$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest zaczerpnięty z Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).
1. Projektowanie MB do obrazowania żywych komórek
- Złóż docelową sekwencję RNA, aby przewidzieć drugorzędową strukturę celu mRNA za pomocą "formy RNA" z serwera mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
- Wklej/prześlij sekwencję docelową w formacie FIPSA, wybierz 5 lub 10% podoptymalności (struktury o swobodnej energii składania w granicach odpowiednio 5 lub 10% wartości MFE) i odpowiednio dostosuj maksymalną liczbę obliczanych zagięć (np. większą dla 10% nieoptymalnej atrybucy).
UWAGA: Włączenie suboptymalnych struktur drugorzędowych podczas projektowania MB pozwala na identyfikację regionów w docelowym mRNA, które mogą być bardziej elastyczne lub sztywniejsze niż przewidywano dla samej struktury minimalnej energii swobodnej (MFE), co poprawia ogólny projekt MB nadających się do obrazowania żywych komórek.
- Wybierz "zadanie natychmiastowe" dla celów mRNA zawierających 800 nukleotydów (nt) lub "zadanie wsadowe" dla długości mRNA od 801 do 8,000 nt. Zapisz plik "ss-count" jako prosty plik tekstowy.
- Użyj pliku "ss-count" uzyskanego w kroku 1.1 jako danych wejściowych dla programu PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) z żądanymi parametrami, aby zaprojektować kilka MB dla celu mRNA (zobacz samouczki opisujące użycie programu PinMol pod adresem https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ ).
- Określ swoistość wybranych MB, wykonując analizę BLAST: użyj "blastn" z odpowiednią bazą danych (np. dla MB specyficznych dla mRNA oskara użyj bazy danych "refseq-rna" i organizmu Drosophila melanogaster).
- Zidentyfikuj dowolną specyficzną tkankowo ekspresję docelowego mRNA (np. dla oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray lub modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) i porównaj z dowolnymi pozytywnymi trafieniami BLAST. Wyeliminuj sondy, które wykazują >50% homologii krzyżowej z innymi mRNA, które również ulegają ekspresji w tkance/komórce będącej przedmiotem zainteresowania.
- Wybierz parę fluoroforu i wygaszacza odpowiednią dla dostępnego zestawu mikroskopowego do obrazowania żywych komórek (np. Cy5/BHQ2).
2. Synteza, oczyszczanie i charakterystyka MB
- Skorzystaj z wewnętrznej syntezy i oczyszczania, jak opisano wcześniej w Bratu, Methods in Molecular Biology (2006) lub usług od dostawców komercyjnych, aby zsyntetyzować i oczyścić od jednego do pięciu MB (patrz powyższa uwaga), stosując następujący schemat etykietowania: [5'(Fluorofor)-(C3 lub C6 linker)-(sekwencja 2'-O-metylo MB)-(Quencher)3']. Oczyszczanie MB za pomocą HPLC z odwróconą fazą, we własnym zakresie lub korzystając z usług komercyjnego dostawcy.
UWAGA: Fosforamidyty stosowane do automatycznej syntezy sondy muszą mieć modyfikację rybonukleotydu 2'-O-metylowego. Można również wykorzystać chimery naprzemiennych modyfikacji zablokowanego kwasu nukleinowego (LNA) i 2'-O-metylu w celu zwiększenia stabilności hybrydy między krótszym MB a jej docelowym mRNA.
- Zsyntetyzuj oligonukleotydy DNA, które pasują do sekwencji docelowego regionu RNA, a zatem są komplementarne do regionu sondy MB, do wykorzystania w charakterystyce in vitro (patrz kroki od 2.3 do 2.5; powyższa uwaga). Zmaksymalizuj hybrydyzację MB z naśladowcą docelowego oligonukleotydu DNA, umieszczając na każdym końcu celu DNA cztery dodatkowe nukleotydy, jak stwierdzono w docelowej sekwencji mRNA.
UWAGA: Bardziej rygorystyczną charakterystykę skuteczności MB w wykrywaniu docelowej sekwencji można przeprowadzić przy użyciu zsyntetyzowanych in vitro celów RNA zamiast komplementarnych oligonukleotydów DNA.
- Przeprowadzić denaturację termiczną samego MB, zmierzyć jego temperaturę topnienia (Tm) i potwierdzić, że MB przyjmuje pożądany kształt spinki do włosów w temperaturze fizjologicznej. Zaobserwowaliśmy wartości Tm w zakresie od 60 do 90 °C.
- Przeprowadzić termiczną denaturację MB w obecności celu oligonukleotydu DNA i zmierzyć Tm hybrydy docelowej MB:DNA, jak opisano wcześniej w Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Dla hybrydy MB:DNA pożądana jest temperatura Tm między 55 a 60 °C.
- Przeprowadź reakcje hybrydyzacji in vitro z odpowiednim celem oligonukleotydowym DNA i określ skuteczność tworzenia hybrydy MB:DNA w temperaturze fizjologicznej, jak opisano wcześniej w Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Pożądana jest szybka kinetyka hybrydyzacji z naśladownictwem docelowego DNA, jednak MB, które nie wykazują wysokiej skuteczności hybrydyzacji z celami DNA, mogą mieć lepszą wydajność z docelowym mRNA in vitro i / lub in vivo.
