$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem Castells-Nobau et al., Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).
1. Wymagania przed przetwarzaniem obrazu
- Wykonaj preparaty Drosophila z otwartej książki larw wędrujących w trzecim stadium rozwojowym (L3), jak opisano wcześniej.
- Ko-immunoznakowane terminale Drosophila NMJ przy użyciu kombinacji dwóch markerów: Dlg-1 lub Hrp wraz z Brp do analizy za pomocą "Drosophila NMJ Morphometrics" oraz Syt lub Csp razem z Brp do analizy za pomocą "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
UWAGA: Przeciwciała tego samego gatunku można łączyć poprzez wstępne znakowanie jednego z nich za pomocą zestawu do koniugacji przeciwciał, takiego jak zestawy do znakowania Zenon Alexa.
- Obrazuj terminale NMJ za pomocą wybranego mikroskopu, np. fluorescencji (z lub bez ApoTome) lub mikroskopii konfokalnej.
- Uzyskaj 2-kanałowy stos obrazów terminala NMJ.
- Dostosuj ustawienia mikroskopu w taki sposób, aby kanał 1 uzyskał terminal NMJ znakowany immunologicznie Dlg-1 (lub Hrp, Syt, Csp), a kanał 2 terminal NMJ znakowany immunologicznie Brp.
- Opcjonalnie analizuj jednokanałowe obrazy (synaps znakowanych immunologicznie pojedynczym przeciwciałem) za pomocą makr. Obraz NMJ znakowane immunologicznie jednoznacznie za pomocą Dlg-1 lub Hrp do analizy za pomocą "Drosophila NMJ Morphometrics" lub Syt lub Csp dla "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
UWAGA: Nie jest możliwa analiza synaps wybarwionych immunologicznie tylko anty-Brp.
- Uzyskane obrazy można eksportować jako pojedyncze pliki .tiff. Odwróć kolejność kanałów przed uruchomieniem makr, jeśli nie zostały pobrane zgodnie ze wskazaniami.
2. Wymagania dotyczące oprogramowania i instalacja
- Pobierz makra: "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" z następującej strony internetowej: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
- Przesuń kursor do folderu "Aktualizacja makr 1" i kliknij pojawiającą się opcję "widok". Pojawi się lista z zawartością tego folderu. Folder zawiera makra "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
UWAGA: Oba makra są zgodne z Fidżi w wersji 1.4, która również znajduje się w tym samym folderze. Makra mogą nie działać w najnowszych wersjach. Skorzystaj z dostarczonej wersji 1.4. Uruchomienie tej wersji jest bezproblemowe, nawet na komputerach z dostępną nowszą wersją Fidżi.
- Kliknij "Pobierz wszystko". Zawartość folderu zostanie pobrana na komputer jako plik .zip. Rozpakuj pobrany plik.
- Skopiuj pliki Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm i Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm do Fiji.app/plugins/ katalogu. Po ponownym uruchomieniu programu makra pojawią się na dole menu rozwijanego Wtyczki.
3. Uruchom makro podrzędne "Konwertuj na stos", aby utworzyć projekcje Z i hiperstosy obrazów NMJ
- Uruchom interfejs graficzny, wybierając Wtyczki na pasku narzędzi i wybierz "Drosophila NMJ Morphometrics" z menu rozwijanego.
- Zdefiniuj ustawienie "Unikalny ciąg pliku" w interfejsie graficznym makra.
UWAGA: Oprogramowanie mikroskopu wykorzystuje sygnaturę identyfikacyjną do organizowania płaszczyzn i kanałów podczas przechowywania stosów jako indywidualnych plików ".tiff". Wprowadzone unikalne ustawienie ciągu pliku musi określać sygnaturę przypisaną przez oprogramowanie do pierwszej płaszczyzny pierwszego kanału (ważne: należy wskazać najniższą płaszczyznę i numer kanału).
- Wybierz tylko makro podrzędne "Konwertuj na stos" i kliknij "ok" i wybierz folder, w którym znajdują się obrazy. Jeśli wybrany jest katalog główny z kilkoma podfolderami, przetwarzane będą wszystkie pojedyncze pliki '.tiff w głównym katalogu i podfolderze spełniające kryteria unikalnego ciągu pliku.
