Drosophila Wyimaginowana sekcja dysku larwy: metoda obserwacji rozwijającego się nabłonka

Streszczenie

Źródło: Morimoto, K. i Tamori, Y. Indukcja i diagnostyka nowotworów w nabłonku krążka międzykręgowego Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Podczas barwienia wyimaginowanych krążków Drosophila, często przeprowadza się zgrubną sekcję, podczas której dyski są odsłonięte, ale pozostają przyczepione do ciała. Po zabarwieniu interesujące dyski są izolowane i montowane. Przykładowy protokół demonstruje procedurę wyimaginowanego rozwarstwienia i montażu dysku skrzydłowego.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem artykułu Morimoto i Tamori, Indukcja i diagnoza nowotworów u nabłonka krążka międzykręgowego Drosophila, J. Vis. Exp. (2017).

1. Sekcja larw

1. Zebrać wędrujące larwy trzeciego stadium za pomocą drewnianego patyczka lub kleszczy, genotypować je za pomocą odpowiednich markerów fluorescencyjnych (np. EGFP) pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym i umieścić w naczyniu separacyjnym z PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
2. Przemyć larwy w PBS, pipetując za pomocą plastikowych pipet transferowych o pojemności 2 ml.
3. Ściśnij środek larwy jednym kleszczem i rozerwij ciało na pół drugimi kleszczami.
4. Ściśnij haczyk na usta przedniej połowy jednym kleszczem i popchnij usta w kierunku ciała drugimi kleszczami, aby wywrócić ciało na lewą stronę.
5. Usuń zbędne materiały, takie jak gruczoły ślinowe lub ciała tłuszczowe za pomocą kleszczy.

2. Utrwalanie i barwienie przeciwciał

1. Przenieś wypreparowaną przednią połowę ciała larwy (w tym wyimaginowane krążki skrzydeł) do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml i umieść w 1 ml roztworu Fix (4% formaldehydu w PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności z delikatnym obracaniem.
   ostrożność: Formaldehyd jest toksyczny i ma potencjał rakotwórczy. Nosić rękawice i odzież ochronną, aby zapobiec kontaktowi ze skórą.
   UWAGA: W tej części wszystkie kroki odbywają się na nutatorze w temperaturze pokojowej w ciemności, chyba że zaznaczono inaczej.
2. Usuń roztwór Fix i wyrzuć. Umyj chusteczki 1 ml PBT (0,3% Triton X-100 w PBS) trzy razy przez 15 minut każda.
3. Usunąć PBT i dodać 1 ml PBTG (0,2% albuminy surowicy bydlęcej i 5% normalnej surowicy koziej w PBT) w celu zablokowania i nutacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Usunąć PBTG i dodać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała odpowiednio rozcieńczony PBTG (patrz Tabela Materiałów) i nutować przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć tkanki 1 ml PBT trzy razy przez 15 minut każda.
6. Usunąć PBT i dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała odpowiednio rozcieńczony PBTG (1:400). Nutować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
7. Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć tkanki 1 ml PBT dwa razy przez 15 minut każda.
8. Aby zabarwić F-aktynę, usuń PBT i dodaj roztwór falloidyny odpowiednio rozcieńczony w PBS (1:40). Następnie nutuj przez 20 min. Usuń roztwór falloidyny i przemyj tkanki 1 ml PBT dwa razy przez 15 minut każda.
9. Aby przeciwdziałać barwieniu jądrowego DNA, usuń PBT i dodaj roztwór DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindolowy) (0,5 μg/ml DAPI w PBS). Następnie nutować 10 min.
   ostrożność: DAPI ma potencjał rakotwórczy. Nosić rękawice i odzież ochronną, aby zapobiec kontaktowi ze skórą.
10. Usuń roztwór DAPI i przemyj chusteczki 1 ml PBT dwa razy przez 15 minut każda.
11. Płukać raz w 1 ml PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
12. Usunąć PBS i dodać 500 μl 100 % glicerolu jako pożywkę do wstępnego montażu.

