Ten protokół jest fragmentem z Immarigeon et al., Protokół oparty na FACS do izolacji RNA z wtórnych komórek męskich gruczołów dodatkowych Drosophila, J. Vis. Exp. (2019).
1. Rozwiązania i przygotowanie materiałów
- Przygotuj następujące rozwiązania.
- Przygotuj pożywkę uzupełnianą surowicą (SSM): Pożywka Drosophila Schneidera uzupełniona 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną.
- Przygotuj porcje 1x enzymu trypsyny (np. TrypLE Express Enzyme) i przechowuj w temperaturze pokojowej.
- Przygotować porcje papainy [50 j./ml] (przechowywane w temperaturze -20 °C i rozmrożone tylko raz).
- Przygotować 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS, przechowywany w temperaturze pokojowej).
- Przygotuj wiele zaokrąglonych końcówek pipet do fizycznej dysocjacji gruczołów dodatkowych.
UWAGA: Do obsługi dławików dodatkowych należy używać końcówek o niskiej retencji, ponieważ mają one tendencję do przylegania do nieobrobionego plastiku. Proces zaokrąglania płomieniem zmniejsza otwór końcówki i wygładza krawędzie końcówki. Zapewnia to skuteczną dysocjację po trawieniu peptydazy bez ścinania błon komórkowych.
- Odetnij jedną końcówkę o pojemności 200 μl ostrym ostrzem i delikatnie przełóż ją nad płomieniem, aby zaokrąglić jej końcówkę tak, aby otwór był szerszy, ale gładki do obsługi w kroku 2.7.
- Zawęź otwór wielu końcówek o pojemności 1,000 μl, przesuwając otwór końcówki w pobliżu płomienia na mniej niż jedną sekundę. Lekko obróć końcówkę, aby uniknąć nadmiernego stopienia lub zatkania. Posortuj końcówki od węższych do szerszych. Można to zrobić, mierząc czas prędkości aspiracji. Spróbuj oddzielić próbkę AG na małą skalę, aby przetestować skuteczność najwęższych końcówek.
UWAGA: Te końcówki mają kluczowe znaczenie dla mieszania mechanicznego. Wysokiej jakości, zaokrąglone końcówki pipet pozwalają na całkowitą dysocjację przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek. W związku z tym końcówki te są dokładnie myte wodą pod koniec procedury w celu ponownego użycia. Pozwala to na powtarzalną dysocjację z dnia na dzień.
2. Rozwarstwienie gruczołów dodatkowych
- Umieść 20 do 25 samców Drosophila w szklanym naczyniu na lodzie.
- Wypreparuj 1 samca w SSM. Zdejmij jego układ rozrodczy i oczyść dodatkową parę gruczołów ze wszystkich innych tkanek poza przewodem wytryskowym.
UWAGA: Usuń jądra, ponieważ uwolnione plemniki mogą tworzyć grudki i zakłócać proces dysocjacji. Wyjmij bańkę wytrysku, która utrudnia obsługę, gdy unosi się na wodzie.
- Za pomocą kleszczy przenieś dławiki pomocnicze na szklaną płytkę wypełnioną SSM w temperaturze pokojowej. Powtórz kroki 2.2-2.3 20 razy, aby uzyskać partię 20 par gruczołów w SSM.
UWAGA: Kroki te zostaną osiągnięte w ciągu 15 do 20 minut. AG powinny wyglądać zdrowo, a ruchy perystaltyczne warstwy mięśniowej wokół gruczołów powinny być widoczne. GFP można monitorować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
- Przenieś dodatkowe dławiki do 1x PBS na 1-2 minutowe pranie w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Aby uzyskać lepszą dysocjację, konieczne jest przepłukanie gruczołów PBS. Czas trwania tego etapu powinien być jednak ograniczony, ponieważ komórki wykazują oznaki stresu w PBS; zdysocjowane komórki wtórne w PBS szybko pęcznieją i umierają.
- Rozcieńczyć 20 μl papainy [50 U/ml] w 180 μl 1x enzymu trypsyny, aby uzyskać roztwór dysocjacyjny (w celu zwiększenia lub zmniejszenia należy zachować 9 μl enzymu trypsyny i 1 μl papainy dla każdego mężczyzny). Za pomocą kleszczy przenieś dławiki dodatkowe do tego roztworu.
- Odizoluj końcówkę gruczołów dodatkowych (zawierających komórki wtórne) od części proksymalnej. Użyj cienkich kleszczy, aby mocno uszczypnąć środek płata gruczołowego i przeciąć ostrą końcówką drugiego płata kleszkowego. Usuń proksymalną część gruczołów dodatkowych i przewód wytryskowy, aby poprawić dysocjację i skrócić czas sortowania komórek.
UWAGA: Wypreparowanie dystalnej części z 20 par gruczołów zajmie od 15 do 20 minut, a zatem trawienie przez peptydazy rozpocznie się w temperaturze pokojowej.
- Po wycięciu wszystkich końcówek gruczołów przenieś je do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą specjalnej końcówki do pipety o pojemności 200 μl, przygotowanej w kroku 1.2.1. Powinien być szeroki, zaokrąglony i mokry przed kontaktem z gruczołami.
UWAGA: Aby odpipetować tkankę dodatkowego gruczołu, końcówki powinny być zawsze wstępnie zwilżone odpowiednim roztworem (enzymem trypsyny lub SSM, w tym celu należy zachować jedną tubkę każdego z nich). Ostrożnie przepłucz końcówki między próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia.