Ten protokół jest fragmentem z Bovier et al., Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).
1. Przygotowanie posiłków
- Do utrzymania stada i wzrostu larw należy użyć pożywki z mąki kukurydzianej zawierającej 3% drożdży w proszku, 10% sacharozy, 9% wstępnie ugotowanej mąki kukurydzianej, 0,4% agaru, zwanej dalej pożywką z mąki kukurydzianej (CM).
- Wsyp 30 g drożdży do 100 ml wody z kranu, doprowadź do wrzenia i gotuj przez 15 minut.
- Oddzielnie dobrze wymieszaj 90 g wstępnie ugotowanej mąki kukurydzianej, 100 g cukru i 4 g agaru z 900 ml wody z kranu.
- Doprowadź roztwór do wrzenia, zmniejsz ogień i gotuj przez 5 minut, ciągle mieszając.
- Po 5 minutach dodaj gorący roztwór drożdży i gotuj na wolnym ogniu przez kolejne 15 minut.
- Wyłączyć źródło ciepła i pozostawić roztwór do ostygnięcia do około 60 °C.
- Dodać 5 ml/l 10% 4-hydroksybenzoesanu metylu do etanolu, dokładnie wymieszać i odstawić na 10 min.
UWAGA: Należy uważać na ilość 4-hydroksybenzoesanu metylu, ponieważ wysokie stężenie fungicydu może być śmiertelne dla larw.
- Dozować pożywkę do fiolek/butelek: 8 ml do każdej fiolki na muchy (25 mm x 95 mm), 3 ml do każdej fiolki na muchy (22 mm x 63 mm) i 60 ml do każdej butelki na muchy (250 ml).
- Przykryj fiolki gazą i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT) przez 24 godziny przed przechowywaniem.
- Skalibruj eksperymentalnie odpowiednią konsystencję i uwodnienie CM, modyfikując ilość użytego agaru i/lub czas chłodzenia/suszenia.
UWAGA: odłączone, pudełkowe i opakowane fiolki są stabilne przez około 15 dni w temperaturze 4 °C.
- W przypadku dorosłych osobników Drosophila należy użyć pożywki zawierającej 10% drożdży w proszku, 10% sacharozy, 2% agaru, zwanej dalej pożywką dla dorosłych (AM).
- Wymieszaj 10 g drożdży w proszku, 10 g sacharozy, 2 g agaru ze 100 ml wody destylowanej.
- Doprowadź tę mieszaninę do wrzenia dwa razy, w odstępie 3 minut, lub do momentu rozpuszczenia agaru, za pomocą kuchenki mikrofalowej.
- Gdy roztwór ostygnie do 60 °C, dodać 5 ml/l 10% 4-hydroksybenzoesanu metylu do etanolu, dokładnie wymieszać i rozlać do fiolek (10 ml na fiolkę).
- Przykryj fiolki gazą i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 24 godziny przed przechowywaniem.
UWAGA: odłączone, pudełkowe i opakowane fiolki są stabilne przez około 15 dni w temperaturze 4 °C.
2. Dawkowanie Drosophila EDC
- Przygotować odpowiedni roztwór podstawowy, rozpuszczając wybrane EDC w odpowiednim rozpuszczalniku. Dla EE2 (masa cząsteczkowa 296,403) rozpuścić 1,48 g w 10 ml 100% etanolu, aby uzyskać 0,5 M roztwór podstawowy i przechowywać w temperaturze -80 °C.
ostrożność: EDC są uważane za zanieczyszczenia środowiska i należy zachować środki ostrożności podczas obchodzenia się z nimi.
- Rozcieńczyć roztwór podstawowy EE2 w 10% etanolu w wodzie (v/v) w celu uzyskania roztworu o stężeniu 100 mM. Następne rozcieńczenia (0,1 mM, 0,5 mM i 1 mM) w żywności CM, zaczynając od najniższego stężenia i stosując to samo końcowe stężenie rozpuszczalnika dla każdej grupy poddanej działaniu substancji. Do fiolek kontrolnych należy użyć tej samej objętości samego rozpuszczalnika.
UWAGA: zaleca się, aby końcowe stężenie rozpuszczalnika było jak najniższe, pamiętając, że końcowe stężenie etanolu nie powinno przekraczać 2% w pokarmie dla much.
- Dodać roztwór zawierający odpowiednie rozcieńczenie wybranego EDC do żywności na bazie mąki kukurydzianej przed zestaleniem, dokładnie wymieszać robotem kuchennym, rozlać 10 ml do fiolek, przykryć gazą bawełnianą i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 16 godzin przed użyciem.
UWAGA: użyj tego medium natychmiast po jego przygotowaniu.
- Dla odchowu osobników dorosłych należy przygotować różne robocze roztwory EE2 (odpowiednio 10 mM, 50 mM i 100 mM) w 10% etanolu w wodzie (v/v) i nałożyć 100 μl każdego z nich na powierzchnię AM, w celu uzyskania pożądanego stężenia EE2 (0,1 mM, 0,5 mM i 1 mM). Do kontroli należy użyć tej samej objętości samego rozpuszczalnika.