3. Preparacja i przygotowanie indywidualnych komór na jajka do mikroiniekcji
- Karm nowo wyklute, kryte samice przez 2-3 dni świeżą pastą drożdżową.
- Znieczulij muchy na podkładce CO2 i za pomocą cienkiej pęsety (Dumont #5) przenieś 1-2 samice do kropli oleju Halocarbon 700 na szklanym szkiełku nakrywkowym.
- Za pomocą pęsety zorientuj muchę grzbietową stroną do góry pod mikroskopem stereoskopowym. Wypreparuj żeński brzuch, wykonując małe nacięcie na tylnym końcu i delikatnie ściśnij parę jajników w oleju.
- Umieść jajniki na kropli oleju na nowym szkiełku nakrywkowym. Delikatnie przytrzymaj jeden jajnik jedną pęsetą, jednocześnie ściskając najmłodsze stadia jajnika drugą pęsetą. mRNA oskara jest aktywnie zlokalizowane w połowie oogenezy i po niej (etapy > 7), a młodsze komory jajowe (etapy < 7) są trudniejsze do wstrzyknięcia i nie przeżywają tak długo. Powoli przeciągnij szkiełko nakrywkowe (ruchem w dół), aż poszczególne jajniki lub komory jajowe zostaną odizolowane i wyrównane w pionie. Następnie oddziel komory pojedynczego jaja, przesuwając niepożądane etapy z łańcucha jajowego jajnika.
UWAGA: Upewnij się, że indywidualnie drażnione komory na jajka nie unoszą się w oleju i przylegają do szkiełka nakrywkowego. Jest to ważne zarówno dla udanej mikroiniekcji, jak i akwizycji obrazu.
4. Mikroiniekcja MB do komórek pielęgniarskich komór jajowych
- Przygotuj roztwór MB, używając jednej latarni molekularnej (np. osk2216Cy5) lub mieszanki dwóch MB, które celują w różne mRNA i które są znakowane spektralnie różnymi fluoroforami (np. osk2216Cy5 i drongo1111Cy3). Użyj stężenia 200-300 ng/μL na każdy MB w HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 i 100 mM NaCl). Dla koktajlu czterech MB znakowanych tym samym fluoroforem, które są ukierunkowane na ten sam mRNA w ilości 200 ng/μL każdy w HybBuffer (np. osk82, osk1236, osk2216). Odkręcić roztwór MB bezpośrednio przed załadowaniem igły do mikrowstrzyknięcia.
- Wybierz cel. Obiektyw z olejkiem 40x jest zalecany do znalezienia odpowiedniej komory na jajka i wykonania mikroiniekcji.
- Zamontuj szkiełko nakrywkowe z wypreparowaną komorą na jaja na stoliku mikroskopu. Ustawić obiektyw w pozycji ostrości i zidentyfikować komorę jajową w średnim lub późnym stadium rozwoju, która jest odpowiednio zorientowana do mikroiniekcji (tj. z osią AàP prostopadłą do końcówki igły, aby umożliwić łatwe wstrzyknięcie w komórkę pielęgniarską proksymalnie do oocytu).
- Załadować igłę (dostępną w handlu lub przygotowaną we własnym zakresie) roztworem ~1 μL MB (patrz krok 1.1) i podłączyć ją do mikrowtryskiwacza. W przypadku mikroiniekcji w komorach jajowych D. melanogaster należy ustawić igłę (patrz tabela materiałów) pod kątem <45° do stolika mikroskopu (np. 30°), aby uniknąć przebicia kilku komórek pielęgniarskich.
- Ustawić wtryskiwacz z ciśnieniem wtrysku 500-1 000 hPa i ciśnieniem kompensacyjnym 100-250 hPa (patrz tabela materiałów).
- Powoli przesuwaj stolik, aby wprowadzić w pole widzenia obszar kropli oleju pozbawiony komór na jajka.
- Za pomocą joysticka mikromanipulatora delikatnie opuść igłę do kropli oleju i ustaw jej końcówkę w kierunku obrzeży pola widzenia.
- Wykonać funkcję "czyszczenia", aby usunąć powietrze z końcówki igły i upewnić się, że jest przepływ z igły.
- Ustaw igłę w pozycji wyjściowej i skup się na komorze na jaja, która ma być mikrowstrzyknięta, a następnie ustaw igłę z powrotem w ostrości i umieść ją w pobliżu krawędzi komory na jaja.
- Wykonaj precyzyjną regulację położenia Z obiektywu, tak aby błona oddzielająca komórki pęcherzykowe od komórek pielęgniarskich była ostra.
- Wprowadzić igłę do komórki pielęgniarskiej i wykonywać wstrzyknięcie przez 2-5 sekund.
- Delikatnie wyjąć igłę i cofnąć ją do pozycji wyjściowej.
- Zmień obiektyw na żądane powiększenie do akwizycji obrazu (60-63x lub 100x), ustaw ostrość na komorze jaja i rozpocznij akwizycję.