- Jeśli stos z zawiera tylko jeden kanał, zaznacz pole "Tylko kanał 1".
- Zwróć uwagę, że pojawią się dwa nowe pliki na obraz NMJ, domyślnie określane jako stack_image_name i flatstack_image_name. Przechowuj tylko te stosy i płaskie stosy do dalszej analizy. W tym momencie można usunąć .tiff serie plików, minimalizując wymaganą pojemność pamięci masowej i unikając potencjalnych źródeł błędów.
4. Uruchom makro podrzędne "Zdefiniuj ROI", aby wyznaczyć terminal NMJ będący przedmiotem zainteresowania
- Uruchom interfejs graficzny "Drosophila NMJ Morphometrics".
- Zaznacz tylko pole wyboru "Zdefiniuj ROI" i naciśnij "OK" i wybierz główny katalog, w którym przechowywane są obrazy zatytułowane flatstack_name i naciśnij "Wybierz". Podmakro "Zdefiniuj ROI" automatycznie przeszukuje wszystkie podfoldery w wybranym katalogu głównym.
- Gdy otworzy się pierwsza projekcja, wybierz narzędzie "Zaznaczanie odręczne" na pasku narzędzi.
- Za pomocą myszy narysuj zaznaczenie, które zawiera wyłącznie cały terminal NMJ, który Cię interesuje i kliknij "OK" w oknie "Zdefiniuj terminal". Makro przejdzie do następnej projekcji.
- Nakreśl następny zwrot z inwestycji i powtarzaj tę czynność, aż wszystkie zwroty akcji zostaną zdefiniowane. Plik obrazu ROI o nazwie "roi_image_name" będzie przechowywany w tym samym katalogu, co wcześniej wygenerowane obrazy stosu i projekcji dla każdego z przetworzonych obrazów. Wynikiem tego submakro jest binarny obraz ROI w kolorze białym na czarnym tle.
5. Uruchom makro podrzędne "Analizuj", aby określić ilościowo cechy terminala NMJ
- Przejdź do paska narzędzi, wybierz "Wtyczki" i użyj:
"Drosophila_NMJ_Morphometrics" podczas analizy synaps znakowanych immunologicznie anty-Dlg-1 lub anty-Hrp (kanał 1) razem z anty-Brp (kanał 2) lub "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" podczas analizy synaps znakowanych immunologicznie anty-Syt lub anty-Csp (kanał 1) razem z Brp (kanał 2).
- Gdy mają być analizowane stosy obrazów jednokanałowych (kanał strukturalny Dlg-1 lub HRP dla "Drosophila_NMJ_Morphometrics" lub Syt lub Csp dla "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics), zaznacz pole "Tylko kanał 1".
- Dostosuj skalę odpowiadającą obrazom, które mają być analizowane.
- Jeśli jeden piksel na obrazie odpowiada 2,5 μm, wskaż Scale-Pixels = 1, Scale-Distance w μm = 2,5. W przypadku, gdy oba ustawienia pozostaną na 0, obszar NMJ, obwód, długość i najdłuższa długość gałęzi zostaną wyrażone w liczbie pikseli.
- W razie potrzeby dostosuj domyślne ustawienia analizy makra. Regulacje należy wykonywać tylko wtedy, gdy makro podrzędne "Analizuj" zostało wcześniej uruchomione z niezadowalającymi wynikami (patrz koniec tej sekcji i sekcja 6, aby uzyskać instrukcje dotyczące optymalizacji ustawień).
- Zaznacz pola wyboru "Analizuj" i "Czekaj" i naciśnij "OK".
- Zaznacz pole wyboru "Czekaj" podczas uruchamiania makra podrzędnego "Analizuj" na obrazach 2 kanałów. W przeciwnym razie mogą wystąpić błędy w zliczaniu aktywnych stref ze względu na ograniczoną pojemność komputera.
- Gdy otworzy się nowe okno "Wybierz katalog", wybierz katalog, w którym znajdują się obrazy i naciśnij "wybierz". Makro przeanalizuje wszystkie obrazy przechowywane w katalogu głównym oraz, w stosownych przypadkach, w kolejnych folderach (przy użyciu trzech plików z wykonania poprzednich makr podrzędnych: stack_image_name, flatstack_image_name i roi_image_name). Makro przetwarza każdy obraz indywidualnie i po kolei. Może to potrwać kilka minut na stos obrazów (w zależności od pojemności komputera).
