Ten protokół jest fragmentem z Qiang et al., A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).
1. Przygotowanie larw
- Dwa lub więcej dni przed rozpoczęciem testu, należy przeprowadzić krzyżówki pożądanych kombinacji doświadczalnych i kontrolnych (co najmniej 20 samic i 10 samców każda) w naczyniach do składania jaj, jak opisali Wieschaus i Nusslein-Volhard, ale używając 50 ml polipropylenowych zlewek i jednorazowych szalek Petriego o średnicy 6,0 cm zawierających agar winogronowy i posmarowanych pastą drożdżową tuż przed użyciem. Trzymaj muchy w naczyniach do składania jaj w ciemności w temperaturze pokojowej, aż będą potrzebne.
- Przepis na agar winogronowy – połącz 100 ml mrożonego 100% koncentratu soku winogronowego, 350 ml wody dejoinizowanej, 5 ml octu lodowcowego i 13 g agaru D. melanogaster w szklanej zlewce o pojemności 1 l. Kuchenka mikrofalowa w 1-2 minutowych seriach, mieszając między seriami, aż agar się rozpuści. Schłodzić roztwór przez kilka minut, a następnie dodać 10 ml 10% (w/v) Nipagenu (p-hydroksybenzoesanu metylu) do 95% etanolu. Wymieszać, a następnie pipetować 7 ml na płytkę do jednorazowych szalek Petriego o średnicy 6,0 cm, pozostawić do zżelowania i wyschnąć w temperaturze pokojowej przez 3-4 godziny. Przechowywać w temperaturze 4 °C w plastikowych torebkach.
- Przepis na pastę drożdżową – 7 g suszonych drożdży, 10 ml wody dejonizowanej, wymieszać szpatułką do uzyskania jednolitej konsystencji.
- Czasowe pobieranie jaj w celu wygenerowania larw doświadczalnych i kontrolnych. Używając nowych, posmarowanych drożdżami talerzy winogronowych, zbieraj jajka w temperaturze pokojowej przez 4 godziny w ciemności w godzinach porannych. Wyjmij te 4-godzinne płytki zbiorcze i zastąp je świeżymi. Inkubować 4-godzinne płytki zbiorcze przez noc w temperaturze 25 °C do popołudnia następnego dnia, kiedy to wykluje się większość larw. Zbierz te pierwsze larwy w stadium rozwojowym i użyj ich do przygotowania eksperymentu.
2. Ustawianie płytek testowych
- Przygotowanie płytek testowych. Do pojedynczego cyklu testu należy przygotować pięć płytek testowych, z których każda zawiera 10 larw doświadczalnych i pięć płytek zawierających 10 larw kontrolnych. Użyj świdra korkowego o średnicy 1,5 cm, aby usunąć środkowy rdzeń agaru z każdej płytki, tworząc otwór na żywność. Do dołka wsypujemy pastę drożdżową (0,8 - 0,9 g) i delikatnie wklepujemy szpatułką, aby usypać kopczyk wypełniający otwór.
- Przygotowanie płytki agarowej – połączyć 700 ml wody dejonizowanej z 16 g agaru D. melanogaster w szklanej zlewce o pojemności 2 litrów i podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 5 minut. Wyjmij z kuchenki mikrofalowej i wymieszaj szklaną pałeczką, aby wprowadzić nierozpuszczony agar do roztworu. Dodaj 17,5 ml 10% (w/v) Nipagen do 95% etanolu, wymieszaj, a następnie kontynuuj ogrzewanie mikrofalowe w 30-sekundowych seriach, a następnie mieszaj, aż cały agar całkowicie się rozpuści. Schłodzić przez minutę lub dwie, a następnie odpipetować 15 ml porcji na 10 cm plastikowe szalki Petriego. Pozwól agarowi się zżelować, przykryj płytki pokrywkami i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez kilka godzin lub na noc. Przechowywać talerze w szczelnie zamkniętych plastikowych torebkach w temperaturze 18 °C.
UWAGA 1: Aby uniknąć tworzenia się kryształów Nipagen na powierzchni płytek z powodu nadmiernego wysuszenia, należy użyć płytek w ciągu kilku dni od przygotowania. W razie potrzeby kryształy można ponownie rozpuścić, upuszczając na nie kilka mikrolitrów 95% alkoholu.
UWAGA 2: partie agaru mogą mieć różne właściwości żelujące. Suche płytki żelowe powinny być twarde w dotyku i wystarczająco sprężyste, aby można było usunąć czysty, nienaruszony krąg agaru podczas używania świdra korkowego do tworzenia otworu na żywność (patrz wyżej).
- Umieszczanie larw na płytkach testowych. Użyj mechanicznego nacisku, aby wygiąć końcówkę plastikowej mikroszpatułki i zanurz końcówkę w paście drożdżowej, aby zapewnić "klej" do zbierania larw. Podnieś pojedynczo pierwsze larwy w stadium rozwojowym i umieść je na talerzu agarowym w pobliżu kopca żywności. Przygotować co najmniej pięć powtórzonych płytek po 10 larw zarówno dla genotypów doświadczalnych, jak i kontrolnych. Po zakończeniu nakryj i oznacz każdą płytkę, a następnie umieść płytki (pokrywką do góry) w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej (w naszym laboratorium jest to 22 °C).
3. Płytki do badań monitorujących
- Codziennie badaj płytki pod mikroskopem preparacyjnym i zapisuj liczbę larw na wierzchu pokarmu lub na powierzchni agaru. Zwróć uwagę na wszelkie widoczne martwe lub umierające larwy. Zwróć uwagę, kiedy i czy tunelowanie w podłożu agaru jest widoczne, gdy larwy przemieszczają się do trzeciego stadium rozwojowego. Zanotuj daty, w których poczwarki zaczynają się formować i odnotuj wszelkie nieprawidłowości poczwarki. Kontynuuj codzienne obserwacje, aż wszystkie larwy umrą lub przepoczwarzą się.
- Ostrożnie usuń poczwarki z talerza za pomocą wygiętej igły do drażnienia i przenieś na talerz winogronowy. W razie potrzeby kontynuuj monitorowanie poczwarek, aby określić, ile z nich zamyka się jako dorosłe osobniki.