3. Montaż na szkiełkach mikroskopowych

1. Umieść poplamione tkanki na szkiełku mikroskopowym za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 2 ml.
2. Przenieś tkanki do kropli podłoża montażowego na innym szkiełku mikroskopowym za pomocą kleszczy.
3. Przytrzymaj koniec wypreparowanej tkanki jednym kleszczem, a drugimi odciągnij krążki czułków mózgowych i ocznych.
   UWAGA: Trzymaj wypreparowane mózgi, aby umieścić je w pobliżu wyimaginowanych dysków skrzydeł. Mózg działa jak platforma, która zapobiega zmiażdżeniu przez szkiełko nakrywkowe wyimaginowanych dysków skrzydłowych.
4. Aby wyizolować wyimaginowane dyski skrzydła, przytrzymaj koniec wypreparowanej tkanki jednym kleszczem i delikatnie podrap ścianę ciała, a drugą kleszczami oderwij krążki.
   UWAGA: Jeśli trudno jest znaleźć dyski urojone skrzydeł, oderwij tchawicę od tylnej do przedniej strony. Dyski imaginalne skrzydeł przyklejają się do tchawicy.
5. Delikatnie przykryć wyimaginowane krążki szkiełkiem nakrywkowym i zapieczętować lakierem do paznokci; przechowywać w temperaturze 4 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Wako	Nr kat. 162-19321
Silnik TritonX-100	Wako	168-11805
Formaldehyd	Wako	Numer katalogowy: 064-00406
albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A7906
normalna kozia surowica	Sigma	Klasa g6767
medium montażowe, Vectashield	Laboratoria wektorowe	H-1000
DAPI (interfejs DAPI)	Sigma	Zobacz materiał D9542
mysz-anty-Dlg 4F3	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	Antydyski 4F3 duże, RRID:AB_528203	rozcieńczony w PBTG, 1:40
mysz-anty-MMP1	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	3A6B4, RRID:AB_579780	3 zmieszane w stosunku 1:1:1 i rozcieńczone w PBTG, 1:40
mysz-anty-MMP1	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	3B8D12, RRID:AB_579781	3 zmieszane w stosunku 1:1:1 i rozcieńczone w PBTG, 1:40
mysz-anty-MMP1	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	5H7B11, RRID:AB_579779	3 zmieszane w stosunku 1:1:1 i rozcieńczone w PBTG, 1:40
mysia anty-atubulina	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	AA4.3, RRID:AB_579793	rozcieńczyć w PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Falloidyna	Sondy molekularne	A22283	rozcieńczyć w PBS, 1:40
kozie przeciwciało anty-mysie IgG, Alexa Fluor 546	Sondy molekularne	A11030	rozcieńczony w PBTG, 1:400
Szczepy much
sd-Gal4	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	Numer katalogowy #8609	w połączeniu z UAS-EGFP
upd-Gal4 (wersja angielska)	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	#26796	w połączeniu z UAS-EGFP
Bezzałogowy statek powietrzny-lgl-RNAi	Wiedeńskie centrum RNAi Drosophila	#51247
UAS-skryba-RNAi	Wiedeńskie centrum RNAi Drosophila	#105412
Bezzałogowy statek powietrzny-RasV12	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	#64196
Samolot UAS-Yki3SA	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	#28817
hsFLP (Protokół HSFLP)	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	#6
Act>CD2>GAL4 (rozkładany GAL4)	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	#4780	w połączeniu z UAS-EGFP
Bezzałogowy statek powietrzny-EGFP	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	#5428	Chromosom X
Bezzałogowy statek powietrzny-EGFP	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	#6658	Trzeci chromosom
UAS-Dicer2	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	#24650	Drugi chromosom
UAS-Dicer2	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	#24651	Trzeci chromosom
vkg-GFP (Protokół vkg-GFP)	Morin i wsp. 2001		Pułapka białkowa GFP