- Po uruchomieniu makra należy pamiętać, że nowy plik obrazu o nazwie res_image_name dla każdej analizowanej synapsy przechowywanej zostanie utworzony w folderze nadrzędnym. Pomiary ilościowe zostaną zapisane jako plik "results.txt".
- Sprawdź wszystkie obrazy wynikowe, aby wykryć i wykluczyć obrazy z błędami segmentacji. Możliwe błędy segmentacji opisano w tabeli 1 wraz z poradami, jak dostosować ustawienia, aby obejść te błędy. Obrazy wynikowe z takimi błędami segmentacji są podane jako przykłady w Rysunek 1.
UWAGA: Podczas uruchamiania makra z ustawieniami domyślnymi zaobserwowanymi w interfejsie użytkownika dokładność wynosiła około 95%, gdy ocena makr została porównana z oceną ręczną.
6. Dostosuj ustawienia makr do obrazów
- Jeśli więcej niż 5% obrazów wykazuje błędy segmentacji, zapoznaj się z różnymi algorytmami, aby zdefiniować/wybrać najbardziej odpowiednie ustawienia makr dla obrazów.
- Dostosuj wartość promienia toczącej się kulki
UWAGA: Funkcja promienia toczącej się kuli odejmuje tło obrazu. Funkcja ta ma kluczowe znaczenie podczas pracy z obrazami uzyskanymi za pomocą mikroskopów fluorescencyjnych i/lub gdy obrazy mają wysoki poziom szumów tła. Odjęcie tła pomoże krokom automatycznego progowania makra w uzyskaniu odpowiedniej segmentacji terminali NMJ.
- Wybierz trzy obrazy NMJ stack_image_name wygenerowane przez makro podrzędne "Konwertuj na stos". Wybierz obrazy, które są reprezentatywne dla zestawu danych obrazu.
- Na pasku narzędzi wybierz opcję Obraz | Kolor | Podziel kanały. Zostaną utworzone dwa stosy obrazów, jeden reprezentujący odpowiednio kanał 1, a drugi kanał 2, i zostaną one zapisane.
- Otwórz stos obrazów należący do otwartego kanału 1, odpowiadający immunoznakowaniu Dlg-1, Hrp, Syt lub Csp.
- Uruchom filtr "Odejmij tło", wybierając "Proces" na pasku narzędzi, a następnie "Odejmij tło..." z menu rozwijanego.
- Kliknij pole wyboru podglądu w wyskakującym oknie i dostosuj promień toczącej się kuli do wartości najbardziej odpowiedniej dla obrazów. Ustawienie "Promień toczącej się kuli" powinno być dostosowane do wartości zwiększających kontrast między synapsą a tłem (patrz Rysunek 2A').
- Zobacz Rysunek 2 dla przykładu. W panelu A części synapsy wykazują te same poziomy szarości co tło, podczas gdy w Rysunek 2 panel A' "Promień toczącej się kuli" wynoszący 500 powoduje silny kontrast między synapsą a tłem.
- Utwórz projekcję z, wybierając na pasku narzędzi Obraz | Stos| Projekcja Z, wybierz Typ projekcji = Maksymalna intensywność i zapisz wynikowy obraz. Po zdefiniowaniu odpowiedniej wartości promienia toczącej się kuli uruchom algorytm "Odejmij tło" na pozostałych reprezentatywnych obrazach o tej samej wartości promienia toczącej się kuli. Utwórz projekcje Z i zapisz je (w dowolnym katalogu).
UWAGA: Wartość promienia toczącej się kuli dla obrazów 8-bitowych lub RGB powinna być co najmniej tak duża, jak promień największego obiektu na obrazie, który nie jest częścią tła. W przypadku obrazów 16-bitowych i 32-bitowych promień powinien być odwrotnie proporcjonalny do zakresu wartości pikseli.
- Określ różne progi automatyczne, które będą używane
- Otwórz projekcje Z zapisane w poprzednim kroku (6.2.6) i wybierz Obraz | Dostosuj | Funkcja AutoThreshold | Wypróbuj wszystkie.
