3 lub Cy5, 0,5 jednostek/μl ligazy T4 DNA oraz egzofosfatazie drożdżowej (5 000 jednostek/μl) w 16°C przez noc (powyżej 16 h). Egzofosfataza jest niezbędna tylko dla próbek pochodzących z drożdży i może zostać pominięta, jeśli protokół jest stosowany dla próbek z E. coli lub próbek ludzkich.
7. Po ligacji próbki mieszają się z 4 objętościami 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, a następnie ekstrahuje się je równą objętością fenolu/chloroformu. Po oddzieleniu fazy wodnej preparaty RNA wytrąca się etanolem i resuspenduje w wodzie do stężenia około 0,1 μg/μl.
8. Wydajność ligacji można ocenić, nakładając 5-10% próbek na 12% żele poliakrylamidowe zawierające 7M mocznika i wizualizując je za pomocą fluorescencyjnego skanera żeli. Analiza PAGE jest również przydatna do określenia ilości próbek utlenionych i kontrolnych niezbędnych do hybrydyzacji na mikroarrays. Dobry wynik ligacji powinien wykazywać, że ~10% lub więcej oligonukleotydów zawierających Cy3/Cy5 zostało przyłączonych do tRNA. Dla próbek o dobrej wydajności znakowania do hybrydyzacji na matrycy używa się 0,1-0,5 μg całkowitego RNA na próbkę.

Część 4: Hybrydyzacja i analiza mikromacierzy

1. Przed hybrydyzacją preparaty mikroarray gotuje się w wodzie destylowanej przez 1-2 minuty, aby usunąć nieprzypisane oligonukleotydy.
2. Próbki znakowane Cy3/Cy5 łączy się z 140 μl buforu do hybrydyzacji, DNA z plemni łososia do stężenia końcowego 140 μg/ml oraz poly(A) do stężenia końcowego 70 μg/ml.
3. Program hybrydyzacji (tabela 1) przeprowadza się w automatycznym hybrydyzorze do macierzy. W przypadku pracy z tRNA zdecydowanie zaleca się stosowanie automatycznego urządzenia do hybrydyzacji, ponieważ hybrydyzacja ręczna powoduje wysoki poziom tła.
4. Po zakończeniu programu preparaty należy ręcznie przemyć roztworem Wash 3 co najmniej dwukrotnie, delikatnie wstrząsając je w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przez 3-5 minut.
5. Preparaty można wysuszyć poprzez wirowanie z niską prędkością, poniżej 200 RFC, przez 5-10 minut. Ważne jest, aby przechowywać preparaty w ciemności, ponieważ ekspozycja na światło spowoduje blaknięcie fluoroforów.
6. Po wysuszeniu preparaty należy niezwłocznie zeskanować, aby uzyskać optymalne wyniki; w razie potrzeby można je przechowywać przez kilka dni w suchym, ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej. Preparaty można skanować 2-3 razy bez zauważalnej degradacji jakości obrazu.

Część 5: Reprezentatywne wyniki

W przypadku prawidłowej izolacji próbka całkowitego RNA powinna wykazywać bardzo czyste widmo z ratio OD₂₆₀:OD₂₈₀ bliskim 2. Nie powinno być wykrywalnych zanieczyszczeń białkami ani fenolem. Podczas elektroforezy na 1% żelach agarozowych powinien być widoczny wyraźny prążek tRNA, a inne możliwe prążki kwasów nukleinowych mogą się różnić w zależności od organizmu. Po utlenianiu powinien być widoczny czysty prążek tRNA. Jeśli próbka jest wyraźnie słabsza od pozostałych lub obserwuje się rozmazanie (smearing), próbki nie należy wykorzystywać do mikromacierzy. Mikromacierze powinny charakteryzować się bardzo niskim tłem, o rząd wielkości niższym niż w przypadku najsłabszej sondy tRNA. Wysokie tło wynika zazwyczaj z problemów podczas etapów płukania. Można to zazwyczaj naprawić poprzez przygotowanie świeżych roztworów do płukania oraz dokładne umycie całego sprzętu i przewodów w celu usunięcia pozostałości i osadów SDS.

Krok	Szczegóły
Kondycjonowanie o-ringu	75°C, 2 min
Wprowadzenie próbki	60°C
Denaturacja próbki	90°C, 5 min
Hybrydyzacja	60°C, 16h
Przemywanie 1	50°C, przepływ 10s, utrzymanie 20s
Przemywanie 2	42°C, przepływ 10s, utrzymanie 20s
Przemywanie 3	42°C, przepływ 10s, utrzymanie 20s

Tabela 1: Protokół hybrydyzacji

Dyskusja

Przedstawiamy metodę jednoczesnego oznaczania względnych poziomów naładowania wszystkich tRNA w skali genomowej. Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany dla S. cerevisiae i z sukcesem zastosowano go również do pomiaru profili naładowania tRNA w E. coli oraz w ludzkich kulturach komórkowych. Może on zostać zmodyfikowany w celu dostosowania do dowolnego organizmu o znanych sekwencjach genomu (umożliwiających adnotację wszystkich genów tRNA), pod warunkiem, że możliwe jest uzyskanie całkowitej frakcji naładowanego tRNA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolumny Microspin G-25	GE Healthcare	25-5325-01
E. coli tRNAPhe	Sigma-Aldrich	R3143
E. coli tRNATyr	Sigma-Aldrich	R0258
E. coli tRNALys	Sigma-Aldrich	R6018
E. coli syntetazy aminoacylo-tRNA	Sigma-Aldrich	A3646
Ligaza DNA T4	USB Corp., Affymetrix	70042X
PerfectHyb Plus	Sigma-Aldrich	H-7033
Stacja Hyb4	Digilab
Skaner GenePix 4000B	Axon instruments
GenePix 6.0	Axon instruments