Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu: metoda identyfikacji mutantów generowanych przez CRISPR u Drosophila

Abstract

Źródło: Du, L., et al. Skuteczna strategia generowania specyficznych dla tkanek binarnych systemów transkrypcyjnych u Drosophila poprzez edycję genomu. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje metodę przesiewową w celu identyfikacji transgenicznych muszek Drosophila, których genom został zmodyfikowany za pomocą CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 to potężne narzędzie do edycji genomu, które zrewolucjonizowało sposób, w jaki naukowcy mogą manipulować genomem organizmu. W przykładowym protokole zobaczymy, jak zidentyfikować mutanty generowane przez CRISPR, w których insercja sekwencji transaktywacyjnej zastępuje pierwszy ekson genu bezgałęziowego (bnl), tworząc w ten sposób linię napędową specyficzną dla genu bln, bnl-LexA.

Protocol

Ten protokół jest fragmentem Du et al., An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).

1. Genetyka much i badania przesiewowe (Rysunek 1 i Rysunek 2)

1. Kiedy wstrzyknięte zarodki rozwiną się w dorosłe osobniki, skrzyżuj każdą pojedynczą muchę G₀ z muchami równoważącymi. Należy wybrać odpowiedni równoważnik dla chromosomu zawierającego docelowy allel.
2. Znieczulij potomstwo F1 z każdej krzyżówki G0 na podkładce CO₂ i losowo wybierz 10-20 samców pod mikroskopem stereoskopowym. Skrzyżuj je pojedynczo z samicami balansera, jak pokazano na Rysunek 2.
3. Kiedy wykluwają się larwy F2, wybierz pojedynczego ojca F1 z każdej krzyżówki i wyekstrahuj gDNA za pomocą protokołu przygotowania genomowego DNA pojedynczej muchy:
   1. Przygotuj bufor do ekstrakcji gDNA: 10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotować 20 mg/ml roztworu podstawowego proteinazy K i przechowywać w zamrażarce.
   2. Umieść każdą muchę w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i oznacz probówkę. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez noc.
   3. Przygotować świeżą objętość roboczą buforu do ekstrakcji gDNA zawierającego 200 μg/ml końcowego stężenia proteinazy K.
      Uwaga: Na tym etapie nie używaj starego bufora.
   4. Zgniataj każdą muchę przez 10–15 s za pomocą końcówki pipety zawierającej 50 μl buforu do zgniatania bez dozowania płynu. Wlej pozostały bufor do probówki i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20–30 minut.
   5. Umieścić probówki w bloku grzewczym o temperaturze 95 °C na 1-2 minuty, aby dezaktywować proteinazę K.
   6. Wiruj przez 5 minut przy 10 000 x g. Przechowywać preparat w temperaturze 4 °C do dalszej analizy PCR.
4. Użyj tej samej metody do przygotowania gDNA z muchy nos-Cas9, która służy jako kontrola negatywna. Wykonaj trzyetapowe badania przesiewowe oparte na PCR, aby zidentyfikować prawidłowe "końce na końcu" HDR ( Rysunek 1, Rysunek 3) przy użyciu gDNA każdego mężczyzny F1 jako matrycy⁵. Użyj 1 μl preparatu DNA w następującym systemie reakcyjnym PCR: 10 μl 2x PCR Master Mix z barwnikiem, 1 μl każdego startera (10 μM), 1 μl matrycy DNA i 7 μl ddH₂O.
5. Jak pokazano w Rysunek 3A, wykonaj PCR przy użyciu starterów fwd1 i rev1, aby sprawdzić, czy doszło do insercji lub wymiany; wykonaj PCR przy użyciu starterów fwd2 i rev2, aby zweryfikować wstawienie lub zamianę z regionu 3'; wykonaj PCR przy użyciu starterów M13F i rev3, aby sprawdzić "koniec" HDR (Tabela 1C).
6. Utrzymuj linki muchowe z potwierdzonym HDR na końcu i ustal zrównoważone zapasy od generacji F2. Krzyżowanie z balanserem leci ponownie, aby usunąć wszelkie niezamierzone mutacje na innych chromosomach.

Results

Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy w edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu wygenerowania binarnego systemu transkrypcji. Wskazany jest przybliżony czas trwania wymagany dla każdego etapu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	Zobacz materiał T3253	biologia molekularna
Edta	Sigma Aldrich	E1161	biologia molekularna
Zawartość NaCl	Sigma Aldrich	Zobacz materiał S7653	biologia molekularna
Ultraczysta woda wolna od DNaz/RNaz	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 10977-023	biologia molekularna
Podkłady	IDT-DNA (Identyfikator DNA)		Metoda PCR
Proteinaza K	ThermoFisher Naukowy	25530049	biologia molekularna
2x PCR PreMix, z barwnikiem (czerwony)	Sydlab powiedział:	MB067-EQ2R	biologia molekularna
MKRS/TB6B	Laboratorium Kornberga		Linia muchowa
Stacja CO2	Genesee Scientific	59-122WCU	pchanie muchy
Mikroskop stereoskopowy	Olympus	SZ-61	pchanie muchy
Tłuczki homogenizujące do mikroprobówek	Fisher-Scientific	Numer katalogowy: 03-421-217	Izolacja genomowego DNA