$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem z Koon et al., Przygotowanie organizmów prokariotycznych i eukariotycznych przy użyciu chemicznego suszenia do analizy morfologicznej w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), J. Vis. Exp.(2019).
1. Przygotowanie i utrwalenie
- Przygotuj Drosophila melanogaster (muszka owocowa).
- Znieczulenie dorosłych much za pomocą 100% dwutlenku węgla. Umieść znieczulone dorosłe osoby (około 10 do 30 much) w małej plastikowej fiolce z zakrętką lub probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Zanurzyć znieczulone muchy w 1 ml utrwalacza (1,25% aldehydu glutarowego, 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,2) na 2 godziny (lub na noc) w temperaturze 4 °C. Jeśli muchy wypłyną na powierzchnię utrwalacza, dodaj kilka kropli 2,5% eteru tert-oktylofenylowego glikolu polietylenowego, aby osłabić napięcie powierzchniowe utrwalacza, umożliwiając całkowite zanurzenie tkanki. Usunąć utrwalacz za pomocą szklanej pipety.
2. Mycie i odwodnienie
- Umyj i odwodnij Drosophila melanogaster (muszka owocowa).
- Przemyć utrwaloną próbkę trzykrotnie 1 ml 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,2 w temperaturze pokojowej przez 10 minut w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Każde pranie należy usuwać szklaną pipetą, uważając, aby nie usunąć much.
- Odwodnić próbkę za pomocą serii stopniowanych etanoli przez 10 minut w objętości 1 ml w probówce do mikrofuge. Stężenia etanolu wynoszą: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Usuń etanol szklaną pipetą, uważając, aby nie usunąć much.
- Przechowywać próbkę w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z wystarczającą ilością 100% etanolu, aby pokryć próbkę przed suszeniem.
3. Suszenie
- Przeprowadzić suszenie chemiczne przy użyciu heksametylodilazanu (HMDS).
- Zastąp 100% roztwór etanolu roztworem HMDS i 100% etanolu w proporcji 1:2 przez 20 min. Zastąp roztwór 1:2 roztworem HMDS i 100% etanolu w proporcji 2:1 na 20 min. Zastąp roztwór 2:1 roztworem 100% HMDS na 20 min. Powtórz raz.
Uwaga: HMDS jest łatwopalny i jest ostrą toksyną (drogą skórną). Z HMDS należy obchodzić się pod wyciągiem chemicznym przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym rękawic, fartucha laboratoryjnego i ochrony oczu.
- Przenieść próbkę w HMDS, jeśli znajduje się w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, do jednorazowego aluminiowego naczynia wagowego. Po umieszczeniu w aluminiowym naczyniu wagowym wymień 100% gogle HMDS na tyle świeże, aby pokryć próbkę.
- Przenieść próbkę do plastikowego lub szklanego eksykatora bez próżni ze świeżym środkiem osuszającym (o głębokości 5-6 cm) i umieścić w dygestoriach chemicznych. Alternatywnie, umieść próbkę bezpośrednio w dygestoriach chemicznych do wyschnięcia z luźną pokrywką, taką jak pudełko, aby zapobiec spadaniu zanieczyszczeń na próbkę. Pozostawić próbkę do wyschnięcia na 12–24 godzin.
4. Montaż
- Mount Drosophila melanogaster (muszka owocowa).
- Oznacz dolną część aluminiowego króćca montażowego, aby wskazać, co jest umieszczane na górze.
Umieść wysuszone muchy w żądanej pozycji na kleju lub kleju węglowym przymocowanym do górnej części kikuta pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą precyzyjnej pęsety.
- Nałóż srebrny klej przewodzący, tj. srebrną farbę, wokół zewnętrznych krawędzi klocków. Połącz srebrną farbę z muchami za pomocą wykałaczki, aby zapewnić przewodność. Nie pozwól, aby farba dotknęła żądanego obszaru obrazowania.
- Umieść króćce w pudełku z uchwytem na króćce i umieść otwarte pudełko z uchwytem na króćce w eksykatorze. Pozostaw srebrną farbę do wyschnięcia na co najmniej 3 godziny lub na noc, aby uzyskać najlepsze rezultaty.