Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Rozwarstwienie jajników: technika przygotowania tkanek ex vivo

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Parker, D. J., et al. Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film opisuje ogólną anatomię jajnika Drosophila i przedstawia metodę preparowania jajników do obrazowania na żywo lub stałego.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem z Parker et al., Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila, J. Vis. Exp. (2017).

1. Przygotowanie Drosophila (wymagane narzędzia są przedstawione w Rysunek 1A)

W każdym z opisanych eksperymentów należy zebrać Drosophila (utrzymywane w temperaturze pokojowej lub 25 °C) w ciągu 5 dni od zaniku i umieścić je w fiolce wypełnionej 5 - 7 ml pokarmu dla Drosophila (patrz Tabela Materiałów), z nie więcej niż 25 muchami w każdej fiolce; utrzymuj stosunek samic do samców wynoszący 2:1.
Posyp niewielką ilością drożdży granulowanych, aby pobudzić produkcję jaj Drosophila. Wykonaj eksperymentalną manipulację w ciągu 2 - 4 dni.

2. Sekcja jajników Drosophila (wymagane narzędzia są przedstawione w Rysunek 1A)

Ciepłe podłoże do preparowania owadów (patrz tabela materiałów) do temperatury pokojowej, 25 °C. Napełnić trzy dołki ośmiodołkowego szklanego naczynia sekcyjnego 200 μl pożywki w każdym dołku.
Znieczulić Drosophila _CO2, umieszczając igłę pistoletu do przedmuchiwania pod zatyczką fiolki. Umieść je na podkładce muchowej. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego posortuj 5 samic i umieść je w pierwszym dołku naczynia preparacyjnego. Dotykaj jednej Drosophila na raz podczas wykonywania mikroskopii na żywo.
Patrząc przez okular mikroskopu preparacyjnego, odetnij klatkę piersiową od brzucha za pomocą dwóch par kleszczy. Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś brzuchy do drugiej studzienki naczynia.
Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać brzuch na tylnym końcu i powoli wypchnij jajniki (wraz z drugą zawartością brzuszną) drugą parą kleszczy. Jeśli ta próba się nie powiedzie, ostrożnie usuń egzoszkielet brzuszny, wkładając kleszcze do przedniego końca, aby uwolnić jajniki.
Za pomocą kleszczy przytrzymaj pojedynczy jajnik za nieprzezroczysty tylny koniec (tj. wypełnione żółtkiem, jaja w późnym stadium) i ostrożnie przenieś go do trzeciego dołka naczynia w celu drażnienia, przetworzenia go do mikroskopii na żywo lub do utrwalenia w celu przeprowadzenia barwienia immunologicznego.
Ostrożnie drażnij osłonkę ochronną wokół jajników, lekko przesuwając igłę drażniącą od tylnego do przedniego końca każdego jajnika, jednocześnie trzymając ją za tylny koniec parą kleszczy.
UWAGA: Aby zminimalizować uszkodzenia podczas drażnienia, zegnij końcówkę igły i powiększ każdy jajnik, zwiększając powiększenie mikroskopu (Rysunek 1A). Dokuczanie powinno być wystarczająco skuteczne, aby złamać osłonkę, ale powinno być również wykonane ostrożnie, aby zachować integralność jajników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1: Plan eksperymentalny i przygotowanie. (A) Narzędzia stosowane w opisanych metodach: A. Fiolka muchowa; B. Podłoże do preparowania owadów; C. Paraformaldehyd; D. Pędzel muchowy; E. Naczynie preparacyjne; F. Szkło nakrywkowe; G. Rurka do mikrofuge. H. Naczynie ze szklanym dnem; I. Zjeżdżalnia szklana; J. Mikropipeta 1 000 μl; K. Mikropipeta 200 μL; L. Mikropipeta 2,5 μL; M. Igł...