- Ponieważ binarny obraz wynikowy z progiem pojawi się z różnymi algorytmami automatycznego progu, określ najbardziej odpowiedni algorytm dla obrazów.
- Podczas późniejszego uruchamiania makra należy odpowiednio zmienić próg w ustawieniach makra.
- Użyj bardziej restrykcyjnych progów, takich jak "RenyiEntrophy" lub "Moments" jako progu konspektu NMJ i bardziej liberalnych progów, takich jak "Li" do określenia szkieletu NMJ i "Huang" do określenia stref aktywnych. Gdy obrazy są bardzo ostre z niewielką ilością tła lub bez niego, użyj "Huang" jako "progu konturu NMJ". W przeciwnym razie po segmentacji obrazu może brakować części synapsy.
- Zobacz Rysunek 2B dla przykładu. Odpowiednią segmentację synapsy uzyskuje się za pomocą autoprogów podświetlonych zielonymi polami. Niektóre przykłady nieodpowiednich progów są wyróżnione czerwonymi ramkami (sprawdź synapsy przy dużym powiększeniu). W tym drugim przypadku albo brakuje części synapsy, albo zawarte są części tła.
- Określ maksymalny rozmiar małych cząstek
UWAGA: Ta funkcja wykluczy z analizy wszystkie cząstki wykryte przez próg konturu NMJ i próg szkieletu, które są mniejsze niż zdefiniowana wartość w "ustawieniu małych cząstek". Wartość ta jest definiowana w pikselach. Ta funkcja służy jako filtr szumów i jest bardzo przydatna, gdy w uzyskanych obrazach występują duże ilości niejednorodnego tła (takiego jak kryształy/kurz).
- Otwórz projekcje Z zapisane w kroku 6.2.6. i ustaw skalę tak, aby wykrywała liczbę pikseli za pomocą opcji Analizuj | Ustaw skalę. Zastosuj następujące ustawienia: odległość w pikselach = 1, znana odległość = 1, proporcje pikseli = 1, Jednostka długości = piksel i naciśnij "OK". Kliknij narzędzie "Owalne zaznaczenie" na pasku narzędzi.
- Za pomocą myszy narysuj zaznaczenie ściśle otaczające pojedyncze cząstki, które są obecne w barwieniu immunologicznym, ale nie należą do NMJ. Naciśnij Ctrl+m dla użytkownika systemu Windows lub cmd+m dla użytkowników komputerów Mac. Otworzy się okno wyników, wskazujące obszar cząstek wybranych w liczbie pikseli.
- Powtórz poprzedni krok kilka razy z kilkoma artefaktami obecnymi na obrazach, aby określić największy obszar zanieczyszczającej cząstki/artefaktu. Będzie to wartość, którą należy ustawić w ustawieniu podczas późniejszego uruchamiania makra. Podczas uruchamiania makra ustaw "Rozmiar małych cząstek" jako najmniejszy rozmiar cząstek, obserwowany ropa margines 25%.
- Zobacz przykład Rysunek 2D. Największy wykryty kryształ ma powierzchnię 112 pikseli. Ustawienie "Rozmiar małych cząstek" podczas przetwarzania tego obrazu za pomocą makra powinno być ustawione na 125 - 150.
- Określ minimalny rozmiar butonu
UWAGA: Ta funkcja wykluczy z analizy wszystkie butony wykryte przez próg konturu NMJ, które są mniejsze niż zdefiniowana wartość. Wartość ta jest definiowana w pikselach.
- Wykonaj te same kroki, jak opisano w sekcji 6.4, ale w tym przypadku narysuj zaznaczenie otaczające najmniejsze butony obecne w terminalu NMJ. Wybierz najmniejszy obszar odpowiadający najmniejszemu z mierzonych obszarów. Jest to wartość, którą należy ustawić w ustawieniu minimalnego rozmiaru butonu podczas późniejszego uruchamiania makra.
- Określ wartość "Maksymalna tolerancja hałasu"
- Aby zdefiniować wartość "Znajdź maksymalną tolerancję szumu" dla makra, otwórz kanał 2 Z-stack zapisany w sekcji 6.2.2.