UWAGA: alternatywnie, dodaj roztwór zawierający odpowiednie rozcieńczenie wybranego EDC do małej ilości AM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, dokładnie zwiruj i rozwarstwij 1 ml na powierzchni fiolek AM.
- Przykryj fiolki bawełnianą gazą, pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 12-16 godzin pod delikatnym mieszaniem i natychmiast zużyj.
UWAGA: proces suszenia powinien być dostosowany eksperymentalnie, ponieważ zależy od wilgotności otoczenia.
3. Hodowla much
- Użyj wytrzymałego szczepu izogenicznego, takiego jak Oregon R, utrzymywanego przez kilka generacji w laboratorium.
- Muchy należy trzymać w wilgotnym inkubatorze o kontrolowanej temperaturze, z naturalnym fotoperiodem 12 godzin światła: 12 godzin ciemnego światła w temperaturze 25 °C w fiolkach zawierających pokarm CM.
- W każdym teście należy używać fiolek o temperaturze pokojowej.
4. Protokół długości życia
- Ustawić 20 fiolek much z 8 samicami i 4 samcami i trzymać w temperaturze 25 °C w CM (10 ml każda).
- Po 4 dniach wyrzuć muchy i umieść fiolki z powrotem w inkubatorze.
UWAGA: te muchy mogą być użyte do ponownego rozpoczęcia w celu uzyskania innych kohort much zsynchronizowanych pod względem wieku.
- Późnym popołudniem dnia 9 należy wyjąć wszystkie nowo zamknięte muchy z fiolek i umieścić je z powrotem w inkubatorze.
UWAGA: kilka dorosłych powinno zacząć się zamykać już dziewiątego dnia; Odrzucenie tych much pozwala na zebranie maksymalnej liczby zsynchronizowanych much, unikając nieostrożnej selekcji wcześnie wschodzących.
- 16-24 godziny później przenieś dorosłe muchy (1 dzień) obu płci do czterech grup butelek o pojemności 250 ml zawierających pokarm AM uzupełniony trzema różnymi stężeniami EDC i jednym z samym rozpuszczalnikiem. W razie potrzeby zbierz kolejną partię następnego dnia.
- Utrzymuj muchy w temperaturze 25 °C przez 2-3 dni, aby umożliwić im kopulację.
UWAGA: dzień przeniesienia do fiolek z jedzeniem AM odpowiada pierwszemu dniu dorosłości.
- Po dwóch-trzech dniach posortuj każdą kohortę much według płci na dwie grupy w lekkim znieczuleniu CO2. Losowo podzielić każdą płeć na pięć fiolek na dawkę w gęstości 20 osobników na fiolkę, aż na każdą dawkę przypadną trzy powtórzone po 5 równoległych fiolek dla każdej płci.
UWAGA: Pracuj z małymi grupami much, aby zapobiec ewentualnym długotrwałym problemom zdrowotnym spowodowanym długim czasem ekspozycji na CO2 .
- Przygotuj arkusz kalkulacyjny długości życia, w którym liczba martwych much jest odejmowana od liczby much, które przeżyły do poprzedniego transferu, w taki sposób, aby automatycznie uzyskać liczbę ocalałych przy każdym transferze.
- Przenieść muchy do nowych fiolek zawierających odpowiedni pokarm co 3 dni o tej samej porze i sprawdzić, czy nie padły.
UWAGA: transfer musi odbyć się bez znieczulenia, które mogłoby mieć długoterminowy negatywny wpływ na długowieczność much.
- Przy każdym transferze zapisuj wiek much i liczbę martwych much.
UWAGA: liczba ocalałych much jest automatycznie obliczana w arkuszu kalkulacyjnym, ale zaleca się sprawdzenie tego wizualnie. Muchy, które przypadkowo uciekają lub umierają podczas przenoszenia, nie powinny być brane pod uwagę. Uważaj, aby nie liczyć dwa razy martwych much przeniesionych do nowej fiolki, zgłaszając tę notatkę w arkuszu kalkulacyjnym.
- Powtarzaj kroki 4.8 i 4.8.1, aż wszystkie muchy umrą.
- Dla każdej grupy badanej należy utworzyć krzywą przeżycia, jak pokazano w Rysunek 1, aby wyświetlić prawdopodobieństwo przeżycia muchy w danym momencie.
- Wykonaj trzy niezależne eksperymenty dla każdej grupy badanych much, używając 100 nowo zamkniętych much do każdego eksperymentu.
- Przygotuj tabelę, w której podasz średnią długość życia (średnią liczbę dni przeżycia wszystkich much dla każdej grupy), czas połowicznego zgonu (okres w dniach wymagany do osiągnięcia 50% śmiertelności) i maksymalną długość życia (maksymalna liczba dni potrzebna do osiągnięcia 90% śmiertelności).
- Obliczyć różnice procentowe między każdą grupą badaną w stosunku do grupy kontrolnej.
- Wykonaj analizę statystyczną w celu porównania różnych grup leczenia.