- Przejdź do zakładki wtyczki w menu podręcznym, wybierz Proces | Maksimum (3D), a gdy pojawi się maximum_image_name (co może potrwać kilka minut), zamknij oryginalny stos obrazów.
- Wybierz Maximum..._image_name (nowo uzyskany stos obrazów) i wybierz Wtyczki | Proces | Minimum (3D), gdy pojawi się nowy obraz Minimum Maximum..._image_name zamknij stos Maksimum... _image_name.
- Na pasku narzędzi wybierz pozycję Proces | Znajdź maksima.... Otworzy się nowe okno "Znajdź maksima...". Zaznacz pole wyboru "Podgląd wyboru punktu..." i wypełnij pole "Tolerancja hałasu" domyślnym ustawieniem makra 50. Punkty maksimów zostaną wskazane na obrazie jako małe krzyżyki.
- Zwiększ wartość "Tolerancja szumu" w przypadku zaobserwowania nadmiaru stref aktywnych z adnotacjami, tj. krzyżyków, które nie znajdują się nad aktywnymi strefami, które nie są ostre na wybranej płaszczyźnie stosu, lub fałszywych stref aktywnych, które są wykrywane w tle.
- Z drugiej strony, w przypadku obserwacji niekompletnie opisanych stref aktywnych, tj. nierozpoznania aktywnych stref w ostrości, należy zmniejszyć wartość "Maksymalna tolerancja szumu". Kontynuuj wypróbowywanie różnych wartości, postępując zgodnie z tą procedurą, aż krzyżyki odpowiednio oznaczą aktywne strefy w ostrości. Wypełnij pole "Znajdź maksymalną tolerancję hałasu" tą wartością.
- Zobacz przykład Rysunek 2C. Wykryto zbyt wiele aktywnych stref. W Rysunek 2C' tylko aktywne strefy w centrum uwagi są wykrywane podczas zwiększania wartości "Maksymalna tolerancja hałasu".
- Uruchom makro podrzędne "Analizuj" dla reprezentatywnych obrazów wybranych w kroku 5.1 z ustawieniami zdefiniowanymi we wszystkich poprzednich krokach.
- Dostosuj dolny i górny próg Brp-puncta
- Zwróć uwagę, że po uruchomieniu makra zgodnie z krokiem 6.6 pojawi się nowy plik o nazwie 2_active_zone_stack_image_name. W tym stosie obrazów aktywne strefy wykryte przez funkcję "Znajdź maksima" są oznaczone białymi kropkami w każdej płaszczyźnie.
- Otwórz ten plik, przeciągając go i upuszczając na pasek narzędzi i wybierz Obraz | Stos | Projekt Z | Typ projekcji = Suma wycinków. Uzyskany zostanie rzut 2_active_zone_stack_image_name.
- Wybierz punkt menu Obraz | Dostosuj | Próg. Otworzy się nowe okno "Próg". Przesuń górny pasek, aby wybrać wartość progową, w której wszystkie pożądane ogniska/Brp-dodatnie punkty są wizualizowane na czerwono.
UWAGA: Jeśli próg zostanie ustawiony zbyt nisko, zostanie zliczony nadmiar aktywnych stref. Jeśli zostanie ustawiona zbyt wysoko, część aktywnych stref zostanie pominięta.
- Zobacz przykład Rysunek 2E. Gdy próg jest ustawiony na 400, większość aktywnych stref (symbolizowanych jako ogniska 1 piksela) nie jest uwzględniana w segmentacji, ponieważ nie są one podświetlone na czerwono (Rysunek 2E). Gdy próg jest ustawiony na wartość 50, wszystkie aktywne strefy są podświetlone na czerwono (Rysunek 2E').
- Zdefiniuj tę wartość jako minimalny próg. Pozostaw "Górny próg punktowy" na wartości maksymalnej.
- Uruchom ponownie makro podrzędne "Analizuj" dla reprezentatywnych obrazów z ustawieniami zdefiniowanymi we wszystkich poprzednich krokach tej sekcji. Krytycznie oceń wynikowe pliki graficzne i upewnij się, że segmentacja została wykonana prawidłowo. Jeśli tak nie jest, dostosuj ustawienia zgodnie z naturą błędów segmentacji (Rysunek 1, Tabela 